- Abstract
- Materiali e metodi
- Isolati parassitari
- Isolamento del DNA
- Sequenziamento parziale del DNA e analisi del gene SSU rRNA (small subunit ribosomal DNA)
- Analisi del DNA della regione ITS
- DNA automated sequencing
- Test di mobilità eteroduplex a doppio filamento di DNA
- Risultati
- Discussione
- Ringraziamenti
Abstract
Microsporidi sono intracellulari organismi eucarioti trovato in una vasta gamma di vertebrati e invertebrati padroni di casa. Encephalitozoon cuniculi si trova comunemente nei conigli domestici e roditori e si verifica anche nei cani, altri canidi e primati, compresi gli esseri umani. Il sequenziamento del DNA dei geni dell’RNA ribosomiale è stato utilizzato per identificare questi parassiti a livello di specie e per definire i ceppi I, II e III di E. cuniculi. Otto nuovi isolati di cane sono stati caratterizzati come ceppo III di E. cuniculi mediante l’uso di metodi molecolari. Questo ceppo è stato anche identificato in isolati da esseri umani immunocompromessi, suggerendo il potenziale zoonotico di questa specie di parassiti. È anche riportato un prolungato spargimento di spore microsporidiali da cani asintomatici.
Encephalitozoon cuniculi è un protozoo intracellulare obbligato del phylum Microspora ed è un parassita comune di conigli domestici e roditori. Occasionalmente questi parassiti sono stati segnalati in altri ospiti, tra cui cani, volpi blu (Alopex lagopus) e un piccolo numero di altri carnivori selvatici . Un numero crescente di segnalazioni descrive anche la malattia clinica nell’uomo causata da E. cuniculi, ma la fonte(e) di infezione umana è sconosciuta .
Storicamente, l’identità del parassita era basata su caratteristiche morfologiche e talvolta ultrastrutturali. Recentemente, membri morfologicamente simili del genere Encephalitozoon sono stati speciati mediante l’uso di caratteristiche immunologiche e caratterizzazione molecolare dei geni dell’RNA ribosomiale . Gli isolati di E. cuniculi sono stati ulteriormente divisi come ceppi I, II o III, in base al numero di ripetizioni di una sequenza a 4 basi (5′-GTTT-3′) nella regione interna dello spaziatore trascritto (ITS) del gene dell’RNA ribosomiale . Due isolati di cane E. cuniculi sono stati designati ceppo III sulla base della presenza di 4 ripetizioni di sequenza . Successivamente, isol 4 isolati umani sono stati identificati come ceppo III (isolati “Donovan” GenBank X98466, CDC:V282 e IPZ:MX-H5) e come ceppo I in due rapporti dall’Europa . Questo studio estende il lavoro identificando 8 ulteriori isolati di cani di E. cuniculi da 4 focolai come ceppo III. Sebbene nessun dato epidemiologico abbia confermato direttamente la trasmissione da cane a uomo, i dati molecolari suggeriscono che i cani possono servire come potenziali serbatoi di parassiti. Inoltre, è stato documentato lo spargimento a lungo termine di spore da parte di cani asintomatici, rafforzando ulteriormente la probabilità di trasmissione zoonotica del parassita.
Materiali e metodi
Isolati parassitari
I corpi di 7 cuccioli di 3 cucciolate non correlate e 1 cane sono stati presentati per 18 mesi al Texas Veterinary Diagnostic Laboratory per la valutazione post-mortem. Gli animali provenivano da quattro fonti non correlate provenienti da diverse regioni del Texas. Una diagnosi di encefalitozoonosi è stata fatta in ciascun caso sulla base dei risultati istologici. Otto isolati di parassiti sono stati stabiliti da tessuti freschi degli animali: 5 isolati sono stati derivati da tessuti cerebrali o renali di 5 – a 7 settimane di età Boston terrier cucciolo littermates (2 maschi, 3 femmine) che è morto di malattia neurologica (isolati 1-5, cucciolata 1). L’isolato 6 è stato derivato dal cervello di un terrier maltese maschio di 10 settimane che era 1 di 4 littermates (cucciolata 2) che è morto di malattia neurologica. Isolare 7 è stato derivato dal cervello di un cucciolo di barboncino in miniatura femmina di 10 settimane (cucciolata 3) che è morto di malattia neurologica. L’isolato 8 è stato derivato dal rene di un bassotto in miniatura femmina di 18 mesi morto di insufficienza renale (tabella 1).
Riassunto degli isolati canini caratterizzati come Encephalitozoon cuniculi ceppo III mediante analisi molecolare.
Riassunto degli isolati canini caratterizzati come Encephalitozoon cuniculi ceppo III mediante analisi molecolare.
Al momento della morte, i tessuti sono stati raccolti in modo asettico e omogeneizzati (omogeneizzatore di tessuto Ten Broeck; Corning, Corning, NY) utilizzando PBS, pH 7.2, più 2× soluzione antibiotico-antimicotica (Gibco, Gaithersburg, MD). Le spore microsporidiali sono state purificate dall’omogenato del tessuto ospite utilizzando un metodo di gradiente di densità Percoll precedentemente descritto modificato cambiando la velocità di centrifugazione a 600 g . I microsporidi sono stati coltivati in cellule RK-13 (ATCC CCL-37) utilizzando un mezzo RPMI 1640 integrato con siero bovino fetale al 5% e 2× soluzione antibiotico-antimicotica (Gibco) come descritto in precedenza . La coltura del parassita e l’analisi del DNA sono state effettuate per diversi mesi in base al ricevimento dei vari campioni del caso, quindi la possibilità di contaminazione incrociata accidentale era trascurabile.
Isolamento del DNA
Per gli isolati 1-6 e 8, i parassiti sono stati coltivati in colture a breve termine per generare spore adeguate per la caratterizzazione molecolare. Per isolare 7, i parassiti sono stati direttamente purificati dal tessuto cerebrale cucciolo fresco per l’isolamento del DNA. Per la maggior parte degli isolati, il DNA è stato estratto da spore purificate utilizzando la matrice Instagene (BioRad, Hercules, CA), seguendo il protocollo del produttore per le colture batteriche . Per alcuni dei lavori molecolari con gli isolati 6 e 8, le spore sono state elaborate come descritto in precedenza e il DNA è stato estratto dalle spore con un metodo di estrazione standard di fenolchloroform utilizzando un sistema di microfughe a gel di partizionamento (light phase Lock Gel system; 5 Prime→3 Prime Manufacturer, Westchester, PA) per ottimizzare il recupero del DNA. Il DNA è stato precipitato in etanolo, il pellet è stato risospeso in TE (10 mm Tris, 1 mM EDTA, pH 7.6) e la concentrazione di DNA è stata stimata utilizzando i rapporti A260 : A280 mediante spettrofotometria UV (Ultraspec Plus; Pharmacia, Piscataway, NJ). Il DNA estratto dalle spore di coltura tissutale di Encephalitozoon hellem è stato utilizzato come controllo positivo e un controllo negativo solo reagente è stato incluso in tutte le reazioni di estrazione e sequenziamento.
Sequenziamento parziale del DNA e analisi del gene SSU rRNA (small subunit ribosomal DNA)
Una porzione dell’estremità 5′ del gene SSU rRNA da ciascuno degli 8 isolati è stata amplificata utilizzando la coppia di primer PMP1 e PMP2, come descritto in precedenza . La reazione a catena della polimerasi (PCR) per ciascun isolato è stata eseguita seguendo le istruzioni del produttore (GENEAMP PCR core reagents, N808-0009; Perkin-Elmer Cetus/Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). L’amplificazione è stata fatta in un thermal cycler (PTC-200 Peltier; MJ Research, Watertown, MA). Dopo denaturazione iniziale per 5 min a 95°C, la Taq polimerasi (0,5 U) è stata aggiunta a ciascuna reazione da 25 µL. I campioni sono stati quindi sottoposti a 35 cicli di denaturazione (94°C, 30 s), ricottura (60°C, 30 s) ed estensione (72°C, 1 min) seguiti da 10 min a 72°C per l’estensione finale. I nucleotidi non incorporati sono stati rimossi utilizzando colonne di cromatografia (Micro Bio-Spin 30; BioRad). I campioni sono stati tenuti a 4°C fino a quando non sono stati elaborati per il sequenziamento automatico.
Analisi del DNA della regione ITS
Una porzione della regione ITS del gene RNA ribosomiale di ciascun isolato è stata amplificata mediante PCR con la coppia di primer int530f e int580r , utilizzando i metodi di amplificazione sopra descritti. Il prodotto PCR risultante è stato sequenziato in un sequencer automatico del DNA (modello 377; Perkin-Elmer Applied Biosystems/Roche Molecular Systems, Branchburg).
DNA automated sequencing
PCR-amplified DNA di ogni isolato è stato amplificato per la sequenza automatizzata con un kit commerciale (ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready-Reaction Kit; Promega, Madison, WI) seguendo le istruzioni del produttore. Tutte le reazioni sono state eseguite in un termociclatore (MJ Research Minicycler). I campioni sono stati quindi sottoposti a 35 cicli di denaturazione (94°C, 30 s), ricottura (60°C, 30 s) ed estensione (72°C, 1 min) seguiti da 10 min a 72°C per l’estensione finale. I prodotti di estensione sono stati purificati utilizzando colonne di cromatografia (Micro Bio-Spin; BioRad), essiccati in una centrifuga sotto vuoto (Savant Instruments, Holbrook, NY) e conservati a -20°C fino a quando non sono stati sequenziati in un sequencer automatico (Perkin-Elmer 377 ABI Applied Biosystems).
Con l’uso di software di allineamento (Sequencher; Gene Codes, Ann Arbor, MI), sequenze di consenso di bases 265 basi sono state ottenute per una porzione del gene SSU rRNA per ogni isolato parassita. Queste sequenze sono state valutate per l’omologia rispetto alle sequenze di Encephalitozoon precedentemente riportate nel database NCBI GenBank utilizzando una semplice ricerca BLASTN.
Test di mobilità eteroduplex a doppio filamento di DNA
Il DNA dell’isolato 6 è stato amplificato mediante PCR con la coppia di primer int530f e int580r come descritto in precedenza . I prodotti amplificati con PCR sono stati analizzati per la generazione di eteroduplessi e omoduplessi utilizzando isolati precedentemente caratterizzati di E. cuniculi da vari host.
Risultati
Un totale di 8 isolati di parassiti da 4 focolai clinici separati sono stati stabiliti in coltura tissutale. Entrambe le caratteristiche microscopiche leggere e le caratteristiche di crescita in vitro dei parassiti hanno suggerito che fossero E. cuniculi, una microsporidiana precedentemente riportata nei cani e in altri ospiti. Il sequenziamento parziale dell’estremità 5′ del gene SSU rRNA di ciascun isolato (GenBank AF144246–AF144253) ha confermato l’identità dei parassiti come E. cuniculi, poiché tutti i campioni hanno mostrato omologia al 100% con sequenze precedentemente pubblicate (GenBank L39107dEZORGOA, L17072¦EZORGSMALL; X98470¦ECDSSRR2).
L’analisi eteroduplex e il sequenziamento della regione ITS del gene dell’RNA ribosomiale hanno ulteriormente caratterizzato tutti gli isolati del cane come ceppo III, confermando precedenti segnalazioni di sottili variazioni tra gli isolati di E. cuniculi da vari roditori, conigli e ospiti umani. La figura 1 illustra la formazione di DNA omoduplex tra l’isolato canino 6 e un ceppo III precedentemente caratterizzato, nonché la formazione di eteroduplex tra l’isolato 6 e gli altri ceppi di E. cuniculi.
Test di mobilità eteroduplex che identifica l’isolato di cunicoli di Encephalitozoon del cane (Ec) come ceppo III. Corsie: 1, marcatori di coppia di basi; 2 e 3, omoduplexes da polymerase chain reaction (PCR) amplicon di parassiti dai tessuti del cervello del cucciolo (BR) e del rene (KID); 4-6, omoduplexes di ogni ceppo E. cuniculi; 7 e 8, eteroduplessi formati tra ampliconi PCR di parassiti da cucciolo rene e E. cuniculi ceppi I e II( freccia); 9 e 10, omoduplessi tra PCR ampliconi di parassiti da cucciolo rene e cervello e E. cuniculi ceppo III, indicando che sono identici nella sequenza del DNA.
Heteroduplex mobilità dosaggio di identificazione del cane Encephalitozoon cuniculi isolare (Ce) ceppo III. Corsie: 1, coppia di basi marcatori; 2 e 3, omoduplici da reazione a catena della polimerasi (PCR) amplicone di parassiti da cucciolo cervello (BR) e del rene (KID) tessuti; 4-6, homoduplexes di ogni ceppo E. cuniculi; 7 e 8, eteroduplexes formati tra amplicons PCR di parassiti da cucciolo rene e E. cuniculi ceppi I e II (freccia); 9 e 10, homoduplexes tra PCR amplicons di parassiti da cucciolo rene e cervello e E. cuniculi ceppo III, indicando che sono identici nella sequenza del DNA.
Discussione
Il significato biologico di più ceppi di E. cuniculi deve ancora essere chiarito; tuttavia, la capacità di distinguere tra ceppi di parassiti può fornire uno strumento per rintracciare le fonti di infezione negli studi epidemiologici. I nostri dati molecolari che identificano 8 isolati microsporidiani da cani come ceppo E. cuniculi III concordano con uno studio precedente che ha classificato 2 isolati di cane come ceppo III . Isolati di coniglio, topo e volpe sono stati segnalati come ceppi I o II . Questi dati suggeriscono che il ceppo III potrebbe essere associato prevalentemente ai cani. Gli isolati umani sono stati identificati come ceppo III nell’emisfero occidentale e come ceppo I in Europa . Anche se la fonte(s) di esposizione umana a E. cuniculi è sconosciuto, ci sono prove crescenti che gli animali possono servire come serbatoi di infezione, e c’è una possibilità di trasmissione zoonotica dell’organismo tra animali e persone. È interessante la possibilità che le differenze geografiche e culturali nella proprietà degli animali possano avere un ruolo nell’esposizione umana, poiché i cani sono animali domestici comuni negli Stati Uniti, mentre i conigli sono spesso tenuti come animali domestici o come cibo in Svizzera e in altri paesi europei.
L’esame di campioni fecali e di urina dai genitori di Boston terrier clinicamente normali e da 1 cucciolo di cucciolata 1 ha mostrato bassi livelli di spargimento di spore per ⩾4 mesi dopo la morte di littermates (isolati 1-5; dati non pubblicati). Questa osservazione suggerisce inoltre un possibile meccanismo per la trasmissione diretta o indiretta dei parassiti dai cani all’uomo attraverso la contaminazione di ambienti localizzati con escrezioni urinarie e fecali del cane. Sebbene nessuno studio epidemiologico abbia valutato la relazione tra proprietà/esposizione di animali domestici e infezioni microsporidiali umane, in un singolo caso in cui i bambini sono stati esposti a cuccioli con encefalitozoonosi palese, 1 bambino su 3 si è sieroconvertito . Ulteriori isolati di E. cuniculi da vari ospiti devono essere analizzati per valutare ulteriormente il rischio di mantenere animali domestici potenzialmente infetti nelle famiglie di persone immunocompromesse ad alto rischio di infezioni microsporidiali.
Ringraziamenti
Ringraziamo i patologi del laboratorio diagnostico medico veterinario del Texas Jay Hoffman, Joanne Mansell e Bruce Abbitt per aver fornito tessuti canini per questo studio.
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Questa ricerca è stata finanziata da grant AI-40232 del National Institutes of Health.