Definizione
etichettatura Fluorescente è il processo di associazione delle tinture fluorescenti per gruppi funzionali contenute nelle biomolecole in modo che possano essere visualizzati da imaging in fluorescenza (nature.com). La disponibilità di nuovi fluorofori ha cambiato drasticamente la possibilità per la rilevazione sensibile di biomolecole e l’analisi delle loro interazioni. Coloranti fluorescenti migliorati stanno ora consentendo studi precedentemente impossibili di strutture cellulari e processi cellulari. Le etichette fluorescenti offrono molti vantaggi, in quanto sono altamente sensibili anche a basse concentrazioni, sono stabili per lunghi periodi di tempo e non interferiscono con la funzione delle molecole bersaglio. L’imaging mirato delle cellule marcate consente di rintracciarle in vitro e in vivo. L’utilizzo di fluorofori diversi nello stesso campione può anche consentire l’osservazione simultanea di più molecole contemporaneamente. I fluorofori più comunemente usati sono l’isotiocianato di fluoresceina (FITC), i derivati della rodamina (TRITC), la cumarina e la cianina. Questi coloranti organici sintetici sono usati per etichettare le biomolecole come proteine, peptidi, anticorpi, acidi nucleici, batteri o lieviti. I fluorocromi naturali, come la proteina fluorescente verde (GFP), possono anche essere utilizzati per etichettare geneticamente le cellule viventi.
- Etichettatura delle proteine fluorescenti
L’etichettatura fluorescente consente ai ricercatori di studiare le dinamiche conformazionali e le interazioni molecolari delle proteine o di tracciare i loro movimenti per comprendere meglio le loro funzioni biologiche (Modesti M, 2011). Per ottenere una migliore comprensione del legame del recettore-ligando, delle strutture proteiche e dell’attività enzimatica, i singoli peptidi possono anche essere etichettati. Gli anticorpi marcati con fluorocromo sono ampiamente utilizzati nella ricerca biomedica per rilevare gli antigeni nei saggi di immunofluorescenza e sono anche strumenti essenziali nell’immunodiagnostica. Per garantire risultati affidabili, la coniugazione del fluoroforo non dovrebbe interferire con le caratteristiche di legame dell’antigene dell’anticorpo (Nath N et al, 2016). - Etichettatura fluorescente degli acidi nucleici
I saggi a base di fluorescenza svolgono un ruolo importante negli studi biofisici della struttura, della funzione e della dinamica degli acidi nucleici. I recenti progressi nei metodi di etichettatura e nei sistemi di imaging hanno permesso l’osservazione diretta in vivo di DNA e RNA e delle loro interazioni con altri componenti cellulari. L’imaging a cellule vive degli acidi nucleici ha aperto nuovi percorsi per una migliore comprensione dell’organizzazione della cromatina e della regolazione dell’espressione genica. (Dirks RW et al, 2018). - Etichettatura fluorescente dei polisaccaridi
I polisaccaridi complessi, come l’eparina, sono componenti strutturali della matrice extracellulare. Questi polisaccaridi sono essenziali per l’adesione cellulare, la migrazione e la crescita (Prigent-Richard S. et al, 1998). Alcuni composti sono noti anche per le loro proprietà anticoagulanti, antitrombotiche, antinfiammatorie, antivirali e antiangiogeniche. I metodi basati sulla fluorescenza facilitano l’identificazione di nuovi polisaccaridi bioattivi e la caratterizzazione delle loro funzioni biologiche (Roger O et al, 2002). - Etichettatura fluorescente dei lipidi
I lipidi cellulari svolgono un ruolo cruciale nella cellula per lo stoccaggio di energia, per la formazione delle membrane cellulari e per i processi di segnalazione intracellulare (Maekawa M. e Fairn G, 2014). Il colorante lipofilo Rosso Nilo è ampiamente usato per macchiare i lipidi intracellulari al fine di analizzare la loro posizione e organizzazione (Greenspan P et al, 1985). Inoltre, per lo studio della dinamica lipidica, è possibile anche l’etichettatura specifica nelle cellule viventi (Schultz C et al, 2010).
Tecniche di etichettatura fluorescente
I metodi di etichettatura fluorescente comunemente usati utilizzano tecniche di etichettatura chimica, enzimatica, peptidica / proteica e genetica (Sahoo H, 2012 , Toseland CP, 2013).
- Tecniche di etichettatura chimica: I fluorofori attraccano alle molecole bersaglio mediante modificazione chimica (legame covalente o non covalente). I metodi di etichettatura chimica hanno diversi vantaggi in quanto sono robusti, facili da eseguire e molto efficienti con una vasta gamma di fluorofori. Sono più adatti per studi in vitro piuttosto che in vivo.
- Tecniche di etichettatura enzimatica: le reazioni enzimatiche consentono un’etichettatura rapida, altamente efficiente e selettiva in vivo e in vitro e possono essere utilizzate per colpire proteine o cellule intere. Tuttavia, a causa delle grandi dimensioni delle etichette, possono verificarsi interferenze con la funzione delle molecole bersaglio.
- Peptide / protein tag: Una tecnica recentemente sviluppata e molto promettente consente l’etichettatura specifica e selettiva delle proteine attraverso l’incorporazione di tag fluorescenti brevi che non interrompono la piegatura o la funzione della molecola. Questa tecnica è anche facile da eseguire e può essere utilizzata per studiare diversi siti di singole proteine a seconda della specificità dell’etichetta peptidica.
- Etichettatura genetica: l’etichettatura genetica può essere ottenuta utilizzando domini proteici, piccoli peptidi o singoli amminoacidi contrassegnati con coloranti fluorescenti e che possono essere specificamente attaccati ai siti lungo i cromosomi in vivo. Questo approccio consente la rilevazione di anomalie cromosomiche come delezioni o duplicazioni.
- Etichettatura multicolore: Un requisito comune per l’imaging di cellule vive e per le applicazioni di citometria a flusso è la capacità di seguire o rilevare più proteine con tag fluorescenti contemporaneamente. A tale scopo, è possibile utilizzare coloranti specificamente progettati con uno spostamento di Stokes molto grande, che consentono il monitoraggio simultaneo di diversi processi biochimici.
Test a base di fluorescenza
I test a base di fluorescenza si basano sulla capacità dei fluorofori di riemettere la luce dopo l’esposizione a particelle di luce o fotoni. La differenza di lunghezza d’onda tra la luce di eccitazione e la luce di emissione, il cosiddetto Stokes shift, può essere rilevata nei microscopi e nei sistemi di imaging. Ogni fluoroforo ha uno specifico spostamento di Stokes. Diversi test consentono ai ricercatori di localizzare biomolecole, osservarle in tempo reale, indagare le loro interazioni e studiare le attività enzimatiche.
- Microscopia a fluorescenza
La microscopia a fluorescenza consente l’identificazione di cellule e componenti cellulari e il monitoraggio della fisiologia cellulare ad alta specificità. La microscopia di fluorescenza separa la luce emessa dalla luce di eccitazione facendo uso dei filtri ottici. L’uso di due indicatori consente anche l’osservazione simultanea di diverse biomolecole contemporaneamente. Mentre i sistemi di imaging convenzionali consentono una risoluzione da 200 a 300 nm a causa dei limiti di diffrazione fisica, i nuovi microscopi a fluorescenza a super risoluzione come STED (stimulated emission depletion) superano questi limiti e forniscono informazioni sul mondo delle molecole su scala nanometrica (Sanderson MJ et al, 2014). - Citometria a flusso
La citometria a flusso è ampiamente utilizzata nella ricerca di base e nella pratica clinica per misurare il segnale da fluorofori specifici. Le cellule e le particelle vengono analizzate e infine ordinate in “tempo reale” mentre passano attraverso il fascio di luce dei rivelatori che quantificano la fluorescenza prodotta da anticorpi o ligandi marcati. Questi marcatori si legano a molecole specifiche sulla superficie cellulare o all’interno della cellula consentendo la loro individuazione e quantificazione. Diversi parametri come dimensione e volume possono essere misurati su singole celle e diversi tipi di cellule possono essere isolati e caratterizzati (Nolan JT e Condello D, 2013). La citometria a flusso trova ampie applicazioni in campi come immunologia, ematologia, medicina dei trapianti, oncologia e genetica. - Fluorescenza in situ ibridazione (FISH)
Fluorescenza in situ ibridazione (FISH) permette la localizzazione di specifiche sequenze di DNA sui cromosomi. Le sonde fluorescenti del RNA o del DNA sono usate per ibridare ed identificare le sequenze complementari del DNA dell’obiettivo. Il pesce è stato tradizionalmente utilizzato per mappare i geni sui cromosomi, ad esempio, durante il progetto Genoma umano. Oggi l’ibridazione in situ a fluorescenza viene utilizzata principalmente per scopi diagnostici nella rilevazione di anomalie cromosomiche o nell’analisi delle cellule tumorali (O’Connor C, 2008). - Spettroscopia di correlazione di fluorescenza (FCS)
La spettroscopia di correlazione di fluorescenza (FCS) consente l’analisi dei cambiamenti temporali nell’intensità della fluorescenza dei fluorocromi, causati da influenze chimiche, biologiche o fisiche. FCS è stato introdotto per la prima volta per studiare l’interazione tra farmaci e DNA e rappresenta ora uno strumento sensibile per determinare i livelli di concentrazione e aggregazione delle proteine, nonché per osservare le interazioni molecolari (Tian Y et al, 2011). - Microarrays
I microarrays permettono lo studio di espressione genica nelle circostanze differenti. Migliaia di geni possono essere esaminati contemporaneamente su chip di DNA. Si tratta di diapositive microscopiche stampate con minuscole macchie contenenti sequenze di DNA note che possono legarsi selettivamente a molecole mRNA/cDNA marcate a fluorescenza. Dopo l’ibridazione, il chip del DNA viene letto e i dati vengono utilizzati per creare profili di espressione genica (Hoen PAC et al, 2003).
Etichetta fluorescente: Imaging a cellule vive
L’osservazione cinetica dei processi cellulari mediante microscopia a fluorescenza time-lapse è diventata una tecnica fondamentale nella biologia cellulare, poiché l’imaging a cellule vive può fornire informazioni molto preziose sulla crescita cellulare e sui meccanismi di trasporto. Una sfida importante nella microscopia time-lapse è ridurre al minimo gli effetti fototossici derivanti dal photobleaching. L’esposizione alla luce distrugge progressivamente le molecole fluorescenti portando ad una riduzione del segnale di fluorescenza e alla formazione di radicali liberi che possono danneggiare le cellule. Pertanto, è fondamentale per il metodo di imaging delle cellule vive trovare un equilibrio tra la riduzione dell’esposizione alla luce il più possibile e l’ottenimento di segnali utili per osservare le cellule. Gli scienziati devono anche creare un ambiente fisiologico che consenta di replicare da vicino le dinamiche in vivo. (Ettinger e Wittmann T, 2014).
PromoCell Fluorescent Labelling
La disponibilità di nuovi fluorofori ha cambiato radicalmente le possibilità di rilevamento sensibile delle biomolecole e l’analisi delle loro interazioni. Coloranti fluorescenti migliorati stanno ora consentendo studi precedentemente impossibili di strutture cellulari e processi cellulari. PromoCell fornisce una vasta gamma di fluorofori di alta qualità per l’etichettatura fluorescente di diverse biomolecole: etichettatura delle proteine, etichettatura degli anticorpi, etichettatura degli acidi nucleici (etichettatura del DNA, etichettatura dell’RNA), nonché kit di etichettatura completi e coniugati fluorescenti pronti all’uso.
I nostri coloranti PromoFluor sono alternative convenienti ai fluorofori ben noti e leader e coprono lo spettro delle lunghezze d’onda dal blu al rosso lontano. Mostrano un’eccezionale intensità di fluorescenza e fotostabilità, un forte assorbimento della luce, un’elevata resa quantistica a fluorescenza e una buona solubilità in acqua e possono essere utilizzati per microscopia a fluorescenza, ibridazione fluorescente in situ (FISH), spettroscopia di correlazione a fluorescenza (FCS) e microarray (proteine, DNA). Alcuni di loro offrono un grande spostamento extra di Stokes, che li rende ideali per l’etichettatura multicolore o le applicazioni di citometria a flusso. I coloranti PromoFluor sono disponibili ad es. come esteri NHS, maleimidi e etichette ammino-modificate pronte per l’accoppiamento covalente o come coniugati con biotina, falloidina e deossinucleotidi (dUTPs). Inoltre, forniamo anche proteine di alta qualità & Kit di etichettatura anticorpo con diversi coloranti PromoFluor.