Forze trainanti della comunità batterica nel suolo struttura, diversità e funzione nelle praterie e foreste temperate

Trame NMDS basate su dissimilarità di Bray Curtis di praterie (a,c,e) e comunità batteriche forestali (b,d,f). I parametri ambientali correlati in modo significativo (P < 0.05) sono indicati come frecce (C:N: carbon: azotate ratio; water: gravimetric water content; sand: sand amount; limo: limo amount; clay: clay amount; LUI: land use intensity index in grasslands; SMI: silvicultural management index in forests). a) Campioni di pascoli di Schorfheide-Chorin; b) Campioni di foreste di Schorfheide-Chorin; c) Campioni di pascoli di Hainich-Dün; d) campioni di foreste di Hainich-Dün; e) Campioni di pascoli di Schwäbische Alb; f) Campioni di foreste di Schwäbische Alb. Si noti che gli assi NMDS hanno scale diverse per ogni ordinazione.

Nei terreni erbosi, il rapporto C:N ha influenzato la struttura della comunità batterica nello Schwäbische Alb e nello Schorfheide-Chorin, ma non nell’Hainich-Dün. Ciò è supportato da uno studio basato su PFLA sulle comunità batteriche del suolo, in cui proprietà edafiche come la struttura del suolo, il pH e la concentrazione di C e N sono state coinvolte nella strutturazione delle comunità batteriche del suolo10. L’indice di intensità dell’uso del suolo (LUI) era correlato solo con la comunità di pascoli di Schwäbische Alb. Tuttavia, il LUI rappresenta solo l’importo e non la fonte della fecondazione. Nelle praterie di Schwäbische Alb, la maggior parte dei terreni ha ricevuto concime organico (letame, sterco), mentre la concimazione nelle aree di Hainich-Dün e Schorfheide-Chorin è stata predominata dall’applicazione di concimi minerali. Questi risultati supportano un recente studio, in cui le comunità microbiche del suolo dei sistemi di allevamento che ricevono fertilizzante organico erano diverse rispetto a quelle dei sistemi convenzionali, fertilizzati mineralmente e dei terreni di controllo29. In accordo con Geisseler e Scow30, le tendenze chiare che suggeriscono cambiamenti strutturali della comunità batterica dovuti all’applicazione di fertilizzanti minerali a lungo termine, non sono state trovate nel nostro sondaggio.

Nei terreni forestali, le specie arboree erano correlate con la struttura della comunità batterica in tutti gli esploratori, mentre l’indice di gestione della silvicoltura (SMI) ha influenzato significativamente la struttura della comunità nello Schorfheide-Chorin (Fig. 2). Le comunità batteriche del suolo sotto latifoglie (Fagus e Quercus) e conifere (Pinus e Picea) formano modelli distinti. Questo è in accordo con i risultati degli studi precedenti9, 20. Nacke et al.9 ha analizzato un sottoinsieme di campioni di terreno derivati dalla Schwäbische Alb e ha scoperto che la struttura della comunità batterica era diversa sotto il faggio (Fagus) e l’abete rosso (Picea). Ciò è coerente con uno studio che ha confrontato le comunità batteriche sotto alberi di conifere e latifoglie20. Non abbiamo osservato una differenza tra le due specie di alberi a foglia larga, sebbene siano state descritte differenze nella struttura della comunità del suolo tra gli alberi a foglia larga per Fagus versus Tilia e Acer31. Questi effetti potrebbero essere in parte dovuti alla ridotta acidificazione del suolo e ai tassi di turnover più elevati della lettiera fogliare di Tilia e Acer32. Le specie di conifere come l’abete rosso (Picea abies) e il pino (Pinus sylvestris) sono noti per ridurre significativamente il pH del suolo (recensito in ref. 33) a causa della speciale struttura chimica della lettiera sempreverde o della cattura di composti acidi atmosferici34. Ciò si tradurrebbe in un effetto indiretto del pH sui batteri del suolo. Inoltre, questo potrebbe essere uno dei motivi per cui le specie arboree svolgono un ruolo importante nella strutturazione delle comunità batteriche in tutti i campioni di foresta analizzati.

Secondo la nostra ipotesi che la struttura e la diversità delle comunità batteriche sarebbero influenzate in modo simile sotto lo stesso uso del suolo, abbiamo confrontato la diversità batterica, rappresentata dall’indice di Shannon (H’), tra i diversi regimi di gestione (Tabella materiale supplementare S4). Differenze nella diversità sono state rilevate per le specie arboree nello Schwäbische Alb e nello Schorfheide-Chorin.

È interessante notare che i regimi di gestione nelle praterie (prato, pascolo, pascolo falciato) e nelle foreste (foresta non gestita, foresta di età, foresta di selezione) non hanno mostrato alcun effetto significativo sulla diversità batterica (PERMANOVA, P< 0.05). Questo è in contrasto con un precedente studio di Will et al.22, che ha trovato una maggiore diversità batterica nei terreni erbosi a bassa intensità di utilizzo del suolo nell’Hainich-Dün. Al contrario, Tardy et al.17 ha studiato la diversità batterica lungo i gradienti di intensità dell’uso del suolo e ha osservato la più alta diversità batterica nei suoli a gestione moderata. Gli autori suggeriscono che questo effetto è correlato alla risposta allo stress della comunità batterica. In ambienti altamente stressati, come ad alta intensità di utilizzo del suolo, la diversità diminuisce a causa del predominio di specie competitive ed esclusione competitiva, mentre in ambienti non stressati la diversità diminuisce a causa del predominio di specie adattate attraverso la selezione. Secondo la nostra ipotesi, potremmo trovare condizioni del suolo come il pH che guidano costantemente la struttura della comunità batterica e la diversità, mentre i regimi di gestione e quindi l’intensità dell’uso del suolo non hanno un’influenza significativa. Inoltre, potremmo dimostrare che il pH è il miglior predittore delle comunità batteriche.

Funzionamento batterico nei terreni erbosi e forestali

Abbiamo inoltre ipotizzato che il funzionamento batterico fosse guidato in modo simile alla struttura e alla diversità della comunità batterica. Per chiarire questa ipotesi, ci siamo concentrati sui percorsi coinvolti nel ciclismo di carbonio, azoto, fosforo e zolfo (Fig. 3) e ha confrontato le abbondanze relative di geni chiave che codificano per gli enzimi tra i due usi terrestri prateria e foresta. Le abbondanze dei geni che codificano per gli enzimi sono state derivate da un nuovo strumento bioinformatico Taxa4Fun23. Tax4Fun trasforma gli OTU basati su SILVA in un profilo tassonomico di organismi KEGG, che viene normalizzato dal numero di copia 16S rRNA (ottenuto dalle annotazioni del genoma NCBI). Poiché i terreni ospitano organismi sconosciuti o incolti, non tutte le sequenze 16S possono essere mappate agli organismi KEGG. L’analisi di correlazione di Spearman dei profili funzionali derivati dall’intero sequenziamento del metagenoma e dei profili dedotti dalle sequenze geniche 16S rRNA ha rivelato una mediana del coefficiente di correlazione di 0,8706 per i suoli23. Ciò ha indicato che Tax4Fun fornisce una buona approssimazione ai profili funzionali ottenuti da approcci di sequenziamento shotgun metagenomic. Ciò è particolarmente utile per dedurre i profili funzionali per un gran numero di campioni derivati da ambienti complessi, come raggiungere una copertura rappresentativa per ogni campione di un grande campione impostato da metagenome shotgun sequenziamento sarebbe un compito arduo.

I geni chiave per il metabolismo dell’azoto, dello zolfo e del metano, le vie di fissazione del carbonio, la degradazione della cellulosa, dello xilano, della lignina e degli idrocarburi poliaromatici (PAH), le fosfatasi acide e alcaline e l’ureasi sono stati combinati. La loro abbondanza media (relativa alla media nel set di dati completo) nel suolo delle praterie è stata confrontata con l’abbondanza media nei terreni forestali. La dimensione e il colore dei cerchi indicano l’abbondanza media nel set di dati completo. Bassa abbondanza: piccoli cerchi blu; media abbondanza: cerchi gialli medi; alta abbondanza: grandi cerchi rossi. Gli enzimi inclusi nell’analisi sono riportati nella tabella Materiale supplementare S5.

La maggior parte dei geni chiave di codifica enzimatica coinvolti nel ciclo di C, N, S e P sono più abbondanti nei terreni erbosi o forestali (test di Mann-Whitney, P< 0.05, Tabella materiale supplementare S5). Ad esempio, i geni che codificano le fosfatasi acide sono stati osservati a 1.abbondanze 4 volte più elevate nel profilo funzionale dei suoli forestali rispetto ai suoli delle praterie, mentre le fosfatasi alcaline hanno mostrato la tendenza opposta. Supponiamo che questo effetto possa essere attribuito alla differenza di pH tra i tipi di uso del suolo, poiché abbiamo dimostrato che il pH è il miglior predittore per le comunità batteriche. I geni che codificano per l’ureasi erano 1,2 volte più abbondanti nelle praterie. La disponibilità di urea era maggiore nei campioni di prateria, in quanto questi sono parzialmente fertilizzati con letame o sterco o sono stati pascolati da animali. I geni della chitinasi hanno anche mostrato un 1.2 volte maggiore abbondanza nelle praterie rispetto ai terreni forestali. Ciò potrebbe derivare dalla maggiore abbondanza di actinobatteri nei terreni erbosi, poiché questo gruppo è noto per ospitare un elevato numero di geni chitinasi35. I geni coinvolti nella degradazione degli idrocarburi poliaromatici (PAH, qui lignina) sono più abbondanti nelle praterie. Nei sistemi forestali, questo processo viene eseguito principalmente da funghi ligninolitici (principalmente basidiomiceti saprotrofici), che sono in grado di degradare la biomassa di legno36. Un enzima chiave per l’ossidazione aerobica del metano, la metanolo deidrogenasi, era notevolmente più abbondante nei terreni forestali. L’ossidazione del metano nei terreni forestali è il più grande dissipatore biologico per il metano atmosferico4 e quindi svolge un ruolo critico nel flusso di questo gas serra. Inoltre, l’ossido nitroso (N2O) reduttasi, che catalizza l’ultimo passo nella denitrificazione e riduce N2O a N2, è anche più abbondante nei terreni forestali (dati non mostrati). Questi risultati indicano che gli ecosistemi forestali temperati non solo svolgono un ruolo cruciale nella regolazione e nella rimozione del metano, ma anche del protossido di azoto dei gas serra.

È interessante notare che l’enzima chiave della fissazione dell’azoto, l’nitrogenasi, è meno abbondante nei prati che nei terreni forestali. In questo studio, è stato prelevato solo terreno sfuso e quindi presumibilmente è stato possibile rilevare solo batteri che fissano l’azoto in vita libera. È possibile che la fissazione dell’azoto da parte di batteri viventi liberi svolga un ruolo maggiore nei sistemi forestali, mentre i batteri simbiotici e rizosferici, che non sono stati coperti dallo studio, svolgono la maggior parte della fissazione dell’azoto nei sistemi di prateria.

I risultati ottenuti suggeriscono che i diversi usi del terreno praterie e foreste non solo selezionano per distinte popolazioni batteriche, ma anche per specifici tratti funzionali all’interno delle loro comunità batteriche. Poiché le praterie e le foreste analizzate nel presente studio sono sistemi consolidati a lungo termine, sarebbe interessante valutare se un adattamento simile è presente anche nei sistemi più giovani.

Il pH del suolo è il miglior predittore delle comunità batteriche

Nel presente studio, il pH era l’unico fattore, che ha influenzato la comunità batterica indipendentemente dall’uso esplorativo e del suolo. Inoltre, non solo ha influenzato la struttura della comunità batterica, ma anche il profilo funzionale dei batteri del suolo. Come già accennato, l’analisi CCA ha rivelato che il pH spiega il 26% della varianza totale nel profilo comunitario (figura supplementare S3). Pertanto, il pH era il più forte predittore per la struttura della comunità batterica.

Abbiamo ipotizzato che la struttura e il funzionamento della comunità batterica sarebbero stati modellati in modo simile. Le correlazioni ambientali con il profilo funzionale derivato da Tax4Fun sono state testate da NMDS sulla base delle dissimilarità di Bray-Curtis (Fig. 4). I risultati sono simili a quelli ottenuti per la struttura comunitaria. Il pH ha svolto un ruolo importante nel plasmare il profilo funzionale e ha spiegato il 32% della varianza (testato da CCA, P < 0.001, Figura supplementare S5). Ciò supporta la nostra ipotesi che la struttura e le funzioni delle comunità batteriche siano modellate da meccanismi simili. Il profilo funzionale ha anche mostrato una separazione tra prati e sistemi forestali.

Correlazioni statisticamente significative delle caratteristiche del suolo (C: N: carbonio: rapporto azoto; acqua: contenuto di acqua gravimetrico; sabbia: quantità di sabbia; limo: quantità di limo; argilla: quantità di argilla) e l’indice di Shannon (H’) sono stati indicati dalle frecce. I campioni di terreno delle praterie sono rappresentati da quadrati marroni, i campioni di foresta da triangoli verdi. I campioni provenienti da diverse regioni si distinguono per sfumature di colore (SEG: prateria Schorfheide-Chorin; SEW: foresta Schorfheide-Chorin; HEG: prateria Hainich-Dün; HEW: foresta Hainich-Dün; AEG: prateria Schwäbische Alb; AEW: foresta Schwäbische Alb).

Inoltre, abbiamo scoperto che il pH è il più forte predittore della diversità batterica del suolo (P < 0.001, R2 = 0.4) (Fig. 5). È già stato dimostrato che la diversità delle comunità batteriche del suolo negli esploratori è correlata positivamente con pH9,22. Tuttavia, i nostri risultati indicano una relazione più complessa tra pH e diversità. La diversità era più bassa a pH basso, poi aumentata e sembrava essere stabile tra pH 5 e 7 e aumenta di nuovo in condizioni leggermente alcaline. Questo è in contrasto con Fierer e Jackson7 e Lauber et al.8, che ha descritto un picco di diversità batterica del suolo in terreni quasi neutri.

Punti di indicare osservato Shannon indici per ogni campione, mentre la linea rappresenta il non-lineare cubito dotato di regressione per i dati (adjusted R2 = 0.5337, P < 0.001).

I modelli di regressione multinomiale hanno rivelato risposte multiple di ordini batterici al pH del suolo

Per comprendere meglio la complessa relazione tra singoli gruppi batterici e pH del suolo, abbiamo applicato modelli di regressione multinomiale sui 30 ordini più abbondanti del set di dati (Materiale supplementare Figura S6). Sono state osservate quattro risposte generali: (1) calo in abbondanza con l’aumento del pH (Acidobacteriales, acidobacterial sottogruppo 3, Frankiales, Corynebacteriales), (2) aumentare la ricchezza con l’aumento del pH (acidobacterial sottogruppo 6, Gaiellales, Acidimicrobiales, Propionibacteriales), (3) stretto intervallo di pH con abbondanza (Rhizobiales, Rhodospirillales), e (4) relativamente costante abbondanza in tutta intervallo di pH (Bacillales, Gemmatimonadales, Sphingobacteriales) (Fig. 6). Nella loro pubblicazione su niche theory, Austin e Smith37 hanno descritto il pH come un gradiente fisiologico diretto che agisce sugli organismi, con conseguente unimodale, o curve di risposta unimodali distorte limitate da condizioni di limitazione della crescita a un’estremità e competizione all’altra estremità. Ciò è supportato dalla nostra osservazione di pochi ordini altamente abbondanti a pH basso e molti ordini meno abbondanti in terreni quasi neutri. La capacità di crescere a bassi valori di pH è nota come ATR (acid tolerance response) e conferisce un vantaggio competitivo rispetto ad altri batteri nei terreni.

Ogni riga rappresenta il predetto cambiamenti di abbondanza lungo il gradiente di pH misurato, in base a previsioni derivate da modelli di regressione multinomiale. Una versione dettagliata di questo grafico che include i 30 ordini più abbondanti è disponibile come materiale supplementare Figura S4.

Per testare quali meccanismi sono coinvolti nella tolleranza acida dei batteri del suolo, abbiamo scelto quei geni segnalati per essere coinvolti nella tolleranza acida in Rhizobia38 e batteri Gram positivi che erano presenti nel profilo funzionale. Inoltre, abbiamo analizzato i geni presenti nella via di KEGG per la biosintesi degli acidi grassi insaturi (ko01040) e dell’isomerasi 3-trans-2-decenoil. Questo enzima è coinvolto nella generazione di acidi grassi insaturi ed è stato dimostrato che aumenta la tolleranza acida nello Streptococcus mutans modificando la composizione della membrana cellulare40. Abbiamo scoperto che i geni per la biosintesi degli acidi grassi insaturi erano molto abbondanti nei campioni a basso pH (pH 3-4), mentre la decenoil isomerasi non seguiva questa tendenza (Fig. 7). Pertanto, questo gene potrebbe non essere generalmente coinvolto nella tolleranza acida nel suolo. Inoltre, la maggior parte dei geni coinvolti nella produzione di alcali, sistemi bicomponenti e riparazione di macromolecole erano più abbondanti nei campioni a basso pH rispetto a campioni più neutri. Diversi geni coinvolti nella riparazione del DNA erano probabilmente coinvolti anche nell’ATR dei batteri che abitano il suolo, così come la levansucrasi, un gene coinvolto nella formazione del biofilm. I nostri risultati suggeriscono che i batteri possono applicare un meccanismo attivo per far fronte a condizioni di pH stressanti. La produzione di alcali aumenta il pH nell’ambiente circostante, migliorando le possibilità di sopravvivenza batterica. Inoltre, gli enzimi di riparazione delle macromolecole proteggono e riparano il DNA e le proteine e i batteri sembrano migliorare la tolleranza al pH alterando i loro componenti della parete cellulare o proteggendosi all’interno dei biofilm.

Vengono mostrati solo geni con ortologhi di KEGG e presenti nel profilo funzionale. La via di KEGG per la biosintesi degli acidi grassi insaturi è inclusa, anche sulla base dei geni con ortologhi di KEGG nel profilo funzionale. Bianco: bassa abbondanza relativa; giallo: media abbondanza relativa; rosso: alta abbondanza relativa.