Frontiere in Farmacologia

FIGURA 1

La transizione tra gli stati chiusi e aperti avviene per eventi locali di dispiegamento. In condizioni native, in cui le proteine sono ben piegate, il tasso di HDX dipende principalmente dal tasso di transizione verso lo stato chiuso (Weis et al., 2006). Se la regione proteica dispiegata ritorna allo stato chiuso ad un ritmo molto più lento del tasso di cambio chimico, si osservano cinetiche EX1, con conseguente assorbimento di deuterio correlato nei residui vicini. Ciò si traduce in due popolazioni: una con basso m/z e uno con un alto m/z, riflettendo peptidi da molecole proteiche che non hanno e che hanno subito scambio, rispettivamente. Con il tempo, la popolazione m/z alta diventa più prominente a scapito della popolazione m/z bassa. La cinetica EX1 è considerata rara nelle proteine piegate in condizioni native, ma può essere indotta, ad esempio, dall’aggiunta di denaturanti (Weis et al., 2006; Oganesyan et al., 2018). Se la proteina ritorna allo stato chiuso ad una velocità molto più veloce del tasso di cambio chimico, si osserva la cinetica EX2. Qui, lo scambio dipende dalla transizione dei singoli residui tra lo stato aperto e quello chiuso, che si verificano in modo non correlato. Pertanto, con il tempo, si osserva una singola popolazione con valori m/z gradualmente crescenti (Weis et al., 2006).

Dopo la deuterazione, la reazione viene estinta in punti di tempo predefiniti cambiando il pH da neutro (7) a pHmin (2,5–3), con conseguente riduzione di ~10.000 volte in HDX (Konermann et al., 2011; Masson et al., 2017; Oganesyan et al., 2018); e riducendo la temperatura da 25 a 0°C, portando a una diminuzione di ~ 14 volte in HDX (Englander, 2006; Oganesyan et al., 2018). Successivamente, la proteina viene digerita utilizzando una proteasi e i peptidi vengono separati utilizzando la cromatografia analitica in fase inversa. Attualmente, il principale collo di bottiglia tecnico degli esperimenti HDX-MS sta nell’ottenere un’alta copertura di sequenza, che è limitata dalla resistenza agli enzimi digestivi e dalle condizioni proteolitiche. Infine, i peptidi eluiti vengono identificati utilizzando MS e il grado di HDX viene calcolato in base ai valori m/z ottenuti. I dettagli sperimentali e le insidie della digestione delle proteine, della separazione dei peptidi e dell’identificazione della SM vanno oltre lo scopo di questa recensione (Konermann et al., 2011; Masson et al., 2017; Masson et al., 2019).

Studi di spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio sulle proteine di membrana

Nonostante condividano il paradigma di accesso alternato, i cambiamenti conformazionali indotti dai ligandi differiscono tra i trasportatori a causa delle differenze nelle interazioni ligando-proteina. Ad esempio, i symporter (che trasportano due o più ligandi) possono passare tra gli stati IF e OF senza leganti legati, mentre il legame dei ligandi è obbligatorio per lo scambio tra gli stati IF e OF negli antiporter (scambiando ligandi ai lati opposti della membrana) (Forrest et al., 2011; Drew e Boudker, 2016; Bai et al., 2017).

In generale, rilevare cambiamenti dinamici indotti da ligandi locali nelle proteine è difficile. Ad esempio, le strutture cristalline delle proteine di membrana sia nelle forme libere che legate al ligando sono spesso non disponibili, precludendo la rilevazione di cambiamenti conformazionali indotti dal ligando anche per proteine con strutture note. Inoltre, le istantanee strutturali ad alta risoluzione degli stati apo e legati al ligando potrebbero non risolvere differenze conformazionali significative. Tuttavia, piccoli cambiamenti conformazionali indotti da ligando possono essere rilevati utilizzando HDX-MS in sottodomini proteici specifici in condizioni native misurando l’assorbimento differenziale di deuterio (ΔHDX) in presenza e assenza di ligandi. Questa capacità di HDX-MS offre opportunità uniche per affrontare i problemi più impegnativi nel chiarire i meccanismi delle interazioni ligando-proteina e proteina-proteina (Rand et al., 2014; Masson et al., 2019; Redhair et al., 2019), come recensito qui per un certo numero di proteine trasportatrici recentemente studiate.

Transizioni conformazionali sottostanti l’accesso alternato: Le proteine Na+/H+ Antiporter

Nha regolano il pH cellulare e il volume in tutti i regni della vita (Padan e Landau, 2016). Il principale modello strutturale utilizzato per studiare gli ortologi Nha è l’Escherichia coli NhaA, per il quale è disponibile una struttura cristallografica dello stato inattivo a pH acido (Hunte et al., 2005). Per studiare la dinamica strutturale di NhaA sotto pH fisiologico, HDX-MS è stato recentemente utilizzato (Eisinger et al., 2017). Cruciale per le intuizioni ottenute in questo studio, HDX-MS fornisce dati dinamici globali, in contrasto con i metodi basati sull’etichettatura specifica del sito, che rilevano solo i movimenti delle regioni proteiche predefinite.

In questo studio, è stata ottenuta una copertura di sequenza eccezionalmente elevata dell ‘ 88,5% per NhaA nel detergente, fornendo informazioni sul meccanismo alla base dell’accesso alternato al legame del ligando. Confrontando i modelli HDX tra apo e Nha legato al substrato, è stato osservato un modello ricorrente di cambiamento HDX in diverse eliche, dove l’aumento dell’assorbimento di deuterio in un terminale è stato accompagnato da una diminuzione dell’assorbimento di deuterio nell’altro terminale. L’assorbimento al centro delle eliche era in gran parte invariato.

Sulla base del modello osservato di cambiamento HDX, anche se non fornisce direttamente informazioni spaziali, è stato suggerito che la traduzione delle eliche transmembrana rispetto alla membrana avviene, come riflesso nei cambiamenti reciproci HDX osservati per i due termini all’interno di specifiche eliche transmembrana. Questo modello è coerente con il meccanismo “elevator-like” di accesso alternato, che implica una traduzione verticale di eliche transmembrana durante il ciclo di trasporto (Ryan e Vandenberg, 2016). In sintesi, HDX-MS ha fornito nuove intuizioni sulle transizioni strutturali coinvolte nell’accesso alternato, irraggiungibili dalle strutture precedentemente risolte dell’NhaA inattivo.

Effetto delle interazioni proteina-lipide sui paesaggi di conformazione dei trasportatori

La maggior parte dei trasportatori secondari appartiene alla superfamiglia dei facilitatori principali (MFS), condividendo un’architettura conservata nonostante le loro diverse funzioni (Radestock e Forrest, 2011). Sebbene le strutture cristalline dei membri di MFS siano disponibili, hanno fornito poche informazioni sulle interazioni proteina-lipide e sul loro effetto sull’equilibrio tra gli stati di e IF. Così, Martens et al. simulazioni MD combinate con HDX-MS per studiare gli effetti dell’ambiente lipidico su tre trasportatori ben caratterizzati: permease di lattosio, trasportatore di xilosio e antiporter di glicerolo-3-fosfato (Martens et al., 2018).

In primo luogo, una mutazione nota per spostare l’equilibrio verso lo stato è stata introdotta nel vestibolo extracellulare di tutti i trasportatori (Kumar et al., 2014). Confrontando il WT e i trasportatori mutati usando HDX-MS ha rivelato che il metodo rileva il cambiamento conformazionale, con regioni sul vestibolo extracellulare che occupano più deuterio nei mutanti rispetto al WT, mentre il contrario si verifica per i residui nel vestibolo intracellulare. Successivamente, i trasportatori sono stati ricostituiti in nanodischi composti da fosfatidilglicerolo, tetraoleil cardiolipina e fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina. È interessante notare che la presenza di fosfatidiletanolammina ha spostato l’equilibrio verso lo stato IF. Successivamente, le simulazioni MD dei trasportatori in doppi strati lipidici identici alla composizione dei nanodischi prevedevano interazioni dirette tra il gruppo principale di fosfatidiletanolammina carica e una rete citoplasmatica conservata di residui carichi, stabilizzando lo stato di (Doki et al., 2013). La mutazione dei residui caricati ha abolito l’effetto della fosfatidiletanolammina, suggerendo fortemente che specifiche interazioni fosfatidiletanolammina-proteina controllano l’equilibrio intrinseco dei trasportatori. Questo studio è un chiaro esempio di combinazione di metodi sperimentali e computazionali al fine di identificare interazioni sottili ma funzionalmente significative tra proteine e lipidi.

Svolgimento dell’elica durante il trasporto: Studi di LeuT

LeuT è un omologo procariotico della famiglia dei neurotrasmettitori / Na+ symporters (NSS), che include importanti bersagli farmacologici come i trasportatori di serotonina, dopamina e norepinefrina (Kristensen et al., 2011). LeuT è stato ampiamente studiato, e le sue strutture cristallografiche lungo il ciclo di trasporto sono disponibili (Focke et al., 2013). Queste strutture hanno suggerito che sono necessari riarrangiamenti strutturali su larga scala durante l’accesso alternato (Krishnamurthy e Gouaux, 2012). Tuttavia, il paesaggio conformazionale che consente la transizione tra gli stati IF e OF rimane elusivo e controverso.

Per studiare la transizione tra stati diversi, è stato studiato il LeuT detergente-solubilizzato in condizioni che favoriscono gli stati IF o OF (Merkle et al., 2018). Sorprendentemente, molti peptidi, principalmente sul lato intracellulare del trasportatore, hanno mostrato la cinetica EX1. Questo è piuttosto insolito nelle proteine piegate in condizioni native e considerato riflettere un dispiegamento a lungo termine di elementi della struttura secondaria. Sulla base della distribuzione spaziale dei peptidi che presentano cinetica EX1, insieme alle strutture cristallografiche disponibili, è stato proposto che le eliche specifiche subiscano uno svolgimento parziale durante l’accesso alternato e che questi cambiamenti conformazionali contribuiscano anche al rilascio del substrato. Questo studio evidenzia l’importanza funzionale dei cambiamenti conformazionali lenti (scala dei secondi) che possono essere ben risolti usando HDX-MS, in contrasto con altri metodi sperimentali o computazionali (ad esempio, MD).

Spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio delle proteine di membrana nei nanodischi lipidici

Le interazioni delle proteine di membrana con i lipidi circostanti possono modulare drasticamente la loro funzione (Vadas et al., 2017). In effetti, l’attività dei membri dell’NSS eucariotico dipende in modo significativo da specifiche interazioni lipidico-proteiche che modulano la dinamica proteica e, di conseguenza, le interazioni del substrato (Divito e Amara, 2009). Pertanto, Adhikary et al. LeuT studiato ricostituito in nanodischi fosfolipidi a doppio strato (Adhikary et al., 2017). Utilizzando questo approccio, LeuT è stato studiato in condizioni che favoriscono l’IF e delle conformazioni. Il confronto dei modelli HDX tra questi stati ha rivelato alterazioni specifiche in regioni precedentemente implicate nel ciclo di trasporto, riflettendo cambiamenti strutturali funzionalmente significativi. È interessante notare che i dati HDX-MS, coerenti con precedenti studi biofisici e computazionali, supportavano un angolo di inclinazione minore per la prima elica transmembrana nella conformazione IF rispetto a quello osservato nelle strutture cristalline. Questa differenza è stata attribuita all’ambiente lipidico, poiché la struttura cristallina è stata ottenuta in detersivo con una quantità minima di lipidi. Per riassumere, HDX-MS fornisce una piattaforma flessibile per studiare le proteine di membrana in diversi ambienti idrofobici e in condizioni che favoriscono specifici stati conformazionali, senza la necessità di etichettatura site-specific.

Interazioni ioniche con più siti: Lo scambiatore Na+/Ca2 +

NCX partecipa all’omeostasi cellulare di Ca2 + estrudendo Ca2 + dalle cellule contro il suo gradiente elettrochimico (Blaustein e Lederer, 1999). NCX scambia 3Na+: 1Ca2+, dove Na + e Ca2 + vengono trasportati in passaggi separati (Khananshvili, 1990). Sorprendentemente, la struttura cristallina di NCX da Methanocaldococcus jannaschii (NCX_Mj) ha rivelato quattro siti di legame ionico, simultaneamente occupati da tre ioni Na+ in siti chiamati Sint, Smid, Sext e uno ion Ca2+ in un sito chiamato SCa (Liao et al., 2012). Poiché questa modalità di legame era incoerente con studi precedenti, sono state eseguite simulazioni MD e analisi del flusso ionico dei mutanti, suggerendo che gli ioni Na + occupano Sint, SCa e Sext, mentre Ca2+ occupa SCa (Marinelli et al., 2014; Giladi et al., 2016b; Giladi et al., 2017; van Dijk et al., 2018). Pertanto, gli ioni Na+ e Ca2+ sono legati in modo reciprocamente esclusivo lungo il ciclo di trasporto.

Per stabilire sperimentalmente l’assegnazione dei siti di legame ionico, abbiamo confrontato lo stato apo con gli stati legati agli ioni di NCX_Mj usando HDX-MS (Giladi et al., 2016a; Giladi et al., 2017). Nonostante la bassa copertura della sequenza, la nostra analisi ha incluso 10 su 12 residui di coordinazione ionica. Abbiamo rilevato una diminuzione dipendente da Na+nell’assorbimento di deuterio a Sint, SCa e Sext, ma non Smid, mentre in presenza di Ca2+ la diminuzione dell’assorbimento di deuterio è stata osservata principalmente a SCa. Ciò è coerente con le previsioni fatte dalle simulazioni MD e dalle analisi mutazionali che prevedono l’occupazione di Smid da parte di una molecola d’acqua ma non da Na+ o Ca2+ nello stato fondamentale (Marinelli et al., 2014; Giladi et al., 2016a; Giladi et al., 2017; van Dijk et al., 2018). In particolare, successivi studi cristallografici hanno convalidato l’assegnazione dei nostri siti di legame (Liao et al., 2016). Pertanto, HDX-MS ha corroborato la modalità di legame ionico suggerita dagli studi computazionali e funzionali.

Selettività ionica di un mutante NCX trasportante Li+

Lo scambiatore mitocondriale Na+ / Ca2+ (NCLX) presenta un’eccezionale selettività ionica, scambiando Ca2+ con Na+ o Li+, mentre gli NCX non trasportano Li+ (Palty et al., 2010). Sebbene la rilevanza fisiologica di questa selettività ionica rimanga sconcertante, è notevole che 9 (su 12) residui di coordinazione ionica in NCLX differiscono da quelli in NCXs e altri membri della superfamiglia Ca2+/cation antiporter. Per capire come queste differenze influenzano il riconoscimento e il trasporto del legame ionico, abbiamo eseguito la sostituzione basata sulla struttura dei residui di coordinazione ionica in NCX_Mj per imitare i siti di legame NCLX (Refaeli et al., 2016). Sorprendentemente, il costrutto di nuova concezione (chiamato NCLX_Mj) media Na+/Ca2+ e Li+/Ca2+ con valori Km comparabili (Refaeli et al., 2016).

Successivamente, abbiamo cercato di determinare se i siti di legame ionico in NCLX_Mj ricordano quelli di NCX_Mj (Giladi et al., 2019). Le analisi HDX-MS dei cambiamenti conformazionali indotti da ioni hanno rivelato che SCa lega Na+, Li + o Ca2+, mentre uno o più siti Na+/Li+ aggiuntivi di NCLX_Mj sono incompatibili con i siti Na + originali (Sesta e Sint) assegnati a NCX_Mj. Questi risultati hanno suggerito che NCLX_Mj può trasportare ioni con una stechiometria elettroneutrale di 2Na+: 1Ca2+o 2Li+: 1Ca2+. Coerentemente con i dati HDX-MS, il serraggio della tensione accelera i tassi di cambio Na+/Ca2 + nei proteoliposomi ricostituiti NCX_Mj (a causa di una stechiometria di 3Na+:1Ca2+), mentre non ha alcun effetto apprezzabile sui tassi di cambio Na+/Ca2+ o Li+/Ca2+ in NCLX_Mj (Giladi et al., 2019).

I nostri studi hanno dimostrato l’utilità di HDX-MS nell’identificare e convalidare i siti di legame nei trasportatori di ioni, dove differenze relativamente piccole nei segnali ΔHDX indotti da ioni forniscono informazioni importanti sulla selettività ionica e sui cambiamenti conformazionali che si verificano al legame ionico in siti distinti. Pertanto, combinato con simulazioni MD e cristallografia a raggi X, HDX-MS è particolarmente attraente per chiarire i determinanti strutturali della selettività ionica e dei cambiamenti conformazionali indotti da ioni nei sistemi di trasporto di ioni che comprendono più siti di legame ionico.

Conclusioni

Negli ultimi decenni, la biologia strutturale ha enormemente contribuito alla nostra comprensione della funzione delle proteine di membrana, principalmente fornendo istantanee statiche di stati discreti in alta risoluzione. Per decifrare completamente le relazioni struttura-funzione alla base del complesso processo di trasporto del soluto, sono stati sviluppati un numero crescente di metodi sperimentali e computazionali per colmare il divario tra queste istantanee statiche e determinare i paesaggi conformazionali sottostanti. HDX-MS è sempre più utilizzato per studiare le proteine di membrana intatte in varie condizioni quasi native, fornendo nuove opportunità per studiare le interazioni membrana-proteina, il riconoscimento del substrato e le transizioni conformazionali correlate al trasporto. I futuri sviluppi nell’automazione della strumentazione e dell’analisi dei dati potrebbero consentire l’uso di HDX-MS in high-throughput, sfruttando appieno il suo potenziale utilizzo nella ricerca di base e nelle applicazioni biomediche come la progettazione di farmaci.

Contributi dell’autore

MG e DK hanno esaminato la letteratura e scritto il manoscritto.

Finanziamento

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Israel Science Foundation (Grant #1351/18) (D. K) e dalla Israel Cancer Research Foundation (Grant #19202) (MG). Il sostegno finanziario del premio Shmuel Shalit a DK è riconosciuto con gratitudine.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretati come un potenziale conflitto di interessi.