Frontiers in Microbiology

Interazione ospite-specifica tra il rizobio e i partner vegetali

I batteri che formano una simbiosi azotofissante con piante leguminose appartenenti a diversi gruppi di α-e β-proteobatteri sono collettivamente chiamati rhizobia (Chen et al., 2003; MacLean et al., 2007). Molti α-proteobatteri sono impegnati in interazioni a lungo termine con eucarioti più alti. Queste interazioni vanno dalla colonizzazione superficiale attraverso relazioni simbiotiche facoltative per obbligare gli stili di vita patogeni intracellulari o endosimbionti. I geni simbiotici necessari per la formazione di noduli, l’infezione delle cellule ospiti e la fissazione dell’azoto sono stati acquisiti dal trasferimento genico laterale che è la fonte primaria della diversità genetica di rhizobia. Pertanto, la rhizobia potrebbe essere più strettamente correlata agli agenti patogeni (come Agrobacterium o Brucella) che tra loro. Rhizobia tendono ad avere genomi di grandi dimensioni (fino a 10.5 Mbp) che in rapida crescita rhizobia sono dispersi su repliconi multipli (MacLean et al., 2007). Ad esempio, Sinorhizobium meliloti, l’endosimbionte delle specie Medicago, ha un genoma tripartito; un cromosoma 3.65 Mbp e due megaplasmidi, pSymA e pSymB (1.35 e 1.68 Mbp) entrambi indispensabili e portano la maggior parte dei geni simbiotici. Tuttavia, molti ceppi di S. meliloti contengono ulteriori plasmidi ausiliari di medie dimensioni e quindi, il genoma di S. meliloti può contenere fino a 9.000 geni (Barnett et al., 2001; Capela et al., 2001). A differenza della rhizobia, gli endosimbionti obbligati degli insetti di solito possiedono un genoma fortemente ridotto (160-450 Kbp) che garantisce la loro moltiplicazione e codici per alcune specifiche vie biosintetiche comprese quelle che soddisfano il bisogno dell’ospite (Moran et al., 2008; Price et al., 2011). Questi genomi incredibilmente ridotti sono tuttavia amplificati compensando il genoma diminuito con un contenuto di DNA poliploide.

I partner vegetali di rhizobia appartengono alla famiglia Leguminosae/Fabaceae. La simbiosi di fissaggio dell’azoto si è evoluta in diversi lignaggi, ma non tutti i legumi formano simbiosi. Finora sono note 12.000 specie di leguminose nodulate e ognuna ha il proprio partner Rhizobium. La simbiosi è innescata dalla fame di azoto della pianta ospite che deve selezionare il suo partner Rhizobium da miliardi di batteri nella rizosfera. Ciò è ottenuto dalla secrezione di molecole di segnale flavonoidi dalla radice che agiscono come chemio-attrattivi ma soprattutto come induttori dei geni di nodulazione del Rhizobium (Oldroyd, 2013). Questi geni sono necessari per la produzione di molecole di segnale batterico; i fattori Nod (NFs) che innescano il programma di sviluppo del nodulo nella pianta ospite (Walker e Downie, 2000). Le NFS sono molecole lipochitooligosaccharide che trasportano sostituzioni specifiche dell’ospite sui residui di zucchero terminali e sulle catene lipidiche caratteristiche, che sono riconosciute dai recettori ospiti di tipo LysM e sono necessarie sia per lo sviluppo di noduli che per l’infezione batterica. È interessante notare che l’antica simbiosi delle piante terrestri con funghi micorrizici arbuscolari (AM) opera con molecole di segnale lipochitooligosaccharide simili, i fattori Myc che sono percepiti da recettori di tipo LysM simili ma diversi come NFs (Abdel-Lateif et al., 2012; Oldroyd, 2013). I fattori Myc e NFs attivano una via di segnalazione comune ma dopo il coinvolgimento dei geni simbiotici comuni conservati nelle piante, i percorsi si discostano; uno che porta alla nodulazione, l’altro per la simbiosi AM.

L’infezione delle piante e la formazione di noduli sono processi intricati; I fattori di Nod svolgono ruoli distinti nell’organogenesi del nodulo e nell’infezione dei capelli della radice. Inoltre, oltre ai fattori Nod, vari polisaccaridi superficiali batterici sono cruciali per un’infezione efficiente (Fraysse et al., 2003). Nella maggior parte dei legumi, la rhizobia entra nell’ospite attraverso i peli della radice dove per invaginazione della membrana plasmatica si forma un filo di infezione (IT) che contiene i batteri moltiplicatori e cresce verso la corteccia della radice. Una modalità di infezione meno frequente e antica si verifica attraverso crepe sulla superficie della radice di alcuni legumi.

Sviluppo di noduli determinato e indeterminato

Lo sviluppo di noduli richiede la riattivazione mitotica delle cellule corticali che porta alla formazione di noduli primordiali che poi si differenziano in noduli radicali che fissano l’azoto fornendo condizioni microaerobiche nella zona centrale per il funzionamento dell’enzima nitrogenasi sensibile all’ossigeno nei batterioidi. A seconda della natura transitoria e persistente della proliferazione delle cellule ospiti, i noduli possono essere di tipo determinato o indeterminato (Terpolilli et al., 2012; Kondorosi et al., 2013). I noduli determinati non hanno meristema e contengono una popolazione omogenea di cellule simbiotiche. Noduli determinati si sviluppano ad esempio sulle radici di Phaseolus vulgaris e Lotus japonicus.

Al contrario, la divisione cellulare attiva viene mantenuta nei noduli indeterminati. Un meristema nodulare è presente nella regione apicale (zona I) che con la generazione costante di nuove cellule provoca una crescita continua e una forma allungata del nodulo. Le cellule che lasciano il meristema non si dividono più ed entrano in una fase di differenziazione. Il filo di infezione rilascia i batteri nelle cellule sommeristematiche, che si differenziano gradualmente lungo gli strati di cellule 12-15 della zona di infezione (zona II), portando allo sviluppo di cellule simbiotiche che fissano l’azoto nella zona del nodulo III (Figura 1; Franssen et al., 1992). Medicago sativa, M. truncatula, Vicia sativa e Pisum sativum sono esempi di piante che formano noduli indeterminati.

La crescita delle cellule simbiotiche comporta l’amplificazione del genoma ospite mediante cicli di endoreduplicazione

L’allargamento estremo delle cellule vegetali può essere osservato sia nei noduli determinati che indeterminati. Il citoplasma di una cellula simbiotica che fissa l’azoto ospita circa 50.000 batterioidi. Per ospitare un numero così elevato di endosimbionti, le cellule ospiti crescono. Nei noduli di M. truncatula il volume delle cellule che fissano l’azoto è 80 volte più grande di quello delle cellule meristematiche diploidi. La crescita delle cellule infette avviene gradualmente nella zona II ed è la conseguenza della ripetuta endoreduplicazione (ER) del genoma senza mitosi. Nella zona II il macchinario del ciclo cellulare è ancora attivo, ma la mancanza di cicline mitotiche inibisce la mitosi e trasforma i cicli mitotici in cicli di endoreduplicazione (Cebolla et al., 1999). Ciò è ottenuto dalla proteina CCS52A dell’interruttore del ciclo cellulare che con la distruzione delle cicline mitotiche induce ripetuti cicli di duplicazione del genoma che portano alla formazione di cellule poliploidi a crescita graduale (Roudier et al., 2003; Kondorosi e Kondorosi, 2004). Nelle specie Medicago i livelli di ploidy possono raggiungere 64C che rappresentano un contenuto di DNA 64 volte superiore rispetto alle cellule aploidi (C corrisponde al contenuto di DNA aploide; Vinardell et al., 2003). La down-regolazione di CCS52A in M. truncatula non ha avuto alcun effetto sulla formazione del primordio, ma è stata dannosa per la differenziazione dei noduli, indicando che i cicli ER e la formazione di grandi cellule altamente poliploidi sono essenziali per il funzionamento dei noduli (Vinardell et al., 2003). È interessante notare che le cellule corticali contenenti funghi AM sono anche poliploidi, così come le cellule radicali giganti che alimentano i nematodi (Favery et al., 2002; Genere et al., 2008). Allo stesso modo, le cellule simbiotiche degli insetti, i batteriociti che ospitano endosimbionti intracellulari sono anche grandi e poliploidi (Nakabachi et al., 2010). Nelle piante angiosperme, la poliploidia è frequente e lo specifico modello ereditario della poliploidia in diversi organi, tessuti e tipi di cellule suggerisce che potrebbe essere una fonte importante della fisiologia specializzata delle cellule ospiti (Nagl, 1976; Edgar et al., 2014). Oltre alla crescita cellulare, le copie multiple del gene, la mancanza di condensazione cromosomica può contribuire ad attività trascrizionali e metaboliche più elevate. Tuttavia, l’associazione della poliploidia con diverse funzioni cellulari suggerisce un impatto della poliploidia anche sull’architettura dei nucleosomi e sull’epigenoma che controlla l’attivazione o la repressione di specifiche regioni genomiche. Di conseguenza, il contenuto del genoma poliploide delle cellule simbiotiche sembra essere un prerequisito per la differenziazione dei noduli e per l’espressione della maggior parte dei geni ospiti simbiotici (Maunoury et al., 2010).

Diversi destini di batteri che fissano l’azoto

I batteri rilasciati dall’IT sono presenti nel citoplasma ospite come strutture organelliche, chiamate simbiosomi. I batteri non hanno alcun contatto diretto con il citoplasma in quanto sono circondati da una membrana peribacteroide, nota anche come membrana simbiosoma (SM). Il bacteroide, l’SM e lo spazio tra di loro comprendono il simbiosoma (Catalano et al., 2004). L’SM durante la sua formazione riflette la sua origine della membrana plasmatica, le successive modifiche della sua composizione aprono nuovi ruoli specializzati nell’interfaccia host-endosimbiont (Limpens et al., 2009; Ivanov et al., 2012; Brear et al., 2013; Sinharoy et al., 2013). I bacteroids si moltiplicano nelle cellule crescenti del nodulo ospite ad una determinata densità delle cellule, si adattano allo stile di vita endosymbiotic ed alle circostanze microaerobic e maturano ai bacteroids azoto-fissanti. La forma e la fisiologia dei batterioidi possono essere, tuttavia, sorprendentemente diverse nei vari legumi. In alcuni ospiti di legumi, i bacteroidi che fissano l’azoto hanno la stessa morfologia delle cellule coltivate; questo tipo di bacteroidi può tornare alla forma di vita libera. In altre associazioni, i batterioidi sono irreversibilmente trasformati in endosimbionti poliploidi, ingrossati, non coltivabili. Questi batterioidi terminali differenziati possono essere allungati e persino ramificati e da 5 a 10 volte più lunghi delle cellule viventi libere o possono essere sferici da 8 ad almeno 20 volte il genoma amplificato a seconda dell’ospite (Mergaert et al., 2006; Nakabachi et al., 2010). La differenziazione terminale dei batterioidi è controllata dall’ospite, evoluta in più rami della famiglia delle leguminose, indicando il vantaggio dell’ospite e probabilmente prestazioni simbiotiche più elevate (Oono et al., 2010). La differenziazione batteroide terminale è la migliore chiarita nella simbiosi di S. meliloti-M. truncatula. In M. noduli truncatula, gli eventi più visibili di differenziazione batterioide terminale si verificano nella zona II. Moltiplicazione dei batterioidi si ferma nel mezzo della zona II dove l’allungamento cellulare e l’amplificazione uniforme dei repliconi multipli da endoreduplication cicli iniziano. Lungo 2-3 strati cellulari al confine della zona II e III (chiamato interzone) la crescita improvvisa di batterioidi è visibile raggiungendo praticamente la loro dimensione finale, tuttavia, la fissazione dell’azoto avviene solo nella zona III.

I peptidi ospiti governano la differenziazione dei batterioidi

Il confronto dei trascrittomi nodulari dei legumi con differenziazione dei batterioidi reversibile e irreversibile ha rivelato l’esistenza di diverse centinaia di piccoli geni che erano presenti solo nel genoma di quelle piante ospiti in cui la differenziazione dei batterioidi era terminale. In M. truncatula le cellule nodulari producono almeno 600 peptidi simbiotici noduli-specifici (symPEPs). I geni symPEP sono attivati solo nelle cellule simbiotiche poliploidi infette da S. meliloti (Kevei et al., 2002; Mergaert et al., 2003), tuttavia alcuni set in precedenza, altri durante le fasi successive dello sviluppo del nodulo. Una grande porzione, più di 500 geni codificano peptidi ricchi di cisteina (NCR) nodulo-specifici (Mergaert et al., 2003; Alunni et al., 2007; Nallu et al., 2014). I peptidi NCR sono mirati ai batterioidi e quando la loro consegna agli endosimbionti è stata bloccata, la differenziazione dei batterioidi è stata abolita dimostrando che i peptidi sono responsabili della differenziazione terminale dei batterioidi di S. meliloti (Van de Velde et al., 2010). La varietà ad alta sequenza e i modelli di espressione caratteristica dei geni NCR suggeriscono la diversità nelle loro funzioni, modalità di azione e bersagli batterici a diversi stadi di maturazione dei batteri (Figura 2). Tuttavia, perché la cellula ospite produce un arsenale di NCRS? Quale può essere il vantaggio di un repertorio peptidico così diversificato? È necessario per l’interazione dell’ospite con vari batteri? I partner simbiotici di M. truncatula sono S. meliloti e S. medicae, tuttavia nel terreno ci sono innumerevoli varianti di ceppo di entrambe le specie. M. truncatula è anche rappresentato da molti diversi ecotipi e adesioni che differiscono nel numero, nelle sequenze e nel profilo di espressione dei geni NCR e nelle loro interazioni simbiotiche con diversi ceppi di S. meliloti e S. medicae (Nallu et al., 2014; Roux et al., 2014). Mentre un nodulo contiene un singolo tipo di batterio, i diversi noduli sullo stesso apparato radicale possono possedere popolazioni batteriche distinte. È possibile che la pianta che riconosce i vari endosimbionti li manipoli con un repertorio ceppo-specifico di peptidi. Queste differenze possono aggiungere un ulteriore livello di controllo per la specificità ospite-simbionte e quindi per l’efficienza della nodulazione.

Sebbene i symPEPs rappresentino classi peptidiche uniche, le loro strutture assomigliano ai peptidi antimicrobici (AMPs). Gli AMPLIFICATORI con ampio spettro di attività microbica di uccisione delle cellule sono più frequentemente cationici provocando la morte cellulare per formazione di pori, interruzione della membrana e conseguente lisi delle cellule microbiche. Il fatto che la capacità di divisione cellulare sia definitivamente persa durante la differenziazione endosimbionta indica che almeno alcuni symPEPs hanno attività antimicrobiche. Il trattamento dei batteri con NCRS cationici sintetici ha infatti provocato una rapida ed efficiente eliminazione dose-dipendente di vari batteri Gram-negativi e Gram-positivi, inclusi importanti patogeni umani e vegetali (Van de Velde et al., 2010; Tiricz et al., 2013). Questo effetto di ex-planta killing correlato alla permeabilizzazione delle membrane microbiche, tuttavia, i symPEPs nel loro ambiente naturale – nelle cellule dei noduli-non permeabilizzano le membrane batteriche e non uccidono gli endosimbionti. Molto probabilmente le concentrazioni di peptide nei noduli sono significativamente inferiori a quelle applicate nei test in vitro. Inoltre i peptidi cationici sono prodotti insieme ai peptidi anionici e neutri nella stessa cellula e la possibile combinazione di poche decine o centinaia di peptidi con varie cariche e idrofobicità potrebbe neutralizzare l’effetto battericida diretto dei peptidi cationici.

Il coinvolgimento di AMP o peptidi simili ad AMP non è unico per la simbiosi Rhizobium-legume. Nel punteruolo sitofilo, le cellule simbiotiche producono il peptide antimicrobico coleoptericina – A (ColA) che provoca lo sviluppo di endosimbionti filamentosi giganti inibendo la divisione cellulare e protegge i tessuti degli insetti vicini dall’invasione batterica (Login et al., 2011). In questo sistema un singolo peptide è sufficiente per la differenziazione dell’endosimbionte obbligato trasmesso verticalmente a differenza dei noduli che operano con centinaia di symPEPs e possono ospitare innumerevoli varianti di ceppo come loro endosimbionti. Nella simbiosi afide-Buchnera, le cellule ospiti producono anche peptidi specifici per batteriociti inclusi peptidi ricchi di cisteina (BCR) che assomigliano ai peptidi Medicago NCR, tuttavia le funzioni di questi peptidi simbiotici non sono state ancora riportate (Shigenobu e Stern, 2013).

NCR247: Un esempio per l’effettuatore host multi-target

Analisi del trascrittoma di M. noduli truncatula in diverse fasi del loro sviluppo, microdissezione laser delle regioni nodulari, ibridazione in situ, immunolocalizzazione di peptidi selezionati e fusioni di geni promotore-reporter symPEP in noduli transgenici consentono di mappare l’azione dei singoli peptidi nelle cellule simbiotiche dall’infezione precoce fino allo stato di fissazione tardiva dell’azoto. NCR247 è espresso negli strati cellulari più vecchi della zona II e nell’interzone dove la divisione cellulare batterica si ferma e si verifica un notevole allungamento degli endosimbionti (Farkas et al., 2014). Questo piccolo peptide cationico ha efficacemente ucciso vari microbi in vitro e l’analisi in silico ha indicato le sue estreme capacità di legame proteico. NCR247 marcato con FITC è entrato nel citosol batterico dove le sue interazioni con numerose proteine batteriche erano possibili. I partner vincolanti sono stati identificati mediante trattamento di batteri o batteri di S. meliloti con peptidi StrepII/FLAG-tagged seguiti da cromatografia di affinità e identificazione di partner interagenti con LC-MS / MS e analisi occidentale (Farkas et al., 2014).

Uno degli interattori era la proteina di divisione cellulare FtsZ che svolgeva un ruolo primario cruciale nella divisione cellulare. Un certo numero di peptidi antibiotici è noto per esercitare un effetto battericida o batteriostatico attraverso l’interazione con FtsZ, inibendo la sua polimerizzazione ostacolando così la corretta formazione di Z-ring e setto (Handler et al., 2008). NCR247 è stato co-purificato con FtsZ dal citoplasma batterico ed è stato dimostrato di interrompere la formazione del setto. NCR035 esibendo in vitro anche l’effetto battericida e prodotto nelle stesse cellule simbiotiche come NCR247 si accumula al setto di divisione che indica l’azione simultanea o consecutiva di questi peptidi e l’evoluzione delle strategie multiple dell’ospite per inibire la proliferazione di endosymbiont. Un altro studio ha dimostrato che l’espressione di importanti geni di divisione cellulare, inclusi i geni necessari per la funzione dell’anello Z, erano fortemente attenuati nelle cellule trattate da NCR247 (Penterman et al., 2014). Il pretrattamento di batteri con concentrazioni sub-letali di NCR247 ha abolito la localizzazione di FITC-NCR035 al setto e ha provocato l’allungamento cellulare (Farkas et al., 2014).

Le proteine ribosomiali erano i partner interagenti NCR247 più abbondanti. NCR247 è stato osservato per inibire fortemente la sintesi proteica batterica in modo dose-dipendente sia in vivo che in vitro (Farkas et al., 2014). Questi risultati hanno suggerito che una modalità dell’azione peptidica NCR247 si lega ai ribosomi sia nelle cellule batteriche che nei batterioidi. È interessante notare che nei batterioidi sono stati osservati un modello alterato e una ridotta complessità delle proteine interagenti. Di conseguenza il livello generale di espressione delle proteine ribosomiali era in media 20 volte inferiore nei batteroidi rispetto alle cellule viventi libere con diversa abbondanza relativa di trascritti delle singole proteine ribosomiali. La diversificazione dei ribosomi nei batterioidi può avere un ruolo significativo contribuendo alla traduzione avanzata di proteine specifiche, supportando così la fisiologia specializzata e energivora della funzione di fissazione dell’azoto altamente abbondante.

Lo chaperon GroEL era anche un partner interagente diretto di NCR247 (Farkas et al., 2014). Delle 5 proteine di GroEL, GroEL1 o GroEL2 è sufficiente per la sopravvivenza mentre GroEL1 espresso ad alto livello nel nodulo è essenziale per la simbiosi (Bittner et al., 2007). È necessario per l’attivazione completa dei geni di nodulazione e l’assemblaggio del complesso nitrogenasi. GroEL possiede un’estrema versatilità funzionale interagendo con centinaia di proteine. L’interazione NCR247-GroEL1 può avere conseguenze direttamente su GroEL ma indirettamente anche sui substrati di GroEL e sui processi biologici associati. L’assenza di GroEL1 ha influenzato gravemente l’infezione batterica e il mantenimento e la differenziazione dei batterioidi che dimostrano una necessità generale di GroEL1 in tutte le fasi dello sviluppo del nodulo di fissaggio dell’azoto.

Il coinvolgimento di Groel e peptidi ospiti nelle interazioni microbo-ospite non è unico per la simbiosi Rhizobium-legume. Nelle cellule simbiotiche del punteruolo la coleottericina-A (ColA) interagisce anche con GroEL (Login et al., 2011). GroEL svolge anche un ruolo importante nel mantenimento degli endosimbionti (Moran, 1996; Kupper et al., 2014). Poiché la maggior parte dei sistemi simbiotici sono ancora inesplorati e gli strumenti genomici e proteomici ad alto rendimento sono disponibili solo di recente, possiamo solo prevedere che la differenziazione endosimbionta mediata dai peptidi ospiti, allo stesso modo l’amplificazione del genoma delle cellule ospiti e gli endosimbionti terminali differenziati sono strategie generali di simbiosi.

Conclusione

I batteri simbiotici e patogeni usano approcci simili per interagire con i loro ospiti e sopravvivere all’interno delle cellule ospiti, anche se i risultati di queste interazioni sono sorprendentemente diversi. Piante e animali possono generare risposte immunitarie innate ai microrganismi sulla percezione di MAMPs (modelli molecolari associati a microrganismi). Questa percezione si traduce nell’attivazione di cascate di segnalazione e nella produzione di effettori antimicrobici. Peptidi ospite AMP-like come il M. i peptidi di truncatula NCR o il peptide antimicrobico del punteruolo ColA svolgono ruoli chiave e sfaccettati nel controllo della moltiplicazione e della differenziazione degli endosimbionti, limitando così la presenza di batteri alle cellule simbiotiche. Pertanto, gli organismi ospiti utilizzano questi peptidi effettori per domare e persino assumere invasori microbici selezionati per il servizio.

Dichiarazione sul conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Il lavoro nei nostri laboratori è supportato dalla sovvenzione avanzata”SYM-BIOTICS” del Consiglio Europeo della ricerca a Éva Kondorosi (sovvenzione numero 269067) e da TÁMOP-4.2.2.A-11/1 / KONV-2012-0035 sostenuto dall’Unione Europea e cofinanziato dal Fondo Sociale Europeo.il suo nome deriva dal nome della città, che si trova nella parte sud-occidentale del paese. Il ruolo dei flavonoidi nella creazione di endosymbioses radici delle piante con funghi micorriza arbuscular, rhizobia e batteri Frankia. Segnale impianto. Comportati bene. 7, 636–641. doi: 10.4161 / psb.20039

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