Sperimentale
Etichettatura di RuBisCo:
Aedans(454): donatore F(58): accettore
Associazione Studi:
Condizioni:
ADP di proiettile: GroEL complesso associato a GroES e ADP
ApoGroEL: Solo GroEL complessi (utilizzato in associazione precedenti studi di RuBisCo substrato)
Lin et al. determinato che:
1. C’era una differenza nel FRET sul legame del substrato con l’anello trans del proiettile ADP rispetto all’anello apoGroEL.
– Questo è stato evidente da tempra di fluorescenza donatore (B.)
– Questo indicava una differenza nella conformazione del substrato proteico.
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2. Trovato un dispiegamento “passivo” delle proteine del substrato legate all’anello di apoGroEL.
– Tuttavia, questo dispiegamento si è verificato molto più lentamente del ciclo di reazione funzionale di GroEL.
3. C’è meno” passivo ” dispiegamento del substrato legato ad ADP proiettile trans-ring.
– Confermato questo con studi di digestione della proteasi.
– Tuttavia, questo è il complesso più fisiologicamente rilevante.
– Quindi questo è un livello massimamente efficace, o solo il primo passo nel ciclo di reazione?
Per testare la rilevanza fisiologica, hanno aggiunto ATP alla reazione Bullet ADP e hanno monitorato FRET
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Dopo l’aggiunta di ATP, hanno trovato: – Un primo rapido, costretto conformazione di espansione del substrato – e poi una lenta fase di compattazione – Evidente nella Figura b |
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-Figura c indica che la cinetica della fase di compattazione isdependent su GroES concentrazione, il che significa che è dipendente
thesequestration meccanismo del complesso.
– Mentre la fase di espansione è indipendente dalla concentrazione GroES.
Concluso ci sono due fasi di dispiegamento:
– Lento dispiegamento passivo a causa del legame del substrato all’anello trans della camera di GroEL(dal primo esperimento di legame)
– Rapido, ATP guidato dispiegamento a causa del cambiamento di conformazione della camera di GroEL.
Lo spiegamento rapido non dipende da GroES:
– Un eccesso di una variante GroEL a anello singolo, SR1 è stato usato come trappola GroES.
– SR1 non è in grado di legare substrato e catalizzare una reazione dispiegarsi,ma è in grado di legare e sequestrare GroES per determinare la dipendenza della reazione sul sequestro del substrato.
– Hanno stabilito che il rapido dispiegamento monitered da FRET occuredwithout il tappo GroES presente, e la successiva fase di compattazione didnot.
– Ciò indica che la fase di espansione rapida dipende dal cambiamento di conformazione di GroEL indotto dal legame ATP.
So .. lo svolgimento del substrato è necessario per la piegatura produttiva?
– È questo un passo essenziale, e importante per GroEL / GroES meccanismo di piegatura?
-Hanno scoperto che la frazione di RuBisCo non nativo che emerge inlo stato nativo è proporzionale all’estensione dello svolgimento.
– Per esaminare questo , volevano misurare il lento, passivo dispiegamento del substrato a causa di GroEL binding da solo(non ATP
dipendente)
-Hanno nuovamente utilizzato SR1 legame al substrato, questa volta non come atrap, ma come un sito di legame passivo-dispiegamento per il substrato.
– Il tempo di incubazione con SR1 è correlato alla quantità di dispiegamento, poiché lo spiegamento è dovuto SOLO al legame del substrato.
– Hanno determinato che esiste una correlazione tra la quantità di dispiegamento di proteine native.
– Quindi lo spiegamento forzato di GroEL/GroES è un modo efficace per promuovere il meccanismo di spiegamento necessario per una corretta piegatura delle proteine.
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