2 Formazione HzB
Gli HzB sono composti da Hb ossidato denaturato. Spesso non sono riconosciuti su film di sangue macchiati di routine, perché non sono macchiati o macchiati in modo simile al restante Hb intatto. Se sono di dimensioni sufficienti (da 1 a 2 µm), possono apparire come inclusioni pallide all’interno dei globuli rossi o come proiezioni simili a capezzoli dalla superficie dei globuli rossi. HzB può essere visualizzato come inclusioni scure e rifrattili in nuovi preparati “bagnati” di blu di metilene e come inclusioni blu chiaro con macchie reticolocitarie (Harvey, 2001).
Viene proposta la seguente sequenza di eventi biochimici innescati dall’ossidante che portano alla formazione di HzB (Allen e Jandl, 1961; Chiu e Lubin, 1989; Hebbel e Eaton, 1989; Low, 1989; Mawatari e Murakami, 2004): (1) i ferrohemes sono ossidati a ferrihemes (MetHb). (2) I gruppi SH reattivi di MetHb sono ossidati (cisteina 93 della catena umana Hb β) e si formano legami disolfuro misti dopo l’interazione con GSSG (generato anche in risposta allo stress ossidativo). Questa glutationilazione di MetHb può essere protettiva, perché questi gruppi globinici SH possono essere rigenerati attraverso i sistemi glutaredossina e possibilmente tioredossina (Klatt e Lamas, 2000). (3) Man mano che l’ulteriore ossidazione continua, normalmente i gruppi SH “sepolti” di MetHb vengono ossidati causando ulteriori reazioni di glutationilazione e presumibilmente la formazione di legami disolfuro tra catene globiniche. Queste reazioni probabilmente non sono reversibili (Mawatari e Murakami, 2004). (4) I cambiamenti conformazionali nelle catene globiniche provocano la dissociazione del tetramero in dimeri e monomeri e formazione di emicromi (gli emicromi hanno sia la quinta che la sesta posizione delle coordinate del ferro ferrico occupate da un ligando fornito dalla catena globinica). (5) Gli emicromi si legano alla banda 3 e, in misura minore, ad altri componenti della membrana, formando gruppi di copolimeri. (6) La precipitazione e l’accumulo di molecole di globina denaturate provocano la formazione di HzB. La precipitazione è potenziata dalla dissociazione delle porzioni di ferriheme (hemin) dagli emicromi perché le catene globiniche libere risultanti sono instabili.
Le anemie emolitiche associate alla formazione di HzB negli animali domestici sono il risultato di una varietà di composti. Le cause dietetiche includono il consumo di cipolle da parte del bestiame (Lincoln et al., 1992), sheep (Kirk e Bulgin, 1979; Knight et al., 2000; Verhoeff et al., 1985), cavalli (Pierce et al., 1972), gatti (Kobayashi, 1981) e cani (Harvey e Rackear, 1985; Ogawa et al., 1986), consumo di aglio da cani e cavalli (Lee et al., 2000; Pearson et al., 2005; Yamato et al., 2005), e il consumo di cavoli e altre specie di Brassica da parte dei ruminanti (Greenhalgh et al., 1969; Smith, 1980; Suttle et al., 1987). Dipropil e diallil di-, tri-e tetrasolfuri e possibilmente altri composti organosolfur derivati da piante del genere Allium (cipolle, aglio ed erba cipollina) causano danni ossidativi ai globuli rossi. I ROS si formano durante il riciclaggio redox di questi composti o dei loro metaboliti in presenza di GSH e OxyHb (Munday et al., 2003). Il ruolo del GSH come fonte di elettroni in questo ciclo redox può spiegare perché i cani con alte concentrazioni di GSH RBC sono più suscettibili al danno RBC indotto dalla cipolla rispetto ai cani con normali concentrazioni di GSH RBC (Yamoto e Maede, 1992). Nel caso delle specie Brassica, il fattore emolitico è segnalato come dimetil disolfuro, prodotto dall’azione dei microbi del rumine sul solfossido di S-metilcisteina contenuto all’interno delle piante (Smith, 1980).
L’anemia emolitica HzB si verifica in Florida nei bovini che pascolano su pascoli lussureggianti di segale (Secale cereale) in inverno (Simpson e Anderson, 1980) e nei bovini carenti di selenio che pascolano sui pascoli di erba di St. Augustine in estate (Morris et al., 1984). La natura degli ossidanti coinvolti è sconosciuta. Metaemoglobinemia, formazione di HzB, emolisi intravascolare grave e morte hanno seguito il consumo di foglie di acero rosso da parte dei cavalli (Alward et al., 2006; George et al., 1982; Tennant et al., 1981) e alpaca (Dewitt et al., 2004). Le foglie appassite o secche sono tossiche, ma le foglie appena raccolte non lo sono. L’acido gallico e altri composti sono stati identificati nelle foglie che sono in grado di indurre danni ossidativi (Boyer et al., 2002).
L’emoglobinuria postpartimentale con formazione di HzB si verifica nei bovini in Nuova Zelanda che pascolano principalmente su loglio perenne (Lolium perenne) (Martinovich e Woodhouse, 1971). Il bestiame postparturient può essere più suscettibile allo sviluppo di anemia perché il consumo di alimento aumentato connesso con lattazione ha potuto aumentare l’esposizione ad un ossidante dietetico non identificato. Sia ipocuprosi (Gardner et al., 1976) e ipofosfatemia (Jubb et al., 1990) sono stati considerati per contribuire alla gravità dell’anemia in questi bovini. Una sindrome apparentemente diversa di emoglobinuria postpartimentale è stata riportata anche nei bovini ipofosfatemici del Nord America (MacWilliams et al., 1982). HzB non è stato riportato in animali affetti, e l’anemia sembra svilupparsi perché gli animali affetti hanno diminuito le concentrazioni di ATP RBC (Ogawa et al., 1987, 1989).
La metaemoglobinemia e l’anemia emolitica HzB si verificano acutamente quando grandi quantità di rame vengono rilasciate dal fegato dei ruminanti che hanno accumulato quantità eccessive di rame epatico secondario ad un aumento dell’assunzione alimentare (Brewer, 1987; Kerr e McGavin, 1991; Soli e Froslie, 1977). La tossicità dello zinco è dovuta principalmente al consumo e alla ritenzione di oggetti contenenti zinco nello stomaco dei cani. Le fonti di zinco includono penny statunitensi coniati dopo il 1982, hardware metallico, giocattoli e unguento contenente ossido di zinco (Bexfield et al., 2007; Breitschwerdt et al., 1986). Il meccanismo(s) con cui lo zinco produce anemia emolitica non è chiaro, ma HzB sono stati riconosciuti in alcuni casi clinici (Bexfield et al., 2007; Hammond et al. Nel 2004, Harvey, 2001, Houston e Myers, 1993, Luttgen et al., 1990). L’anemia di HzB è stata anche riportata in un cane a seguito di una possibile ingestione di naftalene (Desnoyers e Hebert, 1995).
Casi clinici di anemie emolitiche HzB si sono verificati dopo la somministrazione di una varietà di farmaci tra cui blu di metilene nei gatti (Schechter et al., 1973) e cani (Fingeroth e Smeak, 1988; Osuna et al., 1990), fenazopiridina in un gatto (Harvey e Kornick, 1976), paracetamolo nei gatti (Finco et al., 1975; Gaunt et al., 1981; Hjelle e Grauer, 1986) e cani (Harvey et al., 1986; Houston e Myers, 1993), metionina nei gatti (Maede et al., 1987), menadione (vitamina K3) nei cani (Fernandez et al., 1984), e fenotiazina nei cavalli (McSherry et al., 1966). L’applicazione della benzocaina alla pelle infiammata del cane può provocare la metaemoglobinemia e la formazione del corpo di Heinz (Harvey et al., 1979). L’anemia emolitica del corpo di Heinz è stata riportata in un cane che era stato spruzzato con muschio skunk (Zaks et al., 2005). Una varietà di ossidanti aggiuntivi produce anemie emolitiche HzB sperimentalmente negli animali (Fertman e Fertman, 1955).
I gatti sono generalmente riconosciuti come le specie più sensibili alla formazione di HzB. Sebbene le differenze di specie nel metabolismo e nell’escrezione di vari farmaci possano parzialmente spiegare questa maggiore suscettibilità, l’Hb di gatto appare generalmente più suscettibile alla denaturazione ossidativa rispetto all’Hbs di altre specie (Harvey e Kaneko, 1976b). La presenza di 8-10 gruppi SH reattivi per tetramero Hb in cat Hb può renderlo più suscettibile all’ossidazione (Mauk e Taketa, 1972); apparentemente nessuna altra specie ha più di 4 gruppi SH reattivi per tetramero (Snow, 1962).
Gli HzB sono raramente riconosciuti nei globuli rossi della maggior parte delle specie, ma sono spesso presenti nei globuli rossi del gatto a causa della suscettibilità dell’HB del gatto a formare HzB, combinata con una scarsa capacità della milza del gatto di rimuovere l’HzB dai globuli rossi (Jain, 1986). Anche i gatti normali possono avere un basso numero di HzB (<5%) e un aumento del numero di HzB è stato osservato nei gattini alimentati con diete a base di pesce (Hickman et al., 1990), in gatti nutriti con diete commerciali morbide e umide contenenti glicole propilenico (Christopher et al., 1989; Hickman et al., 1990), e nei gatti nutriti alimenti per l’infanzia contenenti polvere di cipolla (Robertson et al., 1998). L’aumento della formazione di HzB può verificarsi nei gatti con anestesia ripetuta di propofol (Andress et al., 1995; Matthews et al., 2004). L’aumento dei numeri di HzB è stato documentato anche nei gatti con diabete mellito, ipertiroidismo e linfoma (Christopher, 1989). I gatti diabetici con chetoacidosi hanno più HZB e ematocriti inferiori rispetto ai gatti diabetici non chetotici (Christopher et al., 1995). Anche se la sopravvivenza RBC tende ad essere ridotta, l’anemia è assente o lieve nelle condizioni precedenti. Le reazioni ossidative coinvolte in queste condizioni non sono chiaramente definite.