Il doppio blocco di CD47 e HER2 elimina le cellule di cancro al seno radioresistenti

Linee cellulari

Cancro al seno umano Le linee cellulari MCF-7, MDA-MB-231, BT474, BT549, SKBR3, glioblastoma U251 e Le cellule MCF-7, MDA-MB-231, BT474, BT549 e U251 sono state mantenute nel mezzo DMEM integrato con 10% FBS e le cellule SKBR3 mantenute nel mezzo RPMI-1640 con 10% FBS. Le cellule HCT116 sono state mantenute nel mezzo 5a di McCoy con 10% FBS. Le linee cellulari radioresistenti MCF7/C6 e MDA-MB-231/C5 che sono state clonate da frazioni sopravvissute di cellule MCF7 e MDA-MB-231 dopo irradiazione ripetuta; le cellule staminali del cancro al seno HER2-overexpressing (HER2+/CD44+/CD24−/low BCSCs) sono state isolate da MCF7/C626. Le cellule 4T1 del carcinoma mammario triplo negativo del topo sono state mantenute nel mezzo DMEM con FBS 10%. Il monocita umano THP-1 è stato coltivato in mezzo RPMI-1640 formulato da ATCC integrato con 10% FBS, 15 mm HEPES, 4,5 g/l glucosio e 2-mercaptoetanolo ad una concentrazione finale di 0,05 mm. Mouse Mφ RAW 264.7 cellule sono state coltivate in mezzo DMEM con 10% FBS seguendo con il metodo di coltura ATCC. Tutte le linee cellulari sono risultate negative alla contaminazione da micoplasma con MycoSensor PCR Assay kit (Agilent Technologies, Catalog # 302108).

Plasmidi e reagenti

Il vettore luciferasi controllato dal promotore CD47 è stato costruito clonando la regione del promotore CD47 umano (-1554 nt) nel plasmide pGL2-base dai siti KpnI / Hind III. La cancellazione dei siti di legame putativo NF-kB (TGGAAGCT-764-757) è stata eseguita utilizzando un kit di mutazione rapida (Stratagene, La Jolla, CA). Le sequenze di primer utilizzate: 5 ′-GTGGTCGGGTACCTGCCCGCTCGCCCCTCGCGGGCTCTGCG-3′ (sense) and 5 ′-CGCAGAGCCCGCGAGGGGCGAGCGGGCAGGTACCCGACCAC-3′ (antisense).

pGL2-NF-κB-luc plasmid was constructed with the 3 NF-κB-binding sites: GTGGGTTCCC, TCGCCACTCCCC, and TGGAAAGTCCCC by blunt-end ligation. IMD-0354 (Catalog # I3159) and TNF-α (Catalog # T0157) were purchased from Sigma. The lentiCRISPR v2 vector was purchased from the Addgene plasmid repository (Catalog # 52961). Herceptin was obtained from the UC Davis Comprehensive Cancer Center Pharmacy as left-over medicine (Genentech, NDC 50242-132-01). Lapatinib ( Catalogo # S1028) è stato acquistato da Selleckchem. L’anticorpo anti-CD47 (B6H12) per IHC, IC e western blot è stato acquistato da Santa Cruz (Catalogo # sc-12730). Anti-CD47-FITC per citometria a flusso è stato acquistato da BD Biosciences (catalogo # 556045). L’anticorpo anti-umano CD47 (B6H12) per il test di fagocitosi è stato estratto dall’ibridoma B6H12.2 (ATCC® HB-9771™). L’anticorpo anti-topo CD47 per l’inibizione del tumore in vivo è stato estratto dall’ibridoma MIAP301 fornito dal Dr. William Frazier (Washington University School of Medicine). L’anticorpo anti-CD11b per la colorazione IHC è stato acquistato da Invitrogen (catalogo # MA5-17857). L’anticorpo monoclonale anti-α-tubulina del topo per Western blot è stato acquistato da Sigma-Aldrich (catalogo # T6074). L’anticorpo monoclonale anti-β-actina del topo per Western blot è stato acquistato da Sigma-Aldrich (catalogo # A5441). Anti-HER2/ERBB2 (Catalogo # 29D8) anticorpo per la colorazione IHC e western blot è stato acquistato da Cell Signaling Technology (Catalogo # 2165). L’anticorpo anti-HER2-APC per l’analisi della citometria a flusso è stato acquistato da BD Biosciences (Catalogo # 340554).

Immunoblotting

Le proteine da cellule o tessuti tumorali sono state estratte in tampone di lisi RIPA (Pierce) integrato con cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi (segnalazione cellulare). La concentrazione di proteine è stata determinata utilizzando il test BCA (Pierce). I lisati sono stati quindi denaturati e i campioni contenenti proteine 30 µg sono stati sottoposti ad elettroforesi in gel 10% SDS-poli-acrilammide, seguito da trasferimento a membrane di difluoruro di polivinilidene (Bio-Rad). Dopo il blocco con latte secco al 5% senza grassi, la membrana è stata esposta all’anticorpo primario e incubata a 4 °C durante la notte. Le macchie sono state visualizzate etichettando con anticorpi secondari accoppiati HRP (Sigma-Aldrich) e incubazione con reagente di rilevamento western blotting Amersham ECL (Catalogo # RPN2106). Le macchie sono state sviluppate su uno sviluppatore Konica SRX101A e quantificate con ImageJ.

Analisi della citometria a flusso

Le cellule raccolte sono state risciacquate con PBS contenente lo 0,5% di BSA in PBS e i pellet cellulari sono stati incubati con anticorpi primari marcati con fluorescenza a 37 °C per 30 min, seguiti da lavaggio tre volte con 0,5% di BSA / PBS. Tutti gli anticorpi sono stati titolati per ottimizzare la condizione prima di applicare all’esperimento. L’analisi della citometria a flusso è stata eseguita utilizzando il citometro FACS Canto II (BD) e l’analisi successiva è stata eseguita utilizzando il software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA). Le strategie di gating erano basate sulle proprietà FSC e SSC e sono state impostate per popolazioni di cellule positive nei canali FITC, APC.

di cancro al seno Umano tessuti

Fresco congelato HER2 positivo e negativo tessuti di cancro al seno sono stati forniti da UC Davis Comprehensive Cancer Center Biorepository (IRB # 283665, e IRB # 218204) finanziato dalla UC Davis Comprehensive Cancer Center Support Grant (CCSG) rilasciato dal National Cancer Institute (NCI P30CA093373) con tutte le informazioni del paziente bloccato tranne che i risultati diagnostici. Ulteriori campioni patologici di cancro al seno umano, tra cui le sezioni non colorate di 4 µm di spessore di cancro al seno primario accoppiato con paraffina (FFPE) e tumori al seno ricorrenti, sono stati ottenuti dal dipartimento di patologia, Ohio State University con approvazione IRB di ricerca (#2002H0089).

Immunoistochimica (IHC)

La colorazione immunoistochimica è stata eseguita su sezioni di tessuto FFPE spesse 4 µm. In breve, i vetrini sono stati deparaffinizzati e reidratati e gli antigeni sono stati recuperati per 40 min in un tampone citrato (pH 6.1) a 95 °C. L’attività endogena della perossidasi è stata bloccata con una soluzione di H2O2 al 3%. L’incubazione primaria dell’anticorpo è stata effettuata a 4 °C durante la notte, seguita dal kit Vectastain ABC (Vector Laboratories) a RT per 30 min secondo le istruzioni del produttore. I prodotti di reazione sono stati rilevati utilizzando il kit di substrato perossidasi e contrastati con ematossilina (Vector Laboratories). Due patologi senior erano responsabili della diagnosi dei tumori al seno clinici e della valutazione dei tumori sperimentali. L’espressione CD47 è stata valutata utilizzando sia l’intensità di colorazione che la percentuale di cellule macchiate. L’intensità di colorazione è stata classificata come 0: negativo; 1: debole; 2: moderato; 3: forte. L’alta espressione è stata definita come forte intensità di colorazione in più del 25% delle cellule tumorali; l’espressione media era moderata intensità di colorazione in più del 25% delle cellule tumorali; bassa espressione era debole intensità di colorazione in più del 25% di cellule tumorali o moderato di colorazione <25% delle cellule tumorali utilizzando l’ASCO-CAP guidelines63 è stato utilizzato per l’interpretazione di HER2 immunoistochimica (IHC) e HER2 l’espressione della proteina è stato classificato come negativo IHC 0 (nessuna colorazione o membrana di colorazione che è incompleta e si stanca/appena percettibile e all’interno ≤10% delle cellule tumorali invasive) negativi o IHC 1+ (incompleto membrana di colorazione che è stanco/appena percettibile e all’interno di >10% delle cellule tumorali invasive); equivoco IHC 2 +(colorazione della membrana circonferenziale incompleta e/o debole/moderata entro >10% delle cellule tumorali invasive; e o colorazione completa e circonferenziale della membrana intensa entro ≤10% delle cellule tumorali invasive); Positivo IHC 3+ (colorazione della membrana circonferenziale completa e intensa in oltre il 10% delle cellule tumorali invasive). Se i risultati erano equivoci (2+), il test riflesso è stato eseguito utilizzando l’ibridazione in situ (ISH). Nel rilevare l’espressione di CD47 di tumori irradiati in vivo, i tumori del topo trattati sono stati rimossi e fissati in 4% paraformaldeide in PBS per 24 h. I campioni sono stati disidratati con etanolo serie (70%, 95% e 100%) per 48 h prima incorporati nella soluzione di paraffina (Poliscienze).

Immunocitochimica (IC)

Le cellule sono state seminate su coprioggetti rotondi e cresciute fino alla confluenza del 60-80%, seguita da risciacquo con PBS, fissaggio in 4% paraformaldeide (pH 7,2) e permeabilizzazione con 0,1% Triton X-100 in PBS. Le cellule sono state quindi incubate in una soluzione di blocco per 15 minuti prima dell’incubazione con l’anticorpo primario durante la notte a 4 °C con diluizioni 1:250. Le cellule sono state incubate con anticorpi secondari coniugati con TR o FITC diluiti 1: 1000 nella soluzione di blocco per 1 h a temperatura ambiente al buio e analizzate con microscopia confocale.

Identificazione delle proteine antigeniche associate alle radiazioni

Il topo C57/B6 è stato utilizzato come ospite di immunizzazione con 5 × 106 cellule MCF7/C6 in 0.1 ml di volume iniettato alla base della coda o del footpad per mouse, seguito da aumentare con lo stesso volume di cellule al 14 ° giorno. Al 5 ° -7 ° giorno successivo alla seconda sfida i topi sono stati sottoposti a eutanasia e il siero è stato raccolto per rilevare molecole antigeniche espresse in cellule BC radioresistenti. Al fine di distinguere i RAAP da molecole non specifiche espresse in cellule epiteliali mammarie normali e cellule MCF7 di tipo selvaggio, è stata eseguita una procedura di pre-pulizia con il siero grezzo con i seguenti passaggi. Due milioni di cellule epiteliali umane normali della mammella MCF10A sono state preparate in una soluzione contenente 1 mm EDTA / PBS senza tripsina per evitare di digerire alcune delle proteine sensibili, seguita da risciacquo con PBS due volte. Le celle sono state pellettate e quindi allentate toccando il fondo del tubo seguito dall’aggiunta di 1 ml di anti-sieri di topo e ruotate a 4 °C per 2 h. La miscela è stata quindi centrifugata a 9391 × g per 5 min a 4 °C e i surnatanti sono stati raccolti, che è stato ripetuto una volta. Il primo antisiero pulito è stato ulteriormente pulito mediante incubazione con cellule MCF7 wild-type utilizzando le stesse procedure e ripetuto sei volte. L’antisiero purificato finale è stato quindi testato da Western blot contro lisato proteico da cellule MCF10A, cellule MCF7, MCF7 / C6 e cellule RD-BCSC che sono state ordinate per marcatori di cellule staminali del cancro al seno HER2 + / CD44 + / CD24 – così come aldeide deidrogenasi (ALDH)64. CD47 e HER2 insieme ad altri RAAP nelle cellule BC radioresistenti sono stati identificati da western blot o da immunoprecipitazione di proteine di membrana purificate da cellule RD-BCSC e le frazioni eluite sono state analizzate tramite LC / MS. I RAAP di membrana risultanti sono stati raggruppati con un numero di proteine e categorie funzionali proteiche.

CRISPR editing di HER2 e CD47

Gli SGRNA sono stati progettati seguendo le istruzioni pubblicate dal software di progettazione CRISPR del Dr. Zhang Lab (http://crispr.mit.edu) e il protocollo stabilito che è stato descritto nella precedente pubblicazione65. Quattro Oligos sono stati progettati corrispondenti agli sgRNAs umani sono stati sintetizzati e clonati nel vettore lentiCRISPR v2 seguendo il protocollo di amplificazione della libreria pool GeCKO di Zhang Lab. Per ridurre al minimo la possibilità di targeting non specifico, sono stati sintetizzati e testati tre oligos sgRNA di ciascun gene di targeting. Lo sgRNA con la migliore efficienza di knockout determinata dal western blotting è stato scelto per gli esperimenti successivi. Le sequenze sgRNA sono state utilizzate per cellule umane e di topo come segue:

hHer2gRNA_F: CACCGGGCACAGACAGTGCGCGTC

hHer2gRNA_R: AAACGACGCGCACTGT CTGTGCCGC

hCD47gRNA_F: CACCGTAAATATAGATCCGGTGGTA

hCD47gRNA_R: AAACTACCAC CGGATCTATATTTAC

mHer2gRNA_ F: CACCGTGATGGCCCTCGCCCCTCGG

mHer2gRNA_ R: AAACCCGAGGGGCGAGGGCCATCAC

mCD47gRNA_F: CACCGCCCTTGCATCGTCCGTAATG

mCD47gRNA_R: AAACCATTACGGACGATGCAAGGGC

The lentiviral particles were generated using 293T cells following the protocol from Addgene. For gene editing, the isolated BCSC sphere cells or MCF7/C6 cells were trypsinized into single cells and plated 1. 2.5 × 105 cells/0.5 ml per well in the 12-well plates. Dopo l’incubazione per 12 h, 1 ml di surnatante contenente virus con 8 ng polibrene è stato aggiunto alle cellule seguito da incubazione per 6 h. Quindi, 0,5 ml di terreno regolare aggiuntivo contenente il 10% di FBS inattivato dal calore è stato aggiunto e ulteriormente coltivato per una notte. Il mezzo di infezione è stato sostituito con 2 ml di terreno fresco con 10% FBS e coltivato per 72 h. Le cellule sono state passate a piatti di coltura tissutale 60 mm e selezionate coltivando in 0,3 µg/ml Puromysin per 1 settimana e l’knockout del gene mirato è stato verificato mediante immunoblotting.

Analisi della luciferasi

Le cellule sono state trasfettate con PGL2-basic-CD47 o pGL2-basic-CD47-ΔNF-kB o PGL2-NF-kB reporter della luciferasi e l’attività della luciferasi è stata misurata dal luminometro (Promega, Madison, WI). Per la normalizzazione dell’efficienza della trasfezione reporter, la concentrazione proteica totale dei lisati è stata misurata con il kit di analisi della proteina BCA (Pierce, Rockford, IL) con BSA come standard.

Test di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)

Le cellule sono state reticolate con formaldeide (1% finale) per 10 minuti, lavate con PBS ghiacciato e raccolte in tampone di lisi SDS (1% SDS, 10 mm EDTA, 50 mM Tris, pH 8. 1). La cromatina è stata tranciata mediante sonicazione, pre-eliminata con perline di agarosio coniugato con proteina G e incubata con anti-p65, anti-c-Rel o IgG normale a 4 C durante la notte. Dopo che la proteina G è stata aggiunta per 2 h a 4 °C, il complesso è stato lavato in modo sequenziale con tamponi di lavaggio a basso e alto sale immunocomplesso (0. 1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mm EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.1 più 150 mm NaCl per basso contenuto di sale e 500 mM NaCl per buffer ad alto contenuto di sale) seguito da TE buffer (due volte). L’interazione DNA-fattore di trascrizione è stata invertita dopo l’aggiunta di NaCl e l’incubazione a 65 °C durante la notte. Dopo la digestione della RNasi A e della proteinasi K, i frammenti di DNA sono stati purificati mediante estrazione di fenolo / cloroformio e precipitazione di etanolo. I DNA sono stati purificati e utilizzati per la PCR con primer specifici per la regione del promotore genico che comprende i siti di legame NF-kB. I primer CD47 erano:

5′-CGTGGACCAGGACACCTAGG-3′ (sense)

5′-AGGGAAGAGAACCGCATAGG-3′ (antisense)

The PCR amplification of the IκB promoter region (1134/902) was also included as positive. The primers for NF-κB-binding site in the IκB promoter were:

5′-TGTAGCACCCATTAGAAACACTTC-3′ (sense)

5′-TTCTTGTTCACTGACTTCCCAAT-3′ (antisense).

Preparation of anti-human and anti-mouse CD47 antibodies

Hybridoma for monoclonal mouse anti-human CD47 antibody (B6H12.2), IgG2b were obtained from ATCC. L’anticorpo monoclonale anti-topo CD47 rat2A del ratto (MIAP301) e l’ibridoma sono stati ottenuti dal Dr. William Frazier (Washington University School of Medicine). Entrambe le linee cellulari di ibridoma sono state mantenute nel mezzo IMDM con FBS del 20%. Gli anticorpi sono stati purificati dal supernatante dell’ibridoma facendo uso della resina della proteina G da GenScript (catalogo # L00209) seguendo le procedure standard di fabbricazione. I campioni sono stati quindi ulteriormente concentrati 10-20 volte utilizzando dispositivi centrifughi Microsep di Pall Life Sciences. Le concentrazioni di IgG purificate sono state determinate misurando l’assorbanza a OD280.

Analisi della fagocitosi

Sia le cellule umane del monocita THP1 che le cellule GREZZE 264,7 di Mφ del topo (ATCC, TIB-71) sono state mantenute in un incubatore del 5% di CO2 a 37 °C66 ad una densità approssimativa di 1 × 106 / ml. Circa 0,8 × 106 cellule / ml di 264,5 cellule GREZZE o 1 × 106 cellule THP1 sono state seminate su una piastra a 6 pozzetti. Dopo 24 ore di incubazione Le cellule 264.7 CRUDE sono state attivate trattando con 0.1 µg / ml di lipopolisaccaride (LPS) per 24 h. Le cellule monociti THP1 sono state differenziate da Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (40 nM) per 48 h. I macrofagi attivati sono stati colorati con Dio alla concertazione finale 40 nM in un mezzo per 20 min seguito da risciacquo tre volte con mezzo. Le cellule tumorali sono state etichettate con 1 µM DDAO (soluzione madre da 5 mm in DMSO conservata a -20 °C) in PBS a 37 °C per 15 min e lavate con PBS contenente 1% FBS. Le cellule bersaglio etichettate con DDAO (1 × 106) sono state aggiunte alle Mφ colorate con DIO e incubate in un volume finale di 2 ml a 37 °C per 2 h. Dopo l’incubazione, le Mφ e le cellule bersaglio sono state raccolte con tre volte il lavaggio EDTA-PBS seguito da tripsinizzazione dello 0,25%. La fagocitosi è stata valutata valutando le cellule a doppia etichetta (DIO+ / DDAO+), che rappresenta le cellule di cancro al seno fagocitate da Mφs maturi, tramite citometria a flusso. Il software FlowJo è stato utilizzato per l’analisi.

Test di sopravvivenza clonogenica

Il test di sopravvivenza clonogenica è stato eseguito dopo radiazioni con o senza trattamento (Lapatinib, 10 µM per 72 h; anticorpo anti-CD47 10 µg / ml durante la notte). Le cellule trattate sono state coltivate per 10-14 giorni e le colonie sono state fissate, macchiate con macchia blu di Coomassie. Le colonie contenenti più di 50 cellule sono state contate come cloni sopravvissuti e normalizzate all’efficienza di placcatura di ciascuna linea cellulare tumorale trattata con finzione.

Analisi del tasso di riempimento del gap

La capacità di riempimento del gap è stata misurata con 1 × 106 celle coltivate in ciascuna delle piastre a 6 pozzetti fino alla confluenza del 100% seguita da fame di cellule 24 h. Quindi il divario è stato creato raschiando il piatto in diagonale con una punta di pipetta sterile. Le cellule sono state lasciate non trattate o trattate con 10 µg/ml di IgG o anticorpo anti-CD47 durante la durata dell’esperimento. La capacità di riempimento è stata monitorata per 72 h e le immagini rappresentative sono state scattate al giorno 0 (giorno di raschiatura) e al giorno 3.

Tumorsphere formation

Le cellule sono state setacciate con filtri cellulari da 40 µm (Catalogo # 352340. Corning) e sospensioni a cella singola sono state seminate in piastre di Petri da 60 mm a basso attacco a una densità di 1000 celle/ml. Le cellule sono state coltivate in mezzo basale epiteliale mammario senza siero (MEBM), integrato con B27 (Catalogo # 17504-044. Life Technology), 20 ng / ml EGF (Catalogo # 4022-500. Bio-vision), 20 ng / ml di base-FGF (Catalogo # 13256-029. Invitrogen), e 4 µg/ml di eparina ( Catalogo # 80603-686 EMD MILLIPORE). Le cellule sono state coltivate per 10 giorni e i tumorile sfere sono state contate sotto microscopia ottica.

Analisi di invasione Transwell

Aliquote (0. 4 ml) di Matrigel (Catalogo # 356231. BD Biosciences) sono stati diluiti in tampone di rivestimento: 0,01 M Tris (pH 8,0), 0,7% NaCl alla concentrazione finale di 200-300 µg/ml. Circa 100 µl sono stati caricati nella camera superiore di 24-well transwell (Catalogo # 3422. Costar) e incubato a 37 °C per gelificazione circa 1 h. Rimuovere con cautela il tampone di rivestimento rimanente dalla membrana di supporto permeabile senza disturbare lo strato e quindi aggiungere celle (2,5 × 104/ml). La camera inferiore è stata riempita con 800 µl di supporti MEM contenenti 5 µg/ml di fibronectina (Catalogo # SC-29011. Santa Cruz). Il transwell con celle trattate in modo diverso è stato incubato per 48 h e macchiato con Diff-Quick Stain kit (Catalogo # K7128. IMEB INC).

Preparazione di F (ab’)2 frammenti

CD47 F (ab’)2 frammenti sono stati prodotti dalla scissione della resina di papaina di IgG utilizzando un kit di preparazione F (ab’)2 (Catalogo # 786272. G-Bioscience) secondo le raccomandazioni del produttore e la procedura riferita67. Dopo la digestione della papaina, il frammento Fab è stato separato dalle IgG non digerite e dalla regione Fc con la colonna di Spin della proteina A dal kit di frammentazione Fab Sono state fornite le colonne di dissalazione Spinout GT-600 per garantire che il campione iniziale di anticorpi fosse la condizione ottimale per la frammentazione Fab e l’anti-topo CD47 IgG purificata

Radiazione di cellule BC con CRISPR-KO CD47 e/o HER2

Per il test in vivo dell’efficacia dell’inibizione tumorale mediante radiazioni con stato CD47 e HER2 carenti, 5 × 105 cellule 4T1/C2 con CRISPR-knockout di CD47 (CD47−/−), HER2 (HER2−/−) o double (CD47−/−/HER2−/−) sono state impiantate per gruppo). La crescita del tumore è stata valutata misurando il volume del tumore ogni 2 giorni a partire dal giorno 7 fino a quando i volumi del tumore hanno raggiunto la limitazione. Per valutare la radiosensibilità dei tumori con stato diverso di CD47 e HER2, la radiazione tumorale locale è stata consegnata con 5 Gy a ciascun tumore al giorno 9 e la crescita tumorale è stata misurata a giorni alterni fino a quando i tumori di controllo hanno raggiunto la limitazione massima.

RT di BC topo con trattamento anti-CD47 e / o HER2

Per i test in vivo di inibizione tumorale con un singolo anticorpo CD47 in presenza o assenza di radioterapia, il trattamento anti-CD47 ha seguito il protocollo di Willingham et al20 con alcune modifiche. Topi femmina immunocompetenti (BALB/c) di otto settimane (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) sono stati iniettati con 1 × 105 cellule 4T1 del seno del topo nelle ghiandole mammarie 4th. Cinquanta microlitri PBS contenenti 100 µg di controllo IgG o anti-CD47 F (ab’) frammenti sono stati iniettati nel sito del tumore (giorno 1) o nei tessuti tumorali (giorno 15) e ripetuti a giorni alterni fino alla fine degli esperimenti. I volumi tumorali sono stati monitorati ogni 5 giorni. Per il trattamento con radiazioni, anti-CD47 o radiazioni combinate con anti-CD47, gli animali portatori di tumori 4T1 sono stati suddivisi casualmente in vari gruppi di trattamento e un gruppo di controllo (5-10 topi per gruppo). La radiazione locale del tumore ha cominciato quando il volume del tumore raggiunge 200 mm3 con FIR (5 Gy/giorno/tumore per quattro frazioni facendo uso della fonte di IR del micro-fascio; dose totale = 20 Gy) combinato con tre volte le iniezioni del tumore di anti-CD47 F (ab’). La radiosensibilità dei tumori irradiati in vivo con presenza o assenza di anti-CD47 F (ab’) è stata valutata misurando il volume tumorale alla fine degli esperimenti. Gli animali sono stati sottoposti a eutanasia quando i tumori erano ~1400 mm3 o quando gli animali sembravano essere a disagio anche quando il tumore era più piccolo di 1400 mm3 per conformarsi alle normative UCD IACUC per l’uso di animali vertebrati nella ricerca. Il protocollo per l’uso e la cura degli animali della radioterapia in vivo è stato approvato dal Comitato istituzionale per l’uso e la cura degli animali dell’Università della California Davis (IACUC 15315).

Per i test in vivo di inibizione del tumore con anticorpi doppi a CD47 e HER2 in presenza o assenza di radioterapia, topi femmina immunocompetenti (BALB / c) di otto settimane (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) sono stati iniettati con 1 × 105 cellule 4T1 del seno del topo nelle 4e ghiandole mammarie. Quando i volumi tumorali hanno raggiunto circa 200 mm3, i topi sono stati divisi casualmente in quattro gruppi (6 topi per gruppo). I frammenti di PBS, IgG, anti-CD47 F (ab’) (100 µg) o Herceptin (5 mg/kg) sono stati iniettati nei tessuti tumorali 4 h prima della radioterapia locale (5 Gy al giorno per 2 giorni). Le iniezioni sono state eseguite e le dimensioni del tumore sono state monitorate a giorni alterni fino alla fine degli esperimenti. I topi sono stati sottoposti a eutanasia quando i tumori erano ~1400 mm3 o quando gli animali sembravano essere a disagio anche quando il tumore era più piccolo di 1400 mm3 per conformarsi alle normative UCD IACUC per l’uso di animali vertebrati nella ricerca. Il protocollo per l’uso e la cura degli animali della radioterapia in vivo è stato approvato dal Comitato istituzionale per l’uso e la cura degli animali dell’Università della California Davis (IACUC 15315).

Tumore infiltrato di macrofagi e fagocitosi dei macrofagi

che esprimono GFP mouse di cancro al seno 4T1 le cellule sono state impiantate in 4 ° mammaria cuscinetti di grasso di topi BALB/c e il trattamento è stato iniziato quando i tumori raggiunto circa 200 mm3 da tumore iniezione di 50 µl di PBS contenente 100 µg di controllo IgG, anti-CD47 F (ab’) frammenti, Herceptin o entrambi gli anticorpi a giorni alterni per tre volte. Tumore RT locale è stato consegnato nei giorni 10 e 11 con 5 Gy/giorno/tumore per due frazioni, dose totale = 10 Gy, e gli esperimenti sono stati conclusi 2 giorni dopo la fine dei trattamenti anticorpali. I tumori sono stati estratti e FFPE sezioni sono state preparate per la colorazione di immunofluorescenza per seguire la procedura standard: i vetrini sono stati deparaffinized e reidratati, e gli antigeni sono stati recuperati per 40 min in un tampone citrato (pH 6.1) al 95 °C. Per rimuovere autofluorescenza, diapositive sono state colpendo in de-autofluorescenza soluzione 0,5 M di CuSO4, 0.05 M NH4COOH in H2O) a temperatura ambiente per 48 h, sciacquati con acqua 5 min 3times, poi bloccato con 1:100 siero di cavallo. L’incubazione primaria dell’anticorpo è stata effettuata a 4 ° C durante la notte: anti-GFP (1:100; Dako), anti-CD11b (1:100; Millipore); Dopo il lavaggio, i vetrini sono stati incubati con anticorpi secondari coniugati fluorescenti diluiti 1: 250 (Rhodamina per CD11b, Alexa Fluor 488 per GFP) a RT per 1 h e poi montati con soluzione antifade Vectashield contenente DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). La fagocitosi mediata dai macrofagi è stata rilevata con microscopia fluorescente utilizzando il software Axiovision (Zeiss, Germania) e le microfotografie sono state quantificate da ImageJ.

Analisi statistica

Tutti i dati sperimentali ottenuti da studi cellulari in vitro e test su animali sono presentati come media ± SE, analizzati utilizzando il test Student t a due code per due gruppi o ANOVA per più gruppi. La significatività statistica delle curve di sopravvivenza di Kaplan–Meier è stata valutata con un test di Mann–Whitney. Il numero di esperimenti indipendenti e le repliche sono stati indicati nelle leggende di figura. I valori P< 0.05 sono stati considerati significativi e sono indicati con asterischi come segue: *P< 0.05, * * P <0.01, ***P<0.001, ****P< 0.0001.

Reporting summary

Ulteriori informazioni sul design della ricerca sono disponibili nel Reporting Summary di Nature Research collegato a questo articolo.