- Abstract
- 1. Introduzione
- 2. Materiali e metodi
- 2.1. Animali
- 2.2. Colture cellulari
- 2.3. Immunofluorescenza Colorazione Test
- 2.4. Western Blot
- 2.5. Reazione a catena quantitativa (in tempo reale) della polimerasi (PCR in tempo reale)
- 2.6. Analisi statistica
- 3. Risultati
- 3.1. La distribuzione di astrociti etichettati da NDRG2, GFAP e S100ß in diverse regioni cerebrali
- 3.2. Le morfologie degli astrociti etichettati da NDRG2, GFAP e S100ß in diverse regioni cerebrali
- 3.3. La colocalizzazione di NDRG2, GFAP e S100ß all’interno di astrociti in diverse regioni cerebrali
- 3.4. L’espressione delle proteine NDRG2, GFAP e S100ß in diverse regioni cerebrali
- 4. Discussione
- Disponibilità dei dati
- Disclosure
- Conflitti di interesse
- Contributi degli autori
- Ringraziamenti
- Materiali supplementari
Abstract
Gli astrociti possiedono caratteristiche morfologiche diverse a seconda della regione cerebrale in cui si trovano. Tuttavia, nessuno degli attuali marcatori astrocitici può etichettare con successo tutte le sottopopolazioni. Pertanto, identificare il marker appropriato per una specifica indagine scientifica è fondamentale. Qui, abbiamo confrontato la distribuzione e l’espressione proteica di tre marcatori astrociti: NDRG2, GFAP e S100ß, nella corteccia, nell’ippocampo e nel talamo. Gli astrociti NDRG2 – e S100ß-positivi sono stati distribuiti in modo più uniforme rispetto agli astrociti GFAP-positivi in tutto il cervello. Le immunoreattività NDRG2 e S100ß erano le più forti nella corteccia dorsale e nel talamo, mentre l’immunoreattività GFAP era la più forte nell’ippocampo. Inoltre, i livelli di espressione proteica di NDRG2, GFAP e S100ß nei topi adulti erano i più alti rispettivamente nella corteccia, nell’ippocampo e nel talamo. Abbiamo anche rilevato la morfologia degli astrociti e abbiamo scoperto che, nel corpo calloso e nel peduncolo cerebrale, gli astrociti GFAP-positivi sono stati trovati con processi più numerosi e più lunghi rispetto agli astrociti NDRG2 e S100ß – positivi. Questi risultati dimostrano che NDRG2 e S100ß sono più opportunamente utilizzati per visualizzare la distribuzione complessiva e i cambiamenti nel numero di astrociti, nonché per etichettare gli astrociti nella corteccia e nel talamo. GFAP, tuttavia, è usato più appropriatamente per etichettare gli astrociti nel corpo calloso, nel peduncolo cerebrale e nell’ippocampo. Questi risultati aiutano a guidare i ricercatori nella scelta del marker di astrociti appropriato e suggeriscono differenze nelle qualità immunologiche degli astrociti in base al tessuto in cui si trovano.
1. Introduzione
Gli astrociti sono stati a lungo considerati cellule ausiliarie che forniscono solo supporto trofico, metabolico e strutturale ai neuroni . Tuttavia, negli ultimi anni, ricerche approfondite hanno dimostrato che svolgono ruoli cruciali nelle funzioni fisiologiche e patologiche cerebrali. Gli astrociti aiutano nel mantenimento dell’omeostasi ionica e delle barriere sangue-cerebrali, nella formazione di sinapsi e nella rimozione, oltre a controllare il flusso sanguigno cerebrale e regolare il riciclaggio dei neurotrasmettitori, l’eccitotossicità del glutammato e lo stress antiossidante . È importante sottolineare che gli astrociti possiedono diversità morfologiche, di popolazione e funzionali in diverse regioni cerebrali . Pertanto, identificare il marker più appropriato per i sottogruppi polimorfici e multipli di astrociti è fondamentale per la ricerca sul multifunzione astrocitico.
La proteina acida fibrillare gliale (GFAP) è il marcatore astrocitico più comunemente usato, ma come il principale filamento intermedio che compone il citoscheletro, GFAP ha immunolabellato solo circa il 15% del volume totale di astrociti e oltre il 40% degli astrociti è risultato negativo a GFAP nell’ippocampo di ratto adulto . Inoltre, GFAP ha marcato male gli astrociti umani protoplasmatici ed è stato espresso in ritardo nello sviluppo di astrociti fibrosi .
Un altro marcatore astrocitico comunemente usato è S100ß, un peptide legante Ca2+ abbondante nel citoplasma e nucleo di astrociti che è coinvolto nella regolazione del ciclo cellulare e nella modifica del citoscheletro . Tuttavia, S100ß è anche espresso in una sottopopolazione di oligodendrociti maturi, nelle cellule epiteliali del plesso coroide e in alcuni neuroni . Le carenze di GFAP e S100ß nell’etichettatura degli astrociti possono portare a imprecisioni o addirittura errori nell’esplorazione delle funzioni degli astrociti.
N-Myc downstream-regulated gene 2 (NDRG2) è stato scoperto per la prima volta in una normale libreria di cDNA cerebrale umana con un metodo di ibridazione sottrattiva basato su PCR . È un soppressore del tumore e un gene correlato allo stress cellulare associato alla proliferazione e alla differenziazione cellulare . NDRG2 è ampiamente espresso nella corteccia cerebrale, nel bulbo olfattivo, nel midcerebrale, nell’ippocampo e nel talamo . Soprattutto, NDRG2 è specificamente espresso negli astrociti del cervello . Pertanto, NDRG2 è considerato un nuovo marcatore astrocitico, specialmente per astrociti maturi, non reattivi e non proliferanti . Tuttavia, non è stato riportato se NDRG2 sia più affidabile di GFAP e S100ß come marker astrocitico, così come le differenze della loro distribuzione ed espressione in diverse regioni cerebrali.
Nell’attuale studio, abbiamo confrontato la distribuzione, l’espressione proteica e la colocalizzazione reciproca dei marcatori astrocitari NDRG2, GFAP e S100ß in tutto il cervello dei topi. Abbiamo cercato di identificare il marker più adatto per gli astrociti in diverse regioni cerebrali.
2. Materiali e metodi
2.1. Animali
Giovani, adulti e vecchi topi maschi C57BL / 6 di età compresa tra 1 mese, 3 mesi, 6 mesi, 9 mesi e 12 mesi sono stati ottenuti dal Centro sperimentale per animali della Central South University. Gli animali erano liberi di mangiare e bere, tenuti a una temperatura di 25 ± 1°C e alloggiati con un cerchio chiaro-scuro 12:12-h per simulare il ritmo circadiano dell’animale. Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza animale e per ridurre il numero di animali utilizzati. Tutte le procedure sperimentali sugli animali hanno seguito un protocollo approvato dal Comitato Etico per la sperimentazione animale della Central South University Animal Care and Use Committee, Cina.
2.2. Colture cellulari
Le cellule HT22 (una linea cellulare neuronale) e le cellule MA1800-57 (una linea cellulare di astrociti) sono state coltivate nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM, HyClone) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS, Gibco), 50 U/mL di penicillina e 50 µg / mL di streptomicina. Le cellule OLN-93 (una linea cellulare oligodendrogliale) sono state mantenute in DMEM integrato con 10% FBS, 2 mm glutammina, 50 U/ml penicillina, e 50 µg/mL streptomicina. Le celle sono state tutte mantenute a 37°C in una miscela di aria atmosferica al 95% e CO2 al 5%. Le cellule HT22, le cellule OLN-93 e le cellule MA1800-57 sono state seminate su vetrini e sono state colorate con anticorpi contro la proteina 2 associata ai microtubuli (MAP2), α-tubulina e GFAP, rispettivamente.
2.3. Immunofluorescenza Colorazione Test
Dopo che i topi sono stati anestetizzati con pentobarbital di sodio (50 mg/kg), i loro cerebrums sono stati estratti e fissati con soluzione salina eparinizzata fredda allo 0,9% e 4% paraformaldeide. Dopo la postfissazione, i cerebrum sono stati successivamente disidratati in soluzioni al 20% di saccarosio e al 30% di saccarosio. Le sezioni dello spessore di 10 µm sono state preparate utilizzando un’affettatrice congelata Leica CM1900. Le sezioni cerebrali sono state incubate in 1% H2O2 per 15 min e 0.3% Triton X-100 per 15 min, con 3×lavaggi in postincubazione PBS tra ogni trattamento. Le sezioni sono state poi bloccate nel 5% di siero di capra normale per 1 h a temperatura ambiente e incubate overnight a 4°C in una casella di umidificazione con anticorpi primari come segue: mouse anti-GFAP anticorpo (#3670, 1:500, Cell Signaling Technology); coniglio anti-NDRG2 anticorpo (#5667, 1:200, Cell Signaling Technology); mouse anti-NDRG2 anticorpo (#DA281-6A5, 1:100, Sigma); coniglio anti-S100ß anticorpo (#2017-1, 1:500, Epitomics); mouse anti-Glutammina Sintetasi (GS) anticorpo (#MAB302, 1:200, Millipore); coniglio anti-MAP2 anticorpo (#ab32454, 1:500, Abcam); e mouse anti-alfa-tubulina anticorpo (#T6199, 1:500, Sigma). Poi, le sezioni sono state incubate con miscele di Alexa-488 (verde, Invitrogen) e Alexa-647 (rosso, Invitrogen)-coniugato asino anti-coniglio o asino anti-mouse anticorpi secondari per 2 h al buio a temperatura ambiente. 4,6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (ZLI-9557, Zsbio) è stato usato per macchiare i nuclei. Le sezioni sono state montate con il 50% di glicerolo. Infine, le sezioni sono state visualizzate e fotografate utilizzando un microscopio a fluorescenza Olympus BX51 (Giappone). Gli anticorpi utilizzati nel nostro studio sono stati ampiamente utilizzati nei nostri studi precedenti e da altri ricercatori , e la sensibilità e la specificità di questi anticorpi sono stati confermati.
2.4. Western Blot
La corteccia, l’ippocampo e il talamo sono stati raccolti da topi C57BL / 6 di età compresa tra 1 mese, 3 mesi, 6 mesi, 9 mesi e 12 mesi. I campioni sono stati omogeneizzati nel tampone RIPA e la concentrazione dei campioni proteici è stata misurata con BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, US). I campioni di proteine sono stati separati da 10% SDS-PAGE (SDS-PAGE Gel kit, CW0022S, Cina) e trasferiti elettricamente a membrane di difluoruro di polivinilidene (PVDF). I componenti del kit Gel SDS-PAGE includevano un Acr-Bis al 30%, un tampone gel separatore SDS-PAGE, un tampone gel impilabile SDS-PAGE, APS (persolfato di ammonio) e TEMED (N, N, N’, N’-tetrametiletilendiammina). Successivamente, le membrane sono state bloccate in latte secco non grasso 5% diluito in TBST (TBS con 0.05% Tween 20) per 1 h a temperatura ambiente e quindi incubate con anticorpi primari specifici: anticorpo anti-GFAP del topo (#3670, 1:1000, Cell Signaling Technology); coniglio anti-NDRG2 anticorpo (#5667, 1:1000, Cell Signaling Technology); coniglio anti-S100ß anticorpo (#2017-1, 1:1000, Epitomics); e di coniglio anti-GAPDH anticorpo (#5174, 1:1000, Cell Signaling Technology) per una notte a 4°C. Le membrane sono state poi incubate con un HRP-coniugato secondario anti-rabbit anti-mouse anticorpo (Thermo Scientific, USA) per 2 h. Chemiluminescente segnali sono stati sviluppati utilizzando Western Fulmine Chemiluminescenza Reagente Plus (PerkinElmer Life Sciences; Wellesley, MA) e rilevato da un analizzatore di immagini LI-COR Odyssey System (LI-COR Biotechnology, USA). L’immunoreattività delle bande di proteine è stata analizzata quantitativamente dal software Bio-Rad ® Image Lab™. I valori di densità di banda sono stati normalizzati a GAPDH.
2.5. Reazione a catena quantitativa (in tempo reale) della polimerasi (PCR in tempo reale)
La corteccia, l’ippocampo e il talamo sono stati raccolti da topi C57BL / 6 di età compresa tra 1 mese, 3 mesi, 6 mesi, 9 mesi e 12 mesi. L’RNA totale è stato isolato utilizzando un kit TransZol Up Plus RNA (Codice n. ER501-01, Transgen, Cina) e quantificato utilizzando un NanoDrop 2000. Quindi, 1000 ng di RNA totale sono stati trascritti in modo inverso in una reazione di 20 µL a 42°C per 15 min, seguita da 85 ° C per 5 sec utilizzando un SuperMix di sintesi cDNA di primo filamento TransScript® All-in-One per qPCR (Codice n. AT341, Transgen, Cina). I componenti del kit incluso un 5×TransScript® All-in-One SuperMix per qPCR (TransScript® RT, inibitore della RNasi, Ancorato Oligo(dT)18 Primer, Primer casuale(N9), dNTPs, buffer), un 5×TransScript® All-in-One No-RT controllo SuperMix per qPCR, un dispositivo di rimozione gDNA e un RNase-free acqua. Il 5×TransScript® All-in-One No-RT Control SuperMix per qPCR è stato utilizzato come controllo negativo. La PCR in tempo reale è stata eseguita in una reazione di 20 µL secondo il manuale del produttore per TransStart Tip Green QRNA SuperMix (Codice n. AQ141, Transgen, Cina). Le sequenze di primer mRNA utilizzate si trovano nella Tabella 1. La reazione è stata eseguita a 94 ° C per 30 sec seguita da 40 cicli di 94 ° C per 5 sec, 60 ° C per 15 sec e 72°C per 19 sec sul sistema di rilevamento PCR in tempo reale ViiA7 (2720 Thermal Cycler, Applied Biosystems). I primer e le sequenze derivate dall’espressione relativa dell’mRNA sono stati analizzati utilizzando la formula .
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2.6. Analisi statistica
I test statistici sono stati eseguiti utilizzando il software PRISM v7.0 (GraphPad). I confronti tra due gruppi sono stati eseguiti utilizzando i t-test degli studenti. I confronti tra i vari gruppi sono stati eseguiti utilizzando ANOVA unidirezionale con il posttest di Tukey. Tutti i valori sono stati presentati come media ± SD. I valori di p < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.
3. Risultati
3.1. La distribuzione di astrociti etichettati da NDRG2, GFAP e S100ß in diverse regioni cerebrali
Le regioni dei topi cerebra sono state identificate etichettando i nuclei cellulari. Inoltre, è stato utilizzato un corrispondente atlante del cervello del topo per verificare le regioni specifiche analizzate (Figura 1). Abbiamo quindi utilizzato la colorazione a immunofluorescenza per rilevare la distribuzione di astrociti etichettati da NDRG2, GFAP e S100ß in diverse regioni cerebrali di topi maschi adulti di 6 mesi. Gli astrociti positivi a NDRG2 e S100ß erano più abbondanti e distribuiti in modo più uniforme rispetto agli astrociti positivi a GFAP in tutto il cervello (Figura 2). Gli astrociti NDRG2-positivi erano concentrati nella corteccia dorsale (Regione 1) e nel talamo (Regione 5), ma meno nell’ippocampo (Regione 4), nel corpo calloso (Regione 3) e nella corteccia ventrale (Regione 2) e il minimo nel peduncolo cerebrale (Regione 6) (Figure 2(a) e 2(b)). Gli astrociti positivi al GFAP erano concentrati maggiormente nell’ippocampo; meno sono stati rilevati nel corpo calloso e nel peduncolo cerebrale e quasi non rilevabili nella corteccia dorsale, nella corteccia ventrale e nel talamo (Figure 2(a) e 2(c)). Gli astrociti S100ß-positivi erano concentrati maggiormente nella corteccia dorsale e nel talamo, meno nell’ippocampo e nella corteccia ventrale, e meno di tutti nel peduncolo cerebrale e nel corpo calloso (Figure 2(b) e 2(c)). La distribuzione degli astrociti NDRG2-positivi era simile a quella degli astrociti S100ß-positivi.
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Gli astrociti in diverse regioni cerebrali hanno presentato immunoreattività ineguali a NDRG2, GFAP e S100ß (Figura 2). Gli astrociti nella corteccia dorsale e nel talamo hanno reagito fortemente a NDRG2 e S100ß, ma debolmente a GFAP. Gli astrociti nell’ippocampo hanno reagito fortemente a GFAP e moderatamente a NDRG2 e S100ß. Gli astrociti nella corteccia ventrale, nel corpo calloso e nel peduncolo cerebrale hanno reagito debolmente a moderatamente a NDRG2, GFAP e S100ß (Tabella 2).
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+++: molto positivo; ++: moderatamente positivo; +: debolmente positivo.
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La distribuzione di astrociti etichettati da NDRG2, GFAP e S100ß in diverse regioni cerebrali di topi maschi era simile a quella dei vecchi topi maschi (12 mesi) (Figura 3).
3.2. Le morfologie degli astrociti etichettati da NDRG2, GFAP e S100ß in diverse regioni cerebrali
Gli astrociti sono principalmente divisi in due tipi: astrociti fibrosi nella materia bianca e astrociti protoplasmatici nella materia grigia. Pertanto, abbiamo confrontato le morfologie dei due tipi etichettati da diversi marcatori nel corpo calloso (materia bianca, Regione 3) e nell’ippocampo (materia grigia, Regione 4) (Figura 4). I risultati di topi maschi adulti (6 mesi) hanno mostrato che gli astrociti positivi a NDRG2 e S100ß presentavano una forma stellata caratterizzata da soma grande e rotondo insieme a processi citoplasmatici corti e grossolani che avevano pochi rami. Gli astrociti GFAP-positivi si presentavano con una forma radiale caratterizzata da piccoli soma, processi lunghi e multibranchi (Figura 4). Inoltre, nel corpo calloso e nel peduncolo cerebrale, gli astrociti etichettati da GFAP presentavano processi più abbondanti e più lunghi di quelli etichettati da NDRG2 e S100ß (Figure 5 e 7).
3.3. La colocalizzazione di NDRG2, GFAP e S100ß all’interno di astrociti in diverse regioni cerebrali
NDRG2 è stata quasi colocalizzata con GFAP negli astrociti della corteccia ventrale, del corpo calloso e del peduncolo cerebrale, e per lo più colocalizzata con GFAP negli astrociti dell’ippocampo (Figure 5 e 8(a)). NDRG2 non ha avuto quasi nessuna colocalizzazione con GFAP negli astrociti della corteccia dorsale e del talamo (Figura 5). NDRG2 e S100ß hanno presentato una colocalizzazione quasi completa negli astrociti delle sei regioni cerebrali(Figure 6 e 8 (b)). GFAP e S100ß hanno presentato una colocalizzazione significativa negli astrociti della corteccia ventrale, del corpo calloso e del peduncolo cerebrale e una colocalizzazione quasi completa negli astrociti dell’ippocampo (Figura 7). GFAP e S100ß non avevano quasi alcuna colocalizzazione negli astrociti della corteccia dorsale e del talamo (Figura 7).
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Abbiamo anche rilevato la colocalizzazione di NDRG2 e un altro produttore di astrociti, glutammina sintetasi (GS), negli astrociti del cervello dei topi. NDRG2 e GS hanno avuto una colocalizzazione significativa negli astrociti (Figura s1a). NDRG2 e GS hanno presentato un’accurata colocalizzazione negli astrociti fibrosi del corpo calloso e negli astrociti protoplasmatici dell’ippocampo (Figura s1b). Espressione della proteina NDRG2 nelle cellule HT22 della linea cellulare neuronale, nelle cellule OLN-93 della linea cellulare oligodendrogliale e nelle cellule MA1800-57 della linea cellulare astrocitica (Figura s2). La proteina NDRG2 è stata rilevata nelle cellule MA1800-57 ed è stata appena rilevata nelle cellule HT22 e nelle cellule OLN-93 (Figure s2a e s2b).
3.4. L’espressione delle proteine NDRG2, GFAP e S100ß in diverse regioni cerebrali
Abbiamo usato western blotting per rilevare i livelli di espressione delle proteine NDRG2, GFAP e S100ß in tre regioni cerebrali di topi maschi adulti (6 mesi): la corteccia, l’ippocampo e il talamo(Figura 8 (c)). Abbiamo analizzato i livelli di espressione di questi marcatori nella stessa regione cerebrale (Figura 8 (d)). Nella corteccia, il livello di espressione NDRG2 era marcatamente superiore ai livelli di espressione GFAP e S100ß (p<0.001, p<0.05). Il livello di espressione di S100ß era anche molto più alto di GFAP (p<0.05). Nell’ippocampo, il livello di espressione GFAP era superiore a NDRG2 e S100ß (p<0.01), e il livello di espressione NDRG2 era leggermente inferiore al livello di espressione S100ß, sebbene la differenza non fosse statisticamente significativa. Nel talamo, il livello di espressione di S100ß era significativamente più alto dei livelli di espressione di GFAP e NDRG2 (p<0.01), mentre il livello di espressione di NDRG2 era simile a quello di GFAP.
Successivamente, abbiamo analizzato i livelli di espressione dello stesso marcatore in diverse regioni cerebrali(Figura 8 (e)). Il livello di espressione di NDRG2 nella corteccia era molto più alto rispetto all’ippocampo e al talamo (p<0,01) e non è stata osservata alcuna differenza significativa tra l’ippocampo e il talamo. Il livello di espressione GFAP nell’ippocampo era il più alto tra le tre regioni (p<0.001, p<0.01); nessuna differenza significativa è stata osservata tra la corteccia e il talamo. Il livello di espressione di S100ß nel talamo era significativamente più alto che nella corteccia e nell’ippocampo (p<0.01), senza alcuna differenza significativa osservata tra gli ultimi due.
Abbiamo anche rilevato i livelli proteici di NDRG2, GFAP e S100ß nella corteccia, nell’ippocampo e nel talamo di topi maschi di età compresa tra 1 mese, 3 mesi, 6 mesi, 9 mesi e 12 mesi (Figure 9(a)-9(f)). I livelli proteici di NDRG2 e GFAP nella corteccia, nell’ippocampo e nel talamo aumentavano gradualmente con l’età (p<0,05, p<0,01). I livelli proteici di S100ß nella corteccia e nel talamo, ma non nell’ippocampo, aumentavano gradualmente con l’età (p<0.05, p <0.01, p< 0.001). I livelli di mRNA di NDRG2, GFAP, e S100ß nella corteccia ippocampo talamo e di topi maschi di età compresa tra 1 mese, 3 mesi, 6 mesi, 9 mesi, 12 mesi sono stati coerenti con quelli dei livelli di proteina (p<0.05, p<0.01, Figure 9(g)-9(i)).
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4. Discussione
In questo studio, abbiamo scoperto che gli astrociti etichettati da NDRG2 e S100ß erano distribuiti in modo più ampio e uniforme rispetto a quelli etichettati da GFAP nell’intero cervello di topi giovani, maturi e vecchi. Ciò suggerisce che NDGR2 e S100ß sono marcatori più appropriati per osservare la distribuzione complessiva e le variazioni del numero di astrociti. Inoltre, i nostri risultati hanno mostrato che gli astrociti in diverse regioni cerebrali presentavano diversi livelli di immunoreattività a NDRG2, GFAP e S100ß, il che suggerisce che, nella corteccia e nel talamo, NDRG2 e S100ß sono marcatori astrocitici più appropriati rispetto a GFAP. L’immunoreattività ineguale degli astrociti a NDRG2, GFAP e S100ß potrebbe anche essere dovuta alla sensibilità e alla specificità degli anticorpi che abbiamo usato. Inoltre, le morfologie degli astrociti etichettati da NDRG2 e S100ß erano simili tra loro, ma erano ovviamente distinte da quelle etichettate da GFAP perché questi marcatori etichettavano diverse strutture citoscheletriche. NDRG2 colora il citoplasma e le membrane cellulari e macchia debolmente il nucleo . GFAP macchia principalmente il soma e i processi, ma non il nucleo, mentre S100ß colora il nucleo e parte del citoplasma e dei processi . Confrontando le morfologie degli astrociti etichettati da NDRG2, GFAP e S100ß, abbiamo scoperto che GFAP era un marker più adatto per gli astrociti nel corpo calloso, nel peduncolo cerebrale e in particolare nell’ippocampo. Le proteine NDRG2 e S100ß sono state espresse maggiormente nella corteccia e nel talamo, rispettivamente. Deduciamo che NDRG2 è più adatto per gli astrociti nella corteccia mentre S100ß è più adatto per gli astrociti nel talamo quando si quantifica la densità astrocitica. I diversi modelli di espressione proteica di NDRG2, GFAP e S100ß nella corteccia, nell’ippocampo e nel talamo hanno confermato l’eterogeneità funzionale astrocitica.
Gli astrociti hanno un ruolo importante nel mantenimento dell’omeostasi e partecipano attivamente a quasi tutti i disturbi neurologici, come ictus ischemico, lesioni cerebrali traumatiche, malattia di Alzheimer e malattia di Parkinson . È stato dimostrato che la morfologia astrocitica, l’espressione genica e la funzione differivano tra le diverse regioni del cervello . Gli astrociti fibrosi e gli astrociti protoplasmatici sono due sottopopolazioni principali identificate dalla loro morfologia . Gli astrociti fibrosi hanno processi lunghi e sottili e un aspetto simile a una stella, mentre quelli protoplasmatici hanno numerosi processi fini, che contattano e foderano le sinapsi . È interessante notare che molti geni sono espressi in modo eterogeneo da sottoinsiemi di astrociti. Questi geni codificano proteine come i trasportatori del glutammato e i canali ionici , così come i recettori del glutammato , della dopamina e degli oppioidi .
L’eterogeneità dell’espressione genica implicava la diversità funzionale degli astrociti. Ad esempio, l’assorbimento del glutammato differisce tra diversi sottoinsiemi . Inoltre, le oscillazioni spontanee del calcio differiscono tra i diversi strati della corteccia somatosensoriale. Gli astrociti dello strato corticale 1 hanno mostrato frequenti attività asincrone Ca2+, mentre gli astrociti dello strato 2/3 hanno mostrato un’attività sincrona Ca2 + poco frequente . Nella corteccia, gli astrociti rispondono al glutammato e alla noradrenalina con aumenti di calcio, mentre gli astrociti ippocampali mostrano risposte di calcio all’ATP, al GABA, al glutammato, all’acetilcolina, alle prostaglandine e agli endocannabinoidi . Gli studi hanno anche dimostrato che gli astrociti coltivati provenienti da diverse regioni del cervello hanno diverse capacità di stimolare la crescita e la ramificazione dei neuriti . Poiché gli astrociti in diverse regioni del cervello presentano diverse caratteristiche di morfologia e funzione, identificare il marker più appropriato per gli astrociti in diverse regioni cerebrali è cruciale per i ricercatori astrocitici.
Sebbene diverse proteine siano state segnalate come selettivamente espresse dagli astrociti, nessuna ha dimostrato di essere interamente limitata a tutti i sottotipi astrocitici. GFAP, il marker astrocitico più utilizzato, è espresso preferenzialmente in astrociti di materia bianca rispetto a quelli di materia grigia e non riesce a etichettare tutti i processi degli astrociti . Ancora più importante, ci sono sottoinsiemi di astrociti negativi GFAP che presentano correnti K + dipendenti dalla tensione, mentre gli astrociti positivi GFAP presentano il modello classico delle correnti indipendenti dal tempo e dalla tensione .
Studi precedenti hanno scoperto che S100ß era in grado di etichettare gli astrociti sia nella materia grigia che in quella bianca; tuttavia, era anche espresso in alcuni oligodendrociti e neuroni . S100ß è stato trovato per essere espresso più negli astrociti del talamo, un sottotipo di cellule che partecipano alla pulizia dei detriti daergici prodotti dalla degenerazione dei terminali daergici nella malattia di Parkinson facilitando la presenza di lisosomi e la formazione di autofagosomi . L’analisi trascrittomica degli astrociti ha identificato la famiglia di aldeide deidrogenasi 1, membro L1 (ALDH1L1), come marker astrocitico . Tuttavia, ALDH1L1 ha anche etichettato oligodendrociti . Allo stesso modo, i trasportatori eccitatori di aminoacidi glutammato/aspartato transporter (GLAST), glutammina sintetasi (GS), glutammato transporter-1(GLT-1), vimentina, connexin 43, aquaporin 4, e la superficie cellulare glicoproteina CD44 aveva anche limitazioni durante l’etichettatura astrociti .
NDRG2 è specificamente espresso negli astrociti di ratti e topi ed è associato alla crescita e alla maturazione del cervello embrionale in via di sviluppo . Oltre alla proliferazione cellulare, alla differenziazione e ai trasporti transmembrana, NDRG2 partecipa anche alle risposte allo stress, alla depressione, alle malattie ischemiche e ai disturbi neurodegenerativi . Nei topi e nell’uomo, NDRG2 partecipa allo sviluppo del disturbo da deficit di attenzione/iperattività (ADHD), una malattia associata al centro di locomozione nella corteccia cerebrale . Flugge et al. rilevato l’espressione di NDRG2 nei cerebrum di esseri umani, uistitici, toporagni, ratti e topi, e suggerito NDRG2 era un nuovo marcatore astrocitico, soprattutto per gli astrociti maturi, non reattivi e non proliferanti . In questo studio, abbiamo prima rilevato il modello di distribuzione di astrociti NDRG2-positivi in diverse regioni cerebrali e differenze con gli astrociti etichettati dai marcatori classici GFAP e S100ß.
Gli astrociti e i marcatori astrocitici sono cambiati durante il normale invecchiamento cerebrale. Il lavoro precedente ha dimostrato che gli astrociti sono attivati all’inizio dell’invecchiamento e il significativo aumento degli astrociti positivi al GFAP è stato trovato nelle regioni ippocampali dei topi invecchiati . I livelli sia della proteina GFAP che dell’mRNA GFAP sono aumentati in varie parti del cervello che invecchia, come la corteccia cerebrale, l’ippocampo e il cervelletto . Le discrepanze rimangono tra i vari rapporti di S100ß nel cervello che invecchia . Sempre più spesso, gli studi hanno dimostrato che NDRG2 è associato a disturbi legati all’età come il morbo di Alzheimer. Nel nostro studio, i livelli di mRNA GFAP e NDRG2 nella corteccia, nell’ippocampo e nel talamo aumentavano gradualmente con l’età, mentre i livelli di mRNA S100ß nell’ippocampo e nel talamo aumentavano con l’età, ma non nella corteccia.
Dovremmo notare che, attualmente, molti marcatori oltre a quelli che abbiamo testato, come ALDH1L1, GLAST, GLT-1, CD44 e vimentin, sono usati per etichettare gli astrociti. Nel nostro studio, abbiamo solo confrontato gli astrociti cerebrali classici etichettati dal nuovo marcatore proposto NDRG2 e i marcatori più comunemente usati: GFAP, S100ß e GS nel cervello.
In conclusione, il nostro studio indica che NDRG2 e S100ß sono marcatori più appropriati per gli astrociti nella corteccia e nel talamo, rispettivamente, nonché per osservare la distribuzione complessiva e i cambiamenti nel numero di astrociti in tutto il cervello. Nel frattempo, GFAP è superiore a NDRG2 e S100ß quando si etichettano i processi e i rami degli astrociti nel corpo calloso, nel peduncolo cerebrale e in particolare nell’ippocampo. Il nostro studio mostra l’importanza di scegliere il marker più appropriato per gli astrociti in diverse regioni cerebrali del topo, che fornisce una guida per i ricercatori di neuroscienze quando esplorano le funzioni astrocitiche.
Disponibilità dei dati
I dati utilizzati per supportare i risultati di questo studio sono inclusi nell’articolo.
Disclosure
Zengli Zhang e Zhi Ma sono i co-primi autori.
Conflitti di interesse
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Contributi degli autori
Zengli Zhang e Zhi Ma hanno contribuito ugualmente a questo studio.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Beijing Natural Science Foundation (no. 7194321 a Lixia Zhang), dalla National Natural Science Foundation of China (no. 81801138 a Yulong Ma, no. 81771206 a Wangyuan Zou), dalla Young Scholar Research Grant of Chinese Anesthesiologist Association (no. 21700001 a Yulong Ma), dalla Miaopu Foundation of Chinese PLA Ospedale Generale (n. 18KMM47 a Lixia Zhang) e la scienza municipale di Pechino & Commissione tecnologica (n. 1811000017180022 per appendere Guo).
Materiali supplementari
Figura supplementare 1. La colocalizzazione di NDRG2 e GS all’interno di astrociti. Figura complementare 2. L’espressione della proteina NDRG2 nelle linee cellulari. (Materiali supplementari)