Il meccanismo di resistenza di Escherichia coli indotta da ampicillin in laboratorio

Introduzione

Patogeni di Escherichia coli è spesso causa di diarrea, sepsi, e altri sintomi clinici, ed è ancora uno dei principali patogeni intestinali influenzano la salute umana e animale. L’ampicillina (AMP), un antibiotico β-lattamico semi-sintetico, è ampiamente usato per trattare l’infezione da E. coli umana e animale, ma recentemente il suo tasso di resistenza è aumentato.1-3 AMP funziona sulla fase di replicazione attiva dei batteri, inibendo la sintesi della parete cellulare batterica. I batteri spesso resistono a tali antibiotici nei seguenti modi: codifica β-lattamasi, cambia la proteina bersaglio nella parete cellulare, riduce la permeabilità della membrana esterna e aumenta l’espressione della pompa di efflusso del farmaco. I farmaci antibatterici sono usati dagli animali e poi si diffondono nell’ambiente attraverso gli escrementi, che non solo rendono l’ambiente inquinato, ma portano anche gravi danni alla salute umana e allo sviluppo sostenibile dell’industria dell’allevamento.4,5

Il sequenziamento dell’intero genoma (WGS) ha dimostrato di guidare la prevenzione e il controllo della resistenza batterica.6 Il polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) si riferisce principalmente al polimorfismo della sequenza del DNA causato dalla variazione di un singolo nucleotide a livello genomico e l’analisi di resequencing per schermare i diversi SNPS può studiare più direttamente la resistenza ai farmaci. Abbiamo simulato il processo di antibiotici clinici negli organismi utilizzando il metodo di induzione di laboratorio AMP, ed esplorato la relazione tra il grado di resistenza ai farmaci e il sito di mutazione. Screening per polimorfismo non-sinonimico a singolo nucleotide (non-SNP) tra ceppi resistenti ai farmaci e sensibili per comprendere il ruolo del non-SNP nei ceppi resistenti ai farmaci. Lo scopo di questo studio è comprendere la legge e il meccanismo della resistenza ai farmaci di E. coli, fornire nuovi obiettivi per lo sviluppo di nuovi antibiotici, fare l’uso razionale degli antibiotici e risolvere l’insorgenza multipla e il trattamento della resistenza multi-farmaco di E. coli nella pratica clinica.

Materiali e metodi

Isolati batterici e reagenti

Il ceppo di E. coli utilizzato in questo studio (E. coli 15743) è stato isolato da un campione di feci da un paziente in un ospedale a Suixian, provincia di Henan, Cina, nel 2015. La caratterizzazione di questo ceppo con il metodo di diffusione della carta Kirby Bauer (K-B) ha mostrato che il ceppo era sensibile a otto classi di 20 antibiotici. E. coli ATCC 25922 è stato usato come controllo per il nostro studio.

M-H brodo medio e M-H solido medio (Oxoid company, UK), carta sensibile farmaceutica (Hangzhou Binhe microbial company, Hangzhou, Cina), AMP prodotti standard (Chinese drug identification Institute, Pechino, Cina), kit di estrazione del DNA (Shanghai Laifeng Biotech company, Shanghai, Cina). Illumina Hiseq è stato fatto a Shanghai Lingen Biotechnology Co., Ltd.

L’E. coli utilizzato nell’esperimento è stato specificamente isolato per questo studio. Lo studio è stato approvato dal Comitato etico di scienze della vita dell’Università di Zhengzhou e il paziente ha anche firmato il consenso informato scritto.

Processo di induzione

La concentrazione inibitoria minima (MIC) è stata determinata con il metodo di diluizione del microbroth.7-9 Il ceppo di E. coli (isolato dalla clinica e hanno valore MIC) che è sensibile a AMP è stato coltivato in MH solido mezzo, 37 ° C cultura dopo 18-24 ore, scegliere una singola colonia in 8 ml M-H liquido mezzo per l’amplificazione di batteri. La soluzione di batteri di cui sopra è stata coltivata in un mezzo liquido MH contenente 1/2MIC AMP, rispettivamente, e la concentrazione di AMP è stata continuamente aumentata durante il processo di sottocultura. Quando la concentrazione di antibiotici ha raggiunto 16 µg / mL, 8 µg/mL è stata aumentata ogni volta e ogni concentrazione è stata sottoculturata due volte. Quando il valore del cambiamento MIC di un farmaco era maggiore o uguale a quattro volte MIC prima e dopo l’induzione, si è ritenuto che il cambiamento MIC dopo l’induzione avesse un significato significativo.10 Il mezzo di coltura del brodo M-H senza antibiotici è stato utilizzato come controllo durante l’intero processo.

Multilocus sequence typing (MLST) di E. i ceppi di coli sono stati classificati da sette coppie di geni di pulizia contenenti adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA e recA.

Test di suscettibilità

Il metodo di diffusione della carta Kirby Bauer è stato utilizzato per schermare l’E. coli che era sensibile a otto tipi di antibiotici, tra cui aminoglicosidi, penicilline, cefalosporine, tetraciclina, inibitori della β-lattamasi, carbammati, sulfonamidi e chinoloni. I ceppi indotti sono stati ripetuti utilizzando il test di sensibilità al farmaco. L’interpretazione dei dati è stata eseguita in conformità con le linee guida Clinical and Laboratory Standards Institute 2016.11

In primo luogo, abbiamo indotto la resistenza di E. coli ad AMP, coltivando E. coli con gradualmente aumentiamo la concentrazione di AMP (2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, e 256 µg / mL). Dopo aver ottenuto il ceppo di resistenza, abbiamo confrontato lo spettro di resistenza di 20 antibiotici tra il ceppo indotto (E. coli 15743-256, indotto a 256 µg/mL) e il ceppo originale (E. coli 15743) eseguendo test di sensibilità ai farmaci. La sospensione batterica è stata stesa su una piastra di agar, con un piccolo pezzo di carta circolare contenente diversi antibiotici, e coltivata a 37°C per 16-20 ore. È stato misurato il diametro dell’anello antimicrobico.

WGS e resequencing analysis

I ceppi a valori MIC di 32 e 256 sono stati denominati rispettivamente come E. coli 15743-32 e E. coli 15743-256. L’analisi dell’intero genoma è stata eseguita sui ceppi sensibili primari e il resequencing è stato eseguito su ceppi resistenti indotti. I risultati del resequencing sono stati confrontati con quelli della mappa originale. Screening non SNPS che possono influenzare la funzione proteica.

Il sequenziamento è stato eseguito da Shanghai ling’en Biotechnology Co. Ltd. (Shanghai, Cina). Illumina Hiseq combinato con la tecnologia di sequenziamento di terza generazione è stato utilizzato per completare il sequenziamento genomico dei ceppi in questo progetto.

RT-PCR

Rimuovere il DNA trascritto inverso dal congelatore a 4°C e preparare la concentrazione desiderata del reagente secondo le istruzioni. Accendere lo strumento ABI Fast7500, impostare 95°C per 30 s, reagire per 40 cicli, 95 ° C per 3 s, 60°C per 30 s e sciogliere la curva per 95°C per 15 s, 60°C per 60 s e 95°C per 15 s. Aggiungere il campione al tubo EP a 8 file, tre pozzetti replicati per campione e rimuovere le bolle mediante centrifugazione. Il valore CT medio di ciascun campione è stato registrato dopo il completamento della reazione. Il livello di espressione relativa del gene di interesse è stato calcolato utilizzando 2-ΔΔCT. (ΔCT = Valore CT del gene bersaglio – Valore CT del gene di riferimento interno. ΔΔCT = campione sperimentale ΔCT-gruppo di controllo ΔCT.)

Analisi bioinformatica

Il software SWISS-MODEL è stato utilizzato per analizzare la sequenza aminoacidica della proteina codificata prima e dopo la mutazione del gene e prevedere la struttura terziaria delle proteine.12,13

Analisi statistica

SPSS17.0 è stato utilizzato per una semplice analisi di regressione lineare e l’equazione di regressione è stata testata. La dimensione di un test era 0,05 (α=0,05).

Risultati

Risultati del test di suscettibilità ai farmaci

I nostri dati hanno mostrato che E. coli 15743 era sensibile a 20 diversi antibiotici. Dopo l’induzione, E. coli 15743-256 era resistente ad AMP, piperacillina, cefuroxima, cefazolina, cefoxitina, AMP/sulbactam, amoxicillina/acido clavulanico, piperacillina/tazobactam e aztreonam, ma ancora sensibile ai restanti 11 antibiotici (Tabella 1, si noti che gli intermediari sono stati definiti come resistenza ai farmaci). I nostri risultati hanno indicato che l’E. coli sensibile originale non solo era indotta resistente ad AMP, ma anche resistente ad una varietà di altri antibiotici ed è diventato multi-farmaco resistente durante l’induzione.

Tabella 1 Antibatterico anello del diametro di Escherichia coli

L’insorgenza di resistenza ai farmaci (determinato dal MIC valore) durante l’induzione

Per studiare la cinetica del farmaco-resistenza, abbiamo colto E. coli con l’aumento della concentrazione di AMP per periodi diversi e misurato MIC a ciascuna concentrazione, come indicato nella Tabella 2. L’analisi di regressione è stata eseguita sul valore MIC e sul tempo di induzione utilizzando SPSS 17.0. L’equazione di regressione era y = 1.0435 lnx-0.7316. È stato valutato l’effetto di adattamento dell’equazione, R2=0,9605, P<0,05. Il valore MIC che raggiunge 32 µg / mL è il valore critico e il valore MIC è aumentato più velocemente prima di raggiungere 32 µg / mL rispetto a dopo (Tabella 2).

Tabella 2 Il valore MIC di E. coli 15743 nel tempo e concentrazione indotta

Nel frattempo, la parte con valore MIC inferiore o uguale a 32 µg/mL è stata selezionata per l’analisi di regressione e l’equazione di regressione era y=0,0358 x+1,2812. È stato valutato l’effetto di adattamento dell’equazione, R2=0,991, P<0,05. Il valore MIC di E. coli 15743 è aumentato con l’aumento della concentrazione di induzione e del tempo di induzione (Figura 1).

Figura 1 La variazione del valore MIC nel tempo.Abbreviazione: MIC, minimum inhibitiveconcentration.

Risultati MLST

Per dimostrare che il ceppo indotto (E. coli 15743-256) era effettivamente derivato dal ceppo originale (E. coli 15743), abbiamo eseguito MLST di due ceppi sopra. Il DNA genomico è stato estratto dal corredo batterico dell’estrazione del DNA, PCR amplificato e sequenziato da Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Blast ricerca del database NCBI indicato che questi due ceppi hanno identici, tipo MLST, adk-13, fumC-363, gyrB-302, icd-97, mdh-17, purA-94, e recA-93. I nostri dati indicano che il processo di induzione non è stato contaminato e il ceppo resistente E. coli 15743-256 è stato derivato dal ceppo sensibile E. coli 15743.

Analisi dell’intero genoma

E. coli 15743 conteneva 4408 geni, 22 rRNA e 85 tRNA. La densità genica era 0,945 kb, il contenuto di GC era 51.7%, la percentuale del gene era 88,3%, la lunghezza della regione intergenica era 545,151, il contenuto di GC della regione intergenica era 42,6% e la regione intergenica rappresentava l ‘ 11,7% del genoma. Le caratteristiche dei genomi di E. coli 15743 sono riassunte nella Figura 2. E. coli 15743 non conteneva plasmidi.

Figura 2 La mappa genomica di E. coli 15743.Note: Il cerchio più esterno della mappa cerchio è il logo genoma dimensioni, ogni scala è 0.1 Mp. Il secondo e il terzo cerchio sono CD sulle catene positive e negative e i diversi colori indicano diverse classificazioni dei COG dei CDS. Il quarto cerchio è rRNA o tRNA. Il quinto cerchio è il contenuto di GC e la parte rossa esterna indica che il contenuto di GC nella regione è superiore al contenuto medio di GC dell’intero genoma. Più alto è il valore di picco indica maggiore è la differenza dal contenuto medio di GC, e la porzione blu verso l’interno indica che il contenuto di GC nella regione è basso. Per il contenuto medio di GC dell’intero genoma, un picco più alto indica una maggiore differenza rispetto al contenuto medio di GC. Il cerchio più interno è il valore GC skew. L’algoritmo specifico è G-C o G + C. Quando il valore è positivo in senso biologico, la catena positiva tende a trascrivere i CD. Quando è negativo, la catena negativa tende a trascrivere CD.Abbreviazione: COG, Cluster di gruppi ortologhi di proteine.

La mappa del genoma del ceppo include la distribuzione dei geni sulle catene di giustizia e antisenso, funzionale classificazione di Ammassi di Orthologous Gruppi di proteine (COG), contenuto di GC, genoma isola, e geni omologhi, che può visualizzare completamente le caratteristiche del genoma.

COG

La classificazione funzionale di COG di E. coli 15743 ha mostrato che la maggior parte dei geni erano correlati al trasporto e al metabolismo degli aminoacidi, al trasporto e al metabolismo dei carboidrati, alla produzione e alla conversione di energia, solo alla previsione generale della funzione, al trasporto e al metabolismo degli ioni inorganici e alla biogenesi dell’involucro cellulare (Figura 3).

Figura 3 La classificazione funzionale di INGRANAGGIO di E. coli 15743.Abbreviazione: COG, Cluster di gruppi ortologhi di proteine.

Non SNPs

Per determinare se c’è stato un cambiamento in E. coli genoma dopo l’induzione di il ceppo originale, abbiamo eseguito un’analisi genome-wide di sequenziamento dei indotta da ceppi resistenti (E. coli 15743-32 e E. coli 15743-256) e analizzato il numero di mutazioni e il sito della mutazione.

Rispetto al ceppo originale di E. coli (E. coli 15743), c’erano nove non-SNP in due ceppi indotti resistenti ai farmaci, inclusi tre non-SNP condivisi, che erano presenti nei geni orf00819, orf01200 e orf02235. Altri non-SNPs erano presenti nei geni orf01916, orf00490, orf03479, orf04094. Tre mutazioni non-SNPs si sono verificate nel gene orf03479 e solo una mutazione SNP si è verificata in ciascuno dei geni rimanenti. Tre non-SNPs erano in geni che codificano le proteine della membrana cellulare. Tre erano in geni con funzioni sconosciute. Uno era correlato al trasporto e al metabolismo dello ion inorganico, uno era correlato alla trascrizione e uno era correlato ai meccanismi di trasduzione del segnale (Tabella 3).

la Tabella 3 non-analisi di SNPs risultati di E. coli 15743-32 e E. coli 15743-256

i Nostri dati hanno mostrato che c’erano quattro non SNPs in E. coli 15743-32, che erano quattro geni. C’erano otto non-SNPs in E. coli 15743-256, distribuiti su sei geni. La classificazione funzionale del COG ha mostrato che la maggior parte dei geni erano correlati al trasporto e al metabolismo degli aminoacidi, al trasporto e al metabolismo dei carboidrati, alla produzione e alla conversione di energia, solo alla previsione generale della funzione, al trasporto e al metabolismo degli ioni inorganici e alla biogenesi dell’involucro cellulare.

RT-PCR

Intero genoma re-sequenziamento E. coli 15743-32 e E. coli 15743-256, fluorescente in tempo reale quantitativa PCR rilevamento di geni di consenso. I geni in cui si verificano non SNPs sono stati sottoposti a screening e E. coli 15743-32 ed E. coli 15743-256 aveva tre geni identici (orf00819, orf01200, orf02235), e i livelli di espressione di questi geni in ogni ceppo generazione sono mostrati in Figura 4A–C, rispettivamente.

Figura 4 Risultati dell’espressione del mRNA nelle diverse generazioni di ceppi.

RT-PCR ha mostrato che i geni orf01200, orf00819, orf02235 hanno mostrato un’elevata espressione in ceppi resistenti (E. coli 15743-32, E. coli 15743-64, E. coli 15743-128, E. coli 15743-256).

Previsione della struttura proteica

La struttura terziaria cambia solo nelle proteine codificate dai geni orf01200 e orf04094 e i risultati previsti sono mostrati nelle figure 5 e 6.

Figura 5 La struttura terziaria della proteina codificata dal orf01200 gene.Note: (A) Prima della mutazione; (B) dopo la mutazione.

Figura 6 La struttura terziaria della proteina codificata dal orf04094 gene.Note: (A) Prima della mutazione; (B), dopo la mutazione.

Prima della mutazione di orf01200, 2hrt.1.A è stato selezionato come proteina modello di riferimento (Figura 5A). La gamma di modelli di infrastruttura residua era 2-1033, la somiglianza della sequenza era 0.59, e la copertura del modello era 1.00. Dopo la mutazione di orf01200, 1iwg.1.A è stato selezionato come proteina modello di riferimento (Figura 5B). La gamma di modelli di infrastruttura residua era 7-1036, la somiglianza della sequenza era 0,59 e la copertura del modello era 1,00.

Prima della mutazione di orf04094, 4cti.1.B è stata selezionata come proteina modello di riferimento (Figura 6A). La gamma di modelli di infrastruttura residua era 184-436, la somiglianza della sequenza era 0,56 e la copertura del modello era 0,59. Dopo la mutazione di orf04094, 3ib7. 1.A è stato selezionato come proteina modello di riferimento (Figura 6B). La gamma del modello di infrastruttura residua era 10-262, la somiglianza della sequenza era 0,33 e la copertura del modello era 0,91.

Discussione

L’analisi di regressione del MIC e del tempo di induzione ha mostrato che il valore MIC del ceppo è aumentato con l’aumento della pressione antibiotica esogena e del tempo di induzione. Liu et al, hanno dimostrato che durante l’induzione della resistenza di E. coli da parte di imipenem, il valore MIC è aumentato nel tempo.14 Anche quando la concentrazione indotta ha raggiunto 128 volte il valore MIC del ceppo primario, l’induzione è stata continuata e il valore MIC ha continuato ad aumentare con l’induzione. Coerentemente con i risultati di questo studio, il valore MIC di E. coli è aumentato con il tempo e la concentrazione indotta. Mostra che se la dose non è limitata, la resistenza del ceppo diventerà sempre più seria.

AMP è stato indotto a E. coli 15743 per 63 ore (MIC ha raggiunto 32 µg/mL) e il valore MIC è stato otto volte quello del ceppo suscettibile. Prima di ciò, il valore MIC aumentava rapidamente, mentre quando veniva indotto a un valore MIC di 32 µg / mL, l’induzione continuava e il tasso di crescita del valore MIC diminuiva. Considerando che la resistenza batterica può verificarsi poco prima di raggiungere la soglia di resistenza ai farmaci (valore MIC di 32 µg/mL). Dopo aver raggiunto il valore critico, i batteri possono essere pigri e crescere lentamente, ma il valore MIC continua ad aumentare. Si ritiene inoltre che questo ceppo attivi determinati meccanismi di resistenza e modifichi lo stato di resistenza ai farmaci dei batteri.

Zhang et al, hanno dimostrato che il cloramfenicolo ha indotto la Shigella sensibile allo stato resistente ai farmaci e il suo spettro di resistenza ai farmaci cambierebbe.10 Di conseguenza, la Shigella non era solo resistente al cloramfenicolo, ma anche resistente ad altri tipi di antibiotici. Coerentemente con i risultati di questo studio, lo spettro di resistenza ai farmaci di E. coli è stato amplificato dopo induzione. I risultati hanno mostrato che E. coli 15743-256 non era solo resistente ad AMP, ma anche a piperacillina, cefuroxima, cefazolina, cefoxitina, AMP/sulbactam, amoxicillina/acido clavulanico, piperacillina/tazobactam e aztreonam erano anche resistenti. Si ritiene che durante l’induzione di E. coli da parte di AMP, il sistema di espressione di AcrAB-TolC sia attivato, o più di uno dei più sistemi di pompa di efflusso sia attivato, e ci sono altri meccanismi di resistenza diversi dal meccanismo di efflusso.

Il meccanismo molecolare della resistenza batterica non è ancora chiaro. Al fine di indagare il meccanismo molecolare specifico di E. resistenza coli a AMP, analisi batterica WGS è stata eseguita. I risultati del sequenziamento sono stati confrontati con la sequenza di riferimento e 20 SNPS sono stati sottoposti a screening dalla sequenza di E. coli 15743-32, 4 dei quali erano SNPS non sinonimi. Ventisei SNP sono stati sottoposti a screening dal ceppo E. coli 15743-256, otto dei quali erano SNP non sinonimi. Xiang et al, hanno dimostrato che il livello di resistenza dei ceppi mutanti era superiore a quello dei ceppi non mutanti, e c’era una reazione quantitativa tra mutazioni puntiformi e livelli di resistenza batterica, e mutazioni genetiche multiple potrebbero migliorare la resistenza dei batteri agli antibiotici.15 Coerentemente con i risultati di questo studio, il numero di geni mutanti in E. coli 15743-32 era inferiore a E. coli 15743-256, indicando che il numero di mutazioni può essere correlato al grado di resistenza ai farmaci e più siti di mutazione, maggiore è il grado di resistenza ai farmaci.

Dopo il sequenziamento, i non-SNP sottoposti a screening in questo esperimento sono stati distribuiti nei geni di orf00490, orf00819, orf01916, orf01200, orf02235, orf03479 e orf04094. Tra questi, i geni orf00490, orf00819 e orf01916 sono coinvolti nella sintesi della parete cellulare. Le annotazioni in KEGG sono fumarato reduttasi subunità D (frdD), divisione cellulare proteina ftsI (penicillina-binding protein 3) e porina membrana esterna proteina Omd, rispettivamente. Gli studi hanno dimostrato che il gene frd codifica un enzima FRD per catalizzare la conversione tra fumarato reduttasi e succinato deidrogenasi.16 È stato anche scoperto che l’amplificazione del gene frdD utilizzando un vettore plasmidico può aumentare la resa di acido succinico.17,18 In combinazione con questo studio, si ritiene che il gene frdD sia coinvolto in alcune vie metaboliche, forse associate alla resistenza AMP. In E. coli, gli obiettivi principali degli antibiotici β-lattamici sono PBP1 (mantenimento della morfologia cellulare), PBP2 (mantenimento della tensione e della forma dell’asta di E. coli) e PBP3 (correlato alla divisione batterica). PBP3 è un componente principale delle proteine di divisione cellulare che catalizzano il cross-linking dei peptidoglicani della parete cellulare durante la divisione cellulare.19-22 Studi hanno dimostrato che la down-regolazione della proteina Omd e dell’espressione genica Omd nei biofilm batterici porta a una diminuzione della permeabilità della membrana cellulare e ad una maggiore resistenza agli antibiotici.23,24 Coerentemente con i risultati di questo studio, la mutazione del gene Omd avvia un meccanismo di resistenza batterica agli antibiotici β-lattamici e la diminuzione della permeabilità della membrana cellulare di E. coli è una delle ragioni per l’aumentata resistenza all’AMP. Si ritiene che questi cambiamenti nella funzione delle proteine codificate dai geni coinvolti nella sintesi della parete cellulare influenzino la resistenza dei batteri all’AMP.

I geni orf04094, orf01200, orf02235 sono annotati in KEGG come sensore di pressione osmotica istidina chinasi (envZ), gene della pompa di efflusso multi-farmaco (acrB) e proteina di resistenza multi-farmaco coinvolta nella regolazione trascrizionale (marR). Negli ultimi anni, il meccanismo di efflusso attivo è la ragione principale della resistenza ai farmaci multipli dei batteri.25-27 Poiché la maggior parte del sistema di effluenti trasporta ampiamente i substrati e molti sistemi di effluenti attivi possono esistere negli stessi batteri, questo sistema può portare alla resistenza batterica a vari farmaci antibatterici con strutture completamente diverse, vale a dire resistenza multipla. Nello studio di Marlen Adler, le mutazioni nel gene ftsI da solo non hanno aumentato la resistenza agli antibiotici, mentre le mutazioni del gene ftsI e envZ hanno aumentato la MIC degli antibiotici più volte. Cohen et al, hanno dimostrato che la funzione della proteina inibitoria codificata dal gene MARR mutato sarebbe ridotta e l’effetto dei batteri sulla resistenza multipla degli antibiotici era piccolo quando la mutazione MarR veniva rilevata solo.28 Merric et al, hanno scoperto che E. coli ha mostrato solo bassi livelli di resistenza multi-farmaco quando il gene MarR è stato mutato.29 I risultati di questo studio hanno mostrato che più geni sono stati simultaneamente mutati e la resistenza di E. coli all’AMP è aumentata.

Gene orf03479 è annotato come valina glicina ripetere G (VgrG) proteina in KEGG. Il sistema di secrezione di tipo VI (T6SS) è un sistema correlato ai fagi che esiste in molti patogeni batterici, come E. coli, Pseudomonas aeruginosa e Burkholderia cenocepacia. I fattori effettori possono essere secreti all’extracellulare dei batteri e il sistema di secrezione proteica è strettamente correlato alla virulenza dei batteri patogeni. Wang Jianfeng et al, hanno dimostrato che la mutazione del gene VgrG influenza la tossicità e la resistenza ai farmaci dei batteri, ma la funzione della proteina di ripetizione del glutammato valina non è ancora chiara.30 Questo studio ritiene che il gene VgrG possa essere associato alla resistenza AMP e il suo meccanismo necessita di ulteriori indagini.

In sintesi, la funzione COG di questi geni mutanti è correlata all’origine delle membrane cellulari, al trasporto e al metabolismo degli ioni inorganici, ai meccanismi di trascrizione e trasduzione del segnale. Gli studi hanno dimostrato che sotto stress antibiotico, i batteri possono assumere sia la difesa attiva che la difesa passiva per garantire la loro sopravvivenza.31 In difesa passiva, i batteri si rendono dormienti, riducono la vitalità della vita e bloccano la combinazione di antibiotici e target per ridurre l’effetto di uccisione degli antibiotici. In difesa attiva, aumentano l’attività della pompa di efflusso per aumentare l’efflusso di antibiotici e ridurre l’accumulo di antibiotici nei batteri, riducendo così l’effetto di uccisione degli antibiotici sui batteri. Questo studio suggerisce che la resistenza di E. coli all’AMP è una combinazione di sistemi di difesa attiva e sistemi di difesa passiva. La resistenza ai farmaci può verificarsi poco prima che il valore MIC batterico raggiunga la soglia di resistenza ai farmaci. I geni frdD, ftsI, acrB ,pDd, marR, VgrG e envZ sono associati alla resistenza dell’AMP. Questi studi aiuteranno a migliorare il meccanismo molecolare di E. coli resistente agli antibiotici β-lattamici e forniranno una base di ricerca per la prevenzione e il controllo dei batteri multiresistenti ai farmaci e degli obiettivi di nuovi antibiotici.