RISULTATI E DISCUSSIONE
Diabrotica è un genere del Nuovo Mondo di coleotteri crisomelidi che è principalmente neotropicale nella sua distribuzione e la cui origine è probabilmente la regione del Sud America centrale o tropicale (28). Oggi il suo areale comprende la maggior parte degli Stati Uniti ad est delle Montagne Rocciose e a nord del 35 ° parallelo, gli stati del Messico a nord-ovest di Durango (esclusa la Baja, CA), le aree meridionali dell’Ontario, Canada e una recente introduzione nell’Europa orientale (29). La distribuzione di D. V. zeae comprende un’area dal Guatemala in tutto il Messico centrale nel panhandle del Texas e parti dell’Oklahoma meridionale (28). L’espansione della produzione di mais potrebbe anche aver facilitato il movimento del D. v. zeae verso nord dal Messico, risultando in una regione di contatto secondario con D. V. virgifera nel Texas settentrionale, dove le sottospecie si ibridano (13).
Gli adulti di D. V. zeae campionati da Stephenville e Uvalde nel sud del Texas non sono stati infettati con Wolbachia mentre gli adulti di D. v. virgifera da 15 siti all’interno degli Stati Uniti e la distribuzione canadese di D. v. virgifera sono risultati positivi per Wolbachia, ad eccezione di due siti a Duncan e Willcox, AZ. Anche ventuno adulti provenienti da tre siti all’interno della zona ibrida del Texas settentrionale sono risultati positivi, inclusi cinque esemplari con modelli di indice all’interno della gamma di variazioni di D. V. zeae (J. Krysan comunicazione personale). Le sequenze del gene ftsZ di Wolbachia da singoli individui di Urbana, IL, Moriarty, NM e Blacksburg, VA, erano identiche. Inoltre, la digestione con DraI del frammento ftsZ ottenuto con (i) primer specifici B generali, (ii) ftsZf1 e (iii) ftsZr1 ha indicato che le popolazioni di D. v. virgifera provenienti da tutte le posizioni campionate portano lo stesso ceppo di Wolbachia. Un’analisi filogenetica usando il gene 16S rRNA ha posto questo ceppo in una posizione basale con una relazione irrisolta con altri ceppi di Wolbachia (risultati non mostrati). Il gene ftsZ (23, 30) ha anche identificato la Wolbachia di D. v. virgifera come ceppo basale e distinto dalla maggior parte degli altri ceppi del gruppo A (Fig. 1). Data la consistenza dell’infezione e del tipo di ceppo in tutta la distribuzione di D. v. virgifera, così come la rapida diffusione di questa specie in Nord America, suggeriamo che l’infezione si sia verificata negli Stati Uniti sud-occidentali o nel Messico nord-occidentale prima dell’espansione verso est di D. v. virgifera negli Stati Uniti e in Canada. Il D. V. non infetto. le popolazioni di virgifera nel sud dell’Arizona possono essere i resti della popolazione non infetta originale o potrebbero rappresentare popolazioni isolate che hanno perso l’infezione.
Uno dei 36 alberi ugualmente più parsimoniosi stimati utilizzando una sequenza di DNA parziale del gene ftsZ. Gli asterischi indicano i rami supportati da tutti gli alberi più parsimoniosi. L’albero era radicato nel punto medio, aveva una lunghezza di 370 passi, un indice di coerenza (esclusi i caratteri non informativi) di 0,64 e un indice di ritenzione di 0,95. Designazione A e B si riferiscono a gruppi identificati da Werren et al. (23). † , sequenza di Wolbachia pubblicata in Werren et al. (23).
D. v. virgifera e D. V. zeae sono morfologicamente molto simili (13), con l’eccezione della maculazione elitrale nera che è distintiva in D. v. virgifera e confinata all’omero o è assente in D. V. zeae. Le sottospecie non sono isolate ecologicamente perché si trovano entrambe sul mais; né sono isolate temporalmente perché hanno lo stesso meccanismo di diapausa. Gli studi comportamentali non indicano alcuna barriera premattrice alla riproduzione perché entrambe le sottospecie rispondono allo stesso feromone sessuale e non è stata fatta alcuna discriminazione durante gli esperimenti di scelta dell’accoppiamento (13). Una volta incrociate, le due sottospecie erano fertili in una direzione, cioè i maschi di D. V. zeae del Messico centrale si accoppiavano con le femmine di D. v. virgifera del Dakota del Sud mentre l’incrocio reciproco produceva da pochissime a nessuna prole vitale (14). Per verificare se l’incompatibilità unidirezionale è causata dall’infezione Wolbachia identificata in D. V. virgifera, abbiamo fatto incroci reciproci da D. V. virgifera infetto e trattato con tetraciclina. I risultati indicano che il ceppo di Wolbachia che infetta D. v. virgifera è in grado di indurre una grave incompatibilità citoplasmatica, con solo lo 0,4% di 5627 uova che si schiudono quando i maschi infetti di D. v. virgifera sono stati incrociati con femmine non infette di D. v. virgifera trattate con tetraciclina (Tabella 1, croce d).
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Confronto della percentuale media di uova schiudono ± SE per attraversa utilizzando infetti e tetraciclina trattati di D. v. virgifera e naturalmente infetti da D. v. zeae utilizzando il Mann–Whitney U test
Abbiamo anche stabilito una colonia di laboratorio di D. v. zeae con esemplari provenienti da Stephenville, TX, e ha confermato che il D. v. zeae femmine attraversato con il D. v. virgifera maschi producono molto pochi o senza prole, mentre il reciproco croce risultati in un normale uovo di sportello (Tabella 1, croci, f e h) (14). Quando abbiamo ripetuto le croci utilizzando maschi D. v. virgifera trattati con tetraciclina, l’incompatibilità non esisteva più e sono state osservate percentuali di schiusa delle uova che non erano significativamente diverse dai controlli (Tabella 1, croce g), confermando che l’incompatibilità di accoppiamento unidirezionale tra queste due sottospecie è causata dalla presenza di Wolbachia in D. v. virgifera.
Simili incompatibilità riproduttive sono state riportate anche tra alcuni membri del genere Gryllus in Nord America. Il genere Gryllus è distribuito in gran parte del mondo ad eccezione dell’Asia orientale e del Pacifico (31). Sulla base del numero di specie, è possibile che il genere abbia avuto origine nel Nuovo Mondo o in Africa, dove sono stati registrati diversi generi simili a Gryllus (32). In Nord America, il genere Gryllus ha diverse specie strettamente correlate, alcune delle quali sono difficili da distinguere sulla base dei soli caratteri morfologici. All’inizio del secolo, questo gruppo era considerato come una singola specie con un alto grado di variabilità (33). Lavoro successivo utilizzando principalmente canzoni di chiamata discriminate tra alcune delle specie (34).
Diverse specie del genere Gryllus hanno dimostrato di essere unidirezionalmente o bidirezionalmente incompatibili. L’incompatibilità unidirezionale tra i maschi di G. pennsylvanicus e le femmine di G. firmus negli Stati Uniti orientali (19) rispecchia quella di D. V. virgifera e D. V. zeae. Abbiamo scoperto che, ad eccezione di G. firmus, gli esemplari di tutte le specie di Gryllus che abbiamo studiato sono solitamente infetti da Wolbachia, a volte con più di un ceppo (Figg. 2 e 3). Le incompatibilità segnalate tra le varie specie di questo genere possono essere spiegate dall’infezione da questo batterio. Il nostro studio ha mostrato i seguenti modelli di infezione. Popolazioni di G. integer campionati da Humboldt County, NV, e Wayne County, UT, sono infettati con lo stesso ceppo di batteri Wolbachia, che ci riferiamo a come il “tipo intero.”La popolazione campionata in Davis, CA, anche è stato infettato con il tipo intero, con l’eccezione di un individuo che ospitava lo stesso ceppo di Wolbachia come si trova in G. rubens, che ci riferiamo a come il “tipo rubens.”La popolazione campionata a Las Cruces, NM, aveva due individui che erano stati infettati con il ceppo Wolbachia di tipo rubens e tre individui che erano doppiamente infettati con i ceppi di tipo rubens e integer. Le popolazioni G. integer in Austin e Dallas, TX, anche ospitato lo stesso ceppo batterico, che, sulla base del gene 16S rRNA e il gene ftsZ, appare identico a quello trovato in G. rubens da Lake Placid e Gainesville, FL. Questo ceppo di tipo rubens si verifica anche in esemplari di G. ovisopis campionati da Gainesville. Abbiamo potuto ottenere solo esemplari di G. assimilis dalle colture di laboratorio di T. Walker e T. Zera; quest’ultima cultura è stata derivata dalla colonia di T. Walker. Gli individui di entrambe le culture sono stati infettati con lo stesso ceppo la cui sequenza per il gene ftsZ era identica al ceppo Wolbachia di tipo Rubens. La sequenza di frammenti del gene 16S rRNA indica che il ceppo in questa specie ha una transversion in posizione di E. coli 380 da una guanina a una timina, che in E. coli corrisponde alla prima posizione nel tetra loop GCAA. Nel ceppo “assimilis-type”, il loop è composto da TAAA. Questa transversion non si trova in qualsiasi altra sequenza rRNA Wolbachia 16S conosciuta fino ad oggi.
La popolazione di G. pennsylvanicus mostra un modello più complesso di infezione. Durante la maggior parte della distribuzione che abbiamo campionato, G. pennsylvanicus è polimorfico per il tipo di infezione. Una popolazione campionata a Lethbridge, Alberta, Canada, ha mostrato la presenza di un ceppo Wolbachia diverso da quelli trovati in G. rubens, G. assimilis, G. integer e G. ovisopis. Ci riferiamo a questo ceppo come il ceppo “pennsylvanicus-tipo”. Di 39 esemplari infetti provati dall’Illinois centrale, 38 ospitavano il ceppo di tipo pennsylvanicus mentre un esemplare portava il ceppo di tipo rubens. Una località 150 km a sud, Farina, IL, ha mostrato una miscela di individui che sono stati infettati sia con il pennsylvanicus-tipo o rubens-tipo ceppo o con entrambi. Di due esemplari campionati da Ann Arbor, MI, uno portava il ceppo di tipo rubens, e l ” altro è stato doppiamente infettato con il pennsylvanicus – e ceppi di tipo rubens. Per la popolazione campionata a Londra, Ontario, Canada, 215 km a nord-est di Ann Arbor, di 19 individui infetti, 10 portavano il tipo pennsylvanicus, uno portava il tipo rubens e otto erano doppiamente infettati con i ceppi di tipo pennsylvanicus e rubens (Fig. 3 bis). Questo modello polimorfico continua in esemplari di G. pennsylvanicus raccolti da Vermont e Pennsylvania. In Virginia e Carolina del Nord, abbiamo rilevato solo individui che sono stati infettati con i ceppi di tipo pennsylvanicus o rubens. La popolazione di G. pennsylvanicus in Nord America è una miscela di individui che sono infettati con il rubens-tipo o pennsylvanicus-tipo così come gli individui che sono doppiamente infettati con entrambi i ceppi e gli individui che non sono infetti (Fig. 3). I nostri risultati finora indicano che, nelle popolazioni di G. pennsylvanicus del Nord America orientale, l’infezione di tipo rubens è ad una frequenza più elevata nel nord che nel sud (Fig. 3 bis). Inoltre, abbiamo scoperto che, nella maggior parte delle località in cui si verificano entrambi i ceppi, sono presenti anche individui doppiamente infetti (Fig. 2 e 3 bis).
Come risultato del “drive” associato alla diffusione di un’infezione da Wolbachia (35), proponiamo che la struttura genetica delle popolazioni di G. pennsylvanicus che abbiamo campionato, escluso Lethbridge, Canada, sia stata influenzata dalla presenza dei ceppi Wolbachia di tipo rubens e pennsylvanicus. Pertanto, ci riferiremo ai campioni di G. pennsylvanicus raccolti in queste regioni come Gryllus near (nr.) pennsylvanicus per riflettere l’ambiguità del loro stato tassonomico imposto dai tipi di infezione trovati in queste popolazioni.
Abbiamo campionato G. firmus da Gainesville e la stazione biologica Archbold a Lake Placid, FL, e da Fort Fischer, NC. Trentadue dei 35 esemplari prelevati da queste località non erano infetti. I tre individui infetti provenivano da Gainesville, FL. Due sono stati trovati per trasportare il tipo rubens, e il terzo portava il ceppo Wolbachia di tipo pennsylvanicus (Figs. 2 e 3 bis). Questa scoperta suggerisce che l’infezione di questi due ceppi di batteri si sta muovendo nelle popolazioni di G. firmus, soprattutto alla luce del fatto che G. pennsylvanicus non è noto da Gainesville, FL.
L’analisi delle relazioni tra i diversi ceppi che abbiamo esaminato di Wolbachia nella specie Gryllus utilizzando il gene ftsZ indica che i ceppi di tipo integer e rubens formano un gruppo monofiletico e non sono strettamente correlati al ceppo di tipo pennsylvanicus, che è basale a tutti gli altri ceppi di Wolbachia del gruppo B conosciuti finora. Il ceppo di Wolbachia riportato da Werren et al. (23) in G. pennsylvanicus è del tipo rubens (Fig. 2).
Proponiamo che le infezioni nei suddetti membri del genere Gryllus offrano una spiegazione per le incompatibilità di accoppiamento osservate ottenute da Smith e Cade (17), Cade e Tyshenko (18) e Harrison (19) e indicano un possibile ruolo di Wolbachia nella speciazione di alcuni membri di questo genere. L’incompatibilità bidirezionale osservata tra G. rubens e G. integer è probabilmente il risultato dell’infezione con i due diversi ceppi di Wolbachia trovati in queste due specie. La compatibilità di G. rubens dalla Florida con G. integer dal Texas (17, 18) può essere spiegato perché queste popolazioni portano i batteri di tipo rubens. I nostri dati supportano la conclusione di Smith e Cade (17) che G. rubens e G. integer del Texas potrebbero essere la stessa specie, nonostante le differenze nelle loro canzoni di un grado solitamente usato per differenziare le specie.
Dato che G. pennsylvanicus è infetto da Wolbachia e G. firmus di solito non lo è, le incroci che mostrano che i maschi di G. pennsylvanicus sono incompatibili con le femmine di G. firmus (19) possono essere interpretate come risultanti dall’incompatibilità citoplasmatica causata da Wolbachia. La nostra interpretazione è ulteriormente confermata dal mitocondriale osservato in queste due popolazioni, vale a dire che, G. firmus e G. pennsylvanicus sono distinti mitocondriale tipi di queste due popolazioni sono stati identificati; tuttavia, sebbene G. pennsylvanicus mtDNA prontamente introgresses nella popolazione di G. fermo, non si verifica il contrario (36). Questo modello sarebbe osservato se G. pennsylvanicus è infettato da Wolbachia perché la maggior parte degli individui nella zona ibrida sarebbe il risultato di progenie di femmine infette, che in questo caso avrebbe portato il G. pennsylvanicus tipo mitocondriale insieme con l’infezione Wolbachia ereditata dalla madre.
L’incompatibilità unidirezionale tra i maschi di G. ovisopis, che trasportano i batteri di tipo rubens, e le femmine di G. firmus (T. Walker, comunicazione personale) può anche essere interpretata alla luce di questa infezione. La mancanza di progenie da incroci tra maschi di G. pennsylvanicus e G. ovisopis con femmine di G. firmus indicano che questi due ceppi potrebbero causare incompatibilità. Sappiamo che G. ovisopis e G. rubens portano lo stesso ceppo Wolbachia, quindi la probabile causa dell’incompatibilità bidirezionale osservata tra G. rubens e G. pennsylvanicus è i diversi ceppi Wolbachia che possono ospitare.
Utilizzando il gene ftsZ, abbiamo osservato 39 differenze bp tra i ceppi di tipo pennsylvanicus e rubens, 41 differenze tra i ceppi di tipo pennsylvanicus e integer e 22 differenze tra i ceppi di tipo rubens e integer. Per un confronto, nello stesso segmento genico, c’è solo un cambiamento di base tra i ceppi Wolbachia bidirezionalmente incompatibili trovati in Drosophila simulans Hawaii e D. simulans Riverside (23). Sulla base di questa evidenza e delle incompatibilità osservate negli accoppiamenti tra le rispettive specie di Gryllus, prevediamo che i ceppi di tipo rubens, integer e pennsylvanicus siano incompatibili bidirezionalmente.
La zona ibrida tra G. pennsylvanicus e G. firmus designata da Harrison e Arnold (20) è più complessa di un’interazione specie–specie. Alcuni dei siti che abbiamo campionati lungo la Blue Ridge e Appalachian mountains mostrano una distribuzione irregolare di tipi di infezione all’interno delle popolazioni di G. pennsylvanicus (Fig. 3 bis). Pertanto, in questa regione, possono verificarsi possibili interazioni tra popolazioni di G. firmus non infetto, G. nr. pennsylvanicus infettato da Wolbachia di tipo rubens o pennsylvanicus e G. nr pennsylvanicus infettato da ceppi di Wolbachia di tipo rubens e pennsylvanicus. L’infezione da Wolbachia nelle specie Gryllus menzionate e in particolare i tipi di infezione multipla trovati nel G. nr. la popolazione di pennsylvanicus indica che la restrizione al flusso genico può verificarsi all’interno di una popolazione a causa delle differenze nel tipo di infezione. Il successo riproduttivo degli individui in queste popolazioni dipenderà dal loro profilo di infezione e da quello degli individui con cui si accoppiano. Il nostro concetto di ciò che costituisce una specie nel genere Gryllus deve essere rivalutato alla luce delle infezioni Wolbachia che ospitano.
Le infezioni da Wolbachia possono attraversare una popolazione a causa del vantaggio che le femmine infette hanno sulle femmine non infette (35). Dato che G. pennsylvanicus e G. firmus hanno dimostrato di ibridare in laboratorio (19) e che ci sono prove di ibridazione nel campo (21), l’attuale distribuzione di G. firmus può essere interpretata come una relitta, da un’area più ampia attraverso la quale si è spostata una spazzata di una popolazione infetta. Una spiegazione alternativa potrebbe essere siti di infezione multipli con lo stesso ceppo Wolbachia, ma non abbiamo informazioni su come i batteri Wolbachia vengono trasmessi orizzontalmente tra le specie o sulla frequenza con cui vengono acquisiti. Pertanto, scegliamo la spiegazione più parsimoniosa, che l’infezione ha avuto origine in una posizione e successivamente si è diffusa. In effetti, i nostri dati suggeriscono che le infezioni da Wolbachia hanno una componente geografica e che il tipo rubens ha avuto origine nel sud dove predomina (Fig. 3 bis). Tuttavia, nella popolazione G. nr. pennsylvanicus del Nord America orientale, l’infezione di tipo rubens è prevalente nelle popolazioni campionate nel nord. Queste località sono i punti più lontani dalle popolazioni di Gryllus uniformemente infettati con il ceppo di tipo rubens e lontano da qualsiasi G riportato. popolazioni di rubens (Fig. 3 lettere a e b). Proponiamo che l’infezione di tipo rubens si muovesse attraverso la popolazione di Gryllus che esisteva nel Nord America orientale prima del movimento verso est del ceppo di tipo pennsylvanicus.
Nelle popolazioni di Gryllus, individui doppiamente infetti possono essere il risultato della pressione di selezione in una popolazione in cui esistono due ceppi batterici che sono bidirezionalmente incompatibili (Figs. 2 e 3 bis). In tale circostanza, gli individui che sono doppiamente infettati sarebbero selezionati per perché, se entrambe le infezioni possono sopravvivere in un grillo, le femmine sarebbero compatibili con i maschi che trasportano sia ceppo batterico. Una terza scansione infettiva di individui doppiamente infetti potrebbe quindi derivare attraverso la popolazione perché le femmine doppiamente infette hanno un vantaggio rispetto alle femmine singolarmente infette, che potrebbero riprodursi con successo solo con i maschi infettati con lo stesso ceppo Wolbachia. Sono state riportate infezioni multiple da una varietà di taxa di insetti (37-39) e i maschi doppiamente infetti hanno dimostrato di essere parzialmente o completamente incompatibili con le femmine singolarmente infette in altri insetti (37-41). Prevediamo che le infezioni doppie potrebbero verificarsi in località in cui singole infezioni con due ceppi bidirezionalmente incompatibili di Wolbachia si verificano nello stesso taxa o molto strettamente correlati.
In uno schermo di taxa di insetti temperati utilizzando PCR con primer specifici 16S rRNA, abbiamo scoperto che il 16% di 615 taxa di insetti, provenienti da un’ampia varietà di famiglie e ordini, sono stati infettati da Wolbachia (R. G. e H. M. R., dati non pubblicati) e tassi di infezione simili sono stati ottenuti per insetti tropicali (42). Data questa frequenza di infezione, prevediamo che altre zone ibride di insetti saranno definite almeno in parte dall’infezione da Wolbachia e dall’incompatibilità citoplasmatica. Alcuni generi di insetti possono essere più inclini all’infezione da Wolbachia come conseguenza della loro storia naturale. La speciazione all’interno di questi gruppi deve essere esaminata rispetto al ruolo svolto dalla Wolbachia.