Discussione
Il metodo image cytometry proposto in questo lavoro dimostra la capacità di analizzare rapidamente ed efficientemente l’autofagia nelle cellule viventi per lo screening di potenziali farmaci che possono indurre o inibire attività autofagiche, come la promozione della clearance di proteine misfolded associate alla neurodegenerazione o l’inibizione della resistenza ai La limitazione nei metodi attuali può essere superata mediante citometria a immagine e reagenti unici per sviluppare un nuovo metodo per il rilevamento dell’autofagia. Il Cellometer Vision è stato precedentemente utilizzato per saggi basati su cellule fluorescenti (Chan et al., 2011, 2012b; Robey et al., 2011), e il colorante CITOID autofagia ha dimostrato di macchiare in modo specifico gli autofagosomi nelle cellule vive. In questo lavoro, il colorante Cito-ID è dimostrato di colocalizzare con RFP-LC3 in cellule HELA affamate, che convalidano ulteriormente la specificità del colorante. Il metodo di rilevamento autofagia sviluppato basato su immagini è confrontato con la citometria a flusso standard confrontando i risultati dell’attività autofagia nelle cellule di Jurkat affamate di nutrienti. I risultati hanno mostrato un aumento dell’intensità fluorescente nelle cellule affamate di nutrienti e una diminuzione per le cellule di Jurkat recuperate. Tuttavia, i valori AAF misurati della citometria a immagine sono considerevolmente più alti della citometria a flusso, il che potrebbe essere dovuto a differenze tra strumentazione e metodi. Il Cellometer Vision Image Cytometer utilizza un dispositivo accoppiato a carica per la misurazione della fluorescenza, mentre il FACS Calibur flow citometer utilizza un tubo foto-moltiplicatore (PMT). Inoltre, anche il metodo per analizzare le intensità fluorescenti differiva tra i due sistemi. Il citometro a flusso misura i segnali totali di fluorescenza da ogni cellula, mentre il sistema basato su immagini acquisisce immagini e analizza gli autofagosomi colorati fluorescenti all’interno delle cellule, che possono fornire misurazioni più accurate dell’attività autofagia. Il software Cellometer può analizzare la fluorescenza delle cellule sommando i pixel fluorescenti totali in ogni cella, o misurando solo i pixel ad alta intensità fluorescente da autofagosomi all’interno di ogni cella. Un’altra differenza potrebbe essere causata dallo stress di taglio della citometria a flusso che influisce sulla vitalità delle cellule bersaglio (Robey et al., 2011).
Il flusso autofagico è anche un saggio importante per lo sviluppo di un nuovo metodo di rilevamento. CQ è impiegato per inibire la degradazione lisosomiale degli autofagosomi, dove l’attività autofagica sarebbe la più alta per le cellule di Jurkat affamate di nutrienti in presenza di CQ a causa dell’interazione sinergica tra i trattamenti. Il prossimo più alto sarebbe le cellule Jurkat in fame senza CQ. Solo un leggero aumento dell’attività autofagica sarebbe mostrato dalle cellule di Jurkat con CQ solo rispetto al controllo dovuto all’accumulo di autofagolisosomi basali. I risultati del flusso autofagico ottenuti da entrambi gli strumenti hanno mostrato tendenze simili, ma i valori AAF misurati nella citometria a immagine sono significativamente più alti. Questi risultati hanno dimostrato che il metodo di rilevamento citometrico dell’immagine potrebbe essere facilmente implementato per esaminare l’attività autofagia, nonostante le differenze quantitative potenzialmente specifiche dello strumento nei valori AAF.
Per dimostrare che la citometria a immagine può essere una potenziale tecnologia di screening per la scoperta di farmaci, è necessario testare la capacità di analizzare campioni in più condizioni. La citometria a immagine viene utilizzata per misurare l’attività autofagica delle cellule di Jurkat trattate con rapamicina a varie concentrazioni, per dimostrare la capacità della citometria a immagine di misurare gli effetti dose-risposta in uno studio a tempo. Di conseguenza, la citometria basata su immagini è in grado di rilevare le differenze nell’attività autofagica in varie condizioni sperimentali. In Fig. 8.6, l’attività autofagica (misurata dai valori AAF) è la più alta dopo 18 ore di incubazione. Una leggera diminuzione dei valori di AAF è mostrata tra 8 e 4 h di incubazione, che può essere dovuta al fatto che non consente alle cellule di riprendersi completamente dopo il trattamento farmacologico iniziale. Inoltre, le cellule aderenti come la linea cellulare del cancro della prostata umana (PC-3) possono anche essere misurate utilizzando il metodo della citometria a immagine. La risoluzione di imaging della visione cellometrica può analizzare gli autofagosomi fluorescenti (puncta), osservati sia nelle immagini fluorescenti che negli istogrammi di intensità della fluorescenza.
È anche importante dimostrare la capacità di caratterizzare diversi composti farmacologici confrontando il loro effetto autofagico dose–risposta per le campagne di scoperta di farmaci. Gli effetti dose–risposta di tamoxifene e rapamicina vengono confrontati direttamente utilizzando la citometria a immagine. I risultati all’incubazione di 18 ore hanno mostrato che la rapamicina ha indotto un livello più elevato di attività autofagia rispetto al tamoxifene. È importante notare che il tamoxifene a 100 µM è altamente citotossico, portando alla morte e alla disintegrazione delle cellule di Jurkat dopo 18 h di incubazione. La verifica basata sull’immagine dell’effetto citotossico nel tamoxifene ad alta concentrazione può essere molto utile per eliminare le incertezze dai soli risultati del grafico a dispersione e dell’istogramma.
La citometria a immagine ha dimostrato risultati comparabili alla citometria a flusso standard per l’analisi basata su cellule fluorescenti (Chan et al., 2011; Robey et al., 2011). Il metodo di citometria basato su immagini può offrire diversi vantaggi rispetto alla citometria a flusso. Ad esempio, il numero di cellule richieste per ciascun campione (10-20 µL) è significativamente inferiore a un citometro a flusso convenzionale (300-500 µL). La configurazione iniziale sul citometro a flusso richiede che alcuni dei campioni di cellule bersaglio siano utilizzati per le tensioni PMT e la regolazione della compensazione. D’altra parte, molti citometri di immagine pipettano le cellule in una camera di conteggio che può essere riesaminata più volte. Pertanto, i campioni di cellule bersaglio non vengono sprecati durante l’ottimizzazione iniziale della regolazione del tempo di esposizione e della messa a fuoco. Ancora più importante, il vantaggio di catturare immagini BR e fluorescenti consente ai ricercatori di verificare visivamente i dati di fluorescenza acquisiti. Ciò può aiutare nell’identificazione della citotossicità come effetto collaterale complicante di un’analisi del trattamento della droga che induce l’autofagia.
L’autofluorescenza può avvenire utilizzando il colorante verde autofagia Cito-ID a causa della camera di conteggio in plastica, ma il software può rimuovere automaticamente il segnale di fondo per ottenere la fluorescenza effettiva del bersaglio senza alterare il calcolo AAF. Inoltre, il photobleaching delle sonde fluorescenti nei test basati su cellule è ridotto al minimo poiché Cellometer Vision utilizza LED di potenza inferiore rispetto ai laser ad alta potenza utilizzati in altri strumenti. Un futuro miglioramento per la Cellometer immagine citometro sarebbe quello di sviluppare una maggiore produttività del sistema automatizzato, in grado di analizzare più celle per una migliore analisi statistica, nonché la capacità di analizzare più campioni contemporaneamente, facilitando una velocità superiore cell-based drug screening di inibitori e attivatori di autophagy, apoptosi, necrosi, e altri fenomeni fisiologici di interesse.