- Abstract
- 1. Introduzione
- 2. Metodi
- 2.1. Materiali
- 2.2. Conigli e preparazione dei tessuti
- 2.3. Valutazione istologica della cartilagine
- 2.4. Il test TUNEL
- 2.5. PCR quantitativa fluorescente
- 2.6. Analisi statistica
- 3. Risultati
- 3.1. La degenerazione istologica indotta da ACLT nei conigli è stata ridotta da DHJST
- 3.2. DHJST inibito cellule cartilaginee Apoptosi
- 3.3. Inibizione di VEGF e HIF-1α Espressione nelle cellule cartilaginee Sono associati con DHJST Esercita effetto terapeutico
- 4. Discussione
- 5. Conclusioni
- Finanziamento
Abstract
Du-Huo-Ji-Sheng-Tang (DHJST) è una medicina tradizionale cinese a base di erbe usata per trattare l’osteoartrite. Nel presente studio, è stato studiato l’effetto terapeutico del DHJST sulla degradazione della cartilagine in un modello di coniglio di osteoartrite. Nelle articolazioni del ginocchio dei conigli, è stata eseguita la transezione del legamento crociato anteriore (ACLT) per indurre l’osteoartrite sperimentale. Alla fine della sesta settimana, 30 conigli con ACLT sono stati divisi in sei gruppi, gruppo di controllo, gruppo DHJST e gruppo osaminetacina (group), che sono stati seguiti per altre 4 settimane. Gli altri tre gruppi di conigli con ACLT non sono stati trattati con DHJST o O, che sono stati sacrificati dopo 6 settimane e sono serviti come controlli del punto temporale di 6 settimane. I risultati hanno indicato che alla fine della sesta settimana dopo l’intervento chirurgico, c’era una degenerazione istologica significativa nel gruppo di controllo rispetto al gruppo normale. Nel gruppo di controllo, il punteggio medio per la degenerazione istologica era ulteriormente aumentato alla 10a settimana e c’era un punteggio medio significativamente più basso per la degenerazione istologica nel gruppo DHJST rispetto al gruppo di controllo. Per ricercare il potenziale meccanismo, sono stati rilevati il livello di espressione di VEGF e HIF-1α. L’espressione di VEGF mRNA e HIF-1α mRNA sono bassi nel gruppo normale, mentre le attività aumentano gradualmente nel gruppo di controllo. Tuttavia, rispetto a quello dello stesso gruppo modello di punto temporale, l’attività di VEGF e HIF-1α è diminuita significativamente nel gruppo DHJST. In conclusione, DHJST esercita un significativo effetto terapeutico sui conigli osteoartriti e i meccanismi sono associati all’inibizione dell’espressione di VEGF e HIF-1α.
1. Introduzione
L’osteoartrite (OA) è una malattia progressiva e debilitante che può richiedere anni per manifestarsi clinicamente in individui affetti. L’invecchiamento della cartilagine e la senescenza dei condrociti svolgono un ruolo importante nella patogenesi e nello sviluppo dell’OA. Durante lo sviluppo di OA, c’è spesso un aumento focale della morte cellulare. Molti rapporti hanno rivelato che la senescenza dei condrociti contribuisce al rischio di degenerazione della cartilagine diminuendo la capacità dei condrociti di mantenere e riparare il tessuto cartilagineo articolare . Poiché è teorizzato che ogni condrocita è responsabile del mantenimento della matrice extracellulare che lo circonda e che le molecole di matrice prodotte in una regione del tessuto hanno una capacità molto limitata di attraversare il tessuto, la perdita focale di cellule vitali potrebbe essere parzialmente responsabile dell’incapacità dei tessuti di riparare danni minori .
Attualmente non esiste una cura per l’OA e i trattamenti disponibili rallentano solo la progressione della malattia . Negli ultimi 20 anni, la medicina tradizionale cinese (TCM) ha visto progressi significativi contro l’OA, come nel migliorare i risultati clinici dei pazienti, inibendo la reazione infiammatoria e la degenerazione della cartilagine . Lo studio in vivo e in vitro ha anche dimostrato che la formula delle erbe cinesi è di molteplici azioni complete contro OA . Du-Huo-Ji-Sheng-Tang, che è composto da Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi e Poria, è stato ampiamente utilizzato per il trattamento di OA. Può migliorare i sintomi clinici, la funzione del ginocchio e la qualità della vita per i pazienti . Sulla base delle nostre conoscenze sulla patogenesi dell’OA nella TCM, abbiamo studiato l’effetto del DHJST sulla prevenzione della degenerazione cartilaginea dell’OA nei conigli e ne abbiamo osservato i meccanismi.
2. Metodi
2.1. Materiali
Il sistema di rilevamento dell’apoptosi colorimetrica senza uscita (analisi TUNEL) è stato ottenuto da Nanjing Jiancheng Biotech Company (Cina). Trizol total RNA extraction kit, DNA molecular marker, SYBR Premix EX TaqTM e Perfect Real Time kit sono stati acquistati da Invitrogen Co. (USA). Erbe in DJST (composto da Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi e Poria, fornito da Shanghai Huayu Chinese Herbs Co. Ltd., Cina) si sono accreditati da un pharmacognosist secondo protocolli standard, preparato da Shanghai Municipal Hospital di Medicina Tradizionale Cinese, i componenti sono stati mescolati in ordine al rapporto di 2 : 1 : 1 : 1 : 0.2 : 1 : 0.3 : 1 (peso a secco), I farmaci sono stati estratti con metodi standard secondo la Farmacopea Cinese (Cina Farmacopea e Comitato, 2000). Questi farmaci grezzi sono stati immersi in acqua distillata e bolliti per 30 min due volte, e la soluzione del farmaco è stata filtrata attraverso una rete, quindi il filtrato è stato concentrato a 4 g mL−1 da una pompa a vuoto e quindi conservato a -20°C fino all’uso. Osaminethacine (O), ogni compressa contiene 25 mg di indometacina e 75 mg di aminoglucosio (fornito da Hebei Jizhong Pharmaceutical Co. Ltd., Cina), è stato usato come farmaco di controllo positivo.
2.2. Conigli e preparazione dei tessuti
I conigli bianchi neozelandesi di quarantotto mesi sono stati forniti dal Centro sperimentale per gli animali all’Accademia Cinese delle Scienze. Trenta conigli sono stati sottoposti a transezione unilaterale del legamento crociato anteriore (ACLT) in anestesia generale. I conigli normali non hanno subito una procedura.
Alla fine della sesta settimana, i 30 conigli con ACLT sono stati divisi in sei gruppi, gruppo di controllo, gruppo DHJST e gruppo O, che sono stati seguiti per altre 4 settimane. Gli altri tre gruppi di conigli con ACLT non sono stati trattati con DHJST o O, che sono stati sacrificati dopo 6 settimane e sono serviti come controlli del punto temporale di 6 settimane. I decotti sono stati somministrati per via orale al dosaggio 0.923 g (kg−1·d−1) per 4 settimane, ai conigli del gruppo O sono stati somministrati O 0,09 g (kg−1·d−1) per un periodo di 4 settimane, il gruppo di controllo modello e il gruppo normale sono stati somministrati per via orale con lo stesso volume di soluzione salina fisiologica.
I conigli sono stati sacrificati per il campionamento. Il protocollo ha ricevuto l’approvazione del comitato per gli esperimenti sugli animali del Centro medico universitario di Shanghai, in Cina. Le tibie di coniglio sono state rimosse e la cartilagine articolare della tibia è stata immediatamente conservata a -80°C. Le tibie sono state accuratamente sezionate e eliminate dal muscolo adiacente e immediatamente fissate in formalina al 10% per 24 ore. Le tibie sono state successivamente decalcificate per 4 settimane in 100 g / L di acido tetraacetico di etilendiammina, lavate in PBS, disidratate attraverso una serie di etanolo e incorporate in paraffina in modo standardizzato per garantire il corretto orientamento. Le sezioni di tessuto di paraffina (7 µm) sono state tagliate in modo standardizzato. Le sezioni sono state deparaffinizzate per le analisi istochimiche.
2.3. Valutazione istologica della cartilagine
La valutazione istologica è stata eseguita sulle articolazioni femorotibiali dei conigli nel gruppo DHJST, nel gruppo O e nei gruppi di controllo. Le sezioni sono state colorate con Safranin O-fast green. Queste sezioni istologiche di ciascun sito sono state valutate utilizzando un sistema di classificazione Mankin modificato (Tabella 1) da due patologi veterinari indipendenti certificati dal consiglio.
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2.4. Il test TUNEL
L’apoptosi indotta da H2O2 è stata rilevata eseguendo il test dUTP nick end-labelling (TUNEL) mediato da deossinucleotidedil transferasi terminale utilizzando un kit Apo-DirectTM (CalBiochem, San Diego, CA). TUNEL è stato eseguito secondo le istruzioni del produttore. In breve, dopo i pretrattamenti e l’esposizione a H2O2, le cellule sono state raccolte, lavate, fissate, permeabilizzate ed etichettate per le rotture del filamento di DNA, quindi analizzate su un citometro a flusso Epics Elite coltro (Beckman-Coulter, Miami, USA). Tutti i test sono stati effettuati in triplice copia.
2.5. PCR quantitativa fluorescente
L’RNA totale è stato estratto da 50 mg di cartilagine nelle tibie articolari utilizzando il reagente Trizol. La sintesi del cDNA è stata eseguita utilizzando 4 µg di RNA totale per campione con primer e reagenti casuali contenuti nel kit di sintesi del cDNA di Revert Aid First Strand. Due micro litri (2 µL) di ciascun campione sono stati utilizzati per la PCR in tempo reale in un sistema Rotor-Gene 2000 (Australia). La quantificazione relativa è stata calcolata utilizzando la soglia del ciclo delta () quantificazione relativa. Sono stati determinati il ciclo di soglia () per il controllo endogeno CAPDH mRNA e i segnali target e la quantificazione relativa dell’RNA è stata calcolata utilizzando il metodo comparativo in cui le sequenze
di primer utilizzati per il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) sono: 5′-TGCCCACCGAGGAGTTCA-3(forward) e 5′-GGCCCTGGTGAGGTTTGAT-3(reverse) (lunghezza del prodotto: 75 bp).Le sequenze di primer utilizzate per il fattore inducibile all’ipossia-1α(HIF-1α) sono: 5′-CAGTGCAAAAGACAGGTGGAAG-3(avanti) e 5′-CCCTGTATGGTGGTGTGTGT-3 (indietro) (lunghezza del prodotto: 107 bp).Le sequenze di primer utilizzate per GAPDH sono: 5 ‘- CCGAGGGCCCACTAAAGG-3(avanti) e 5’-GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAA-3 (indietro) (lunghezza del prodotto: 88 bp).
2.6. Analisi statistica
Tutti i risultati sono stati espressi come media e deviazione standard (SD). I dati di misurazione sono stati analizzati utilizzando un’analisi unidirezionale delle varianze (ANOVA, SPSS 11.0). I dati di rango sono stati analizzati con ridit. Il risultato di P <.05 è stato considerato statisticamente significativo.
3. Risultati
3.1. La degenerazione istologica indotta da ACLT nei conigli è stata ridotta da DHJST
Sezioni istologiche rappresentative sono mostrate nella Figura 1. Alla fine della 10a settimana, abbiamo osservato una normale integrità della superficie articolare nel gruppo normale(Figura 1 (a)). Nel gruppo di controllo, con una maggiore degenerazione, c’è stata una perdita di colorazione verde Safranina O-veloce che accompagna la formazione di fessure che si estendeva nelle zone medie e profonde (Figura 1(b)), e nel gruppo DHJST, c’è stata perdita con fibrillazione lieve precoce e una perdita di colorazione verde Safranina O-veloce è stata osservata insieme al clustering di condrociti (Figura 1(c)). gruppo O, con perdita di colorazione verde Safranin O-fast questi cambiamenti erano simili al gruppo DHJST (Figura 1 (d)). Alla fine della sesta settimana dopo l’intervento chirurgico, ci sono state differenze istologiche significative nel gruppo di controllo rispetto al gruppo normale (P < .01). Nel gruppo di controllo, il punteggio medio per la colorazione verde Safranin O-fast è stato ulteriormente aumentato alla 10a settimana rispetto a quello della 6a settimana (P < .01) (Figura 2, lettera a)). Al 10 ° fine settimana, c’erano differenze significative nel punteggio Mankin tra il gruppo di controllo e il gruppo DHJST, c’era un punteggio medio significativamente più basso per la colorazione verde Safranin O-fast nel gruppo DHJST rispetto al gruppo di controllo (P < .01) (Figura 2 (b)), e nessuna differenza statisticamente significativa nel punteggio Mankin tra il gruppo DHJST e il gruppo O (P >.05).
(a)
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Histological examination of cartilage (Safranin O-fast green staining, ×100).
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The influence of DHJST on histological parameters and apoptotic of chondrocytes. I risultati sono stati presentati come media ± DS (n = 5 per gruppo) in ogni colonna. *P <.01 rispetto al gruppo di controllo osteoartrite alla 6a settimana, * * P <.01, rispetto a quelli nel gruppo di controllo dell’osteoartrite.
3.2. DHJST inibito cellule cartilaginee Apoptosi
Alla fine della sesta settimana dopo l’intervento chirurgico, l’indice di cellule apoptosi nel gruppo di controllo rispetto a quello nel gruppo normale erano differenze significative (P <.01). Nel gruppo di controllo, l’indice della cellula di apoptosi era ancora notevolmente aumentato (da media ± SD 0,35 ± 0,13 alla sesta settimana a 0,62 ± 0,10 alla 10a settimana; P < .01) (Figura 2, lettera c)). Alla fine della 10a settimana, rispetto al gruppo DHJST, l’indice delle cellule di apoptosi aumenta notevolmente nel gruppo di controllo (P < .01) (Figura 2 (d)). Non ci sono state differenze significative nell’indice delle cellule di apoptosi tra il gruppo DH e il gruppo DHJST (P >.05).
3.3. Inibizione di VEGF e HIF-1α Espressione nelle cellule cartilaginee Sono associati con DHJST Esercita effetto terapeutico
fluorescente PCR quantitativa ha indicato che l’espressione di VEGF mRNA e HIF-1α mRNA sono bassi nel gruppo normale; mentre le attività aumentano gradualmente e significativamente nel gruppo di controllo rispetto a quello del gruppo normale (P < .01); Nel gruppo di controllo, HIF – 1α nei condrociti articolari inizia ad aumentare alla sesta settimana dopo l’intervento chirurgico, ulteriori aumenti alla 10a settimana rispetto a quella della sesta settimana(media ± SD 94,21 ± 20.12 alla sesta settimana e 160,35 ± 72,27 alla decima settimana; P <.05) (Tabella 2). Al 10 ° fine settimana, l’espressione di mRNA VEGF e mRNA HIF-1α nel gruppo DHJST era significativamente diminuita rispetto a quella nel gruppo di controllo dopo la somministrazione (P < .01). Sebbene il livello di mRNA VEGF e di mRNA HIF-1α nel gruppo O tendesse ad essere ridotto di 4 settimane di trattamento con O rispetto a quello nel gruppo di controllo, non vi è stata alcuna differenza significativa (Tabella 3).
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| I valori come media ± SD sono stati ottenuti da ciascun gruppo di 5 animali. * P <.05 rispetto agli animali del gruppo di controllo alla sesta settimana. * * P <.01 rispetto agli animali del gruppo di controllo allo stesso tempo punto gruppo di controllo. |
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| Values as means ± SD. †P > .05 compared with control group animals. ** P < .01 compared with control group animals. |
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4. Discussione
Il modello ACLT è uno dei modelli sperimentali più utilizzati di OA. L’ACLT del coniglio è sempre più usata negli studi di OA perché l’inizio della malattia è rapido. L’uso di modelli sperimentali di ACLT è di particolare rilevanza clinica, poiché la rottura dell’ACL si verifica nell’uomo e porta anche allo sviluppo di OA. Lo studio indica che la grande quantità di apoptosi dei condrociti esiste durante la fase progressiva di OA in conigli indotti da chirurgia. L’apoptosi condrocitica è uno dei cambiamenti caratteristici della cartilagine OA. L’apoptosi patologica sotto la condizione di stimolazione dannosa potrebbe provocare il rilascio di chemiotassi o fattori infiammatori, che a sua volta aggrava la lesione della cartilagine e attiva il dolore . Pertanto, l’inibizione dell’apoptosi dei condrociti potrebbe essere una strategia importante contro i cambiamenti degenerativi nelle articolazioni del ginocchio dei conigli. L’indice di apoptosi dei condrociti nel gruppo DHJST diminuisce significativamente rispetto a quello del gruppo modello, suggerendo che l’inibizione dell’apoptosi dei condrociti potrebbe essere uno dei meccanismi importanti del DHJST contro i cambiamenti degenerativi.
Studi precedenti hanno dimostrato la natura ipossica del microambiente dei condrociti articolari. È interessante notare che le articolazioni osteoartritiche hanno mostrato livelli di ossigeno ulteriormente diminuiti, ruolo dell’ipossia durante la patogenesi dell’OA . Uno studio recente ha descritto che nei condrociti articolari lo stress catabolico e ipossico sono forti induttori del fattore di trascrizione HIF-1, che è il principale regolatore dell’adattamento cellulare ai bassi livelli di ossigeno. HIF-1 è di importanza fondamentale per la sopravvivenza e l’arresto della crescita dei condrociti durante lo sviluppo della cartilagine, nonché la generazione di energia e la sintesi della matrice dei condrociti nella cartilagine sana e osteoartritica. Nella cartilagine osteoartritica, i livelli proteici di HIF-1 sono significativamente aumentati e la sua attività è correlata alla gravità dei cambiamenti degenerativi della cartilagine . Il presente lavoro documenta l’importanza del fattore di trascrizione HIF-1α per mantenere l’integrità della cartilagine articolare ipossica. I livelli in eccesso di HIF-1α coincisero con un aumento dell’apoptosi dei condrociti articolari e portarono a cambiamenti degenerativi nelle articolazioni del ginocchio dei conigli. Dopo la somministrazione di DHJST, l’espressione HIF-1α diminuisce, rispetto a quella del gruppo modello. I risultati mostrano che l’azione di DHJST sulla funzione di regolazione dei condrociti, potrebbe inibire l’attività di HIF-1α.
È interessante notare che la differenza dell’espressione di VEGF e HIF-1α tra il gruppo DHJST e il gruppo O è significativa dopo la somministrazione. Diversi studi hanno dimostrato che alcuni farmaci antinfiammatori non steroidei, come l’indometacina, causano effetti antinfiammatori indipendenti dall’attività HIF-1α, poiché l’indometacina non è riuscita a inibire la fosfatidilinositolo 3-chinasi o la chinasi extracellulare regolata dal segnale/la via della chinasi proteica attivata da mitogeno, così come l’attività Erk . Al contrario, l’indometacina è in grado di attivare il recettore-γ attivato dal proliferatore del perossisoma, che non è sensibile al salicilato di sodio o all’aspirina. L’inibizione della fosfatidilinositolo 3-chinasi o della via Erk è correlata all’inibizione di HIF-1α e dei fattori angiogenici .
L’ipossia e vari fattori di crescita / citochine migliorano l’espressione del VEGF . Il VEGF non è solo uno dei più importanti fattori di angiogenesi , ma è coinvolto anche nei processi infiammatori in OA e contribuisce a sintomi come dolore e gonfiore prendendo di mira le membrane sinoviali, le risposte infiammatorie croniche sono spesso associate alla produzione di fattori angiogenici che inducono la proliferazione vascolare e nell’artrite reumatoide il VEGF è altamente espresso nelle cellule sinoviali . Poiché il sovraccarico meccanico è uno dei fattori causali per OA, abbiamo studiato il suo effetto sull’espressione di VEGF sulla cartilagine del coniglio che l’espressione di VEGF diminuisce dopo la somministrazione di DHJST, il risultato indica che DHJST può proteggere la cartilagine articolare sopprimendo l’espressione di VEGF nei condrociti (Figura 3).
5. Conclusioni
Fino ad ora, gli ingredienti bioattivi in DHJST sono sconosciuti, ma il nostro studio indica che DHJST esercita un significativo effetto terapeutico su OA nei conigli, attraverso meccanismi di inibizione dell’apoptosi dei condrociti e regolazione dell’espressione di VEGF, HIF-1α nei condrociti. Ciò fornisce la prova scientifica affinchè la clinica applichi DHJST nel trattamento dell’OA.
Finanziamento
La Fondazione di Scienze Naturali di Shanghai (numero di sovvenzione: 08JC1418800).