Medicina sperimentale e terapeutica

Introduzione

L’asma bronchiale è una malattia infiammatoria cronica delle vie aeree che coinvolge molte cellule infiammatorie e mediatori. Cellule T, in particolare T helper (Th) 1 e Th2. hanno un ruolo cruciale nelinduzione dell’infiammazione delle vie aeree nei pazienti asmatici (1). Le risposte immunitarie complicate sono capableof che inducono la carenza di Th1 e l’iperattività di Th2, che provoca lo squilibrio di ina Th1/Th2. Questo squilibrio favorisce la secrezione di immunoglobuline (Ig) e sensibilizza i mastociti e gli eosinofili attraverso la secrezione di citochine alterate e provoca infiammazione allergica e reattività delle vie aeree (2,3).Interferone (IFN)-γ e interleuchina (IL)-4 sono citochine tipiche ofTh1 e Th2, rispettivamente.

Nei pazienti con asma, l’infiammazione persistente delle vie aeree è iniziata da cellule presentanti antigene (APC), cheintegrano vari allergeni in un segnale per le cellule T e innescano le risposte immunitarie successive (4,5).L’attivazione delle cellule T richiede segnali che vengono avviati tramite il complesso CR e il cluster di differenziazione (CD)28. Le cellule dendritiche mature (MDC) esprimono alti livelli delle molecole co-stimolatorie CD80 e CD86, che forniscono il segnale necessario per l’attivazione, l’espansione e la differenziazione delle cellule T tramite l’interazione con CD28 (6). Gli studi precedenti hanno dimostrato che i livelli di CD80 e CD86 sono elevati nei pazienti con asma (7,8).

In precedenti studi che studiavano modelli asmatici,gli MDC hanno dimostrato di indurre la polarizzazione Th2, upregulate IL-4secretion, downregulate IFN-γ production and induc eosinophilicinflammation (9,10). Tuttavia, gli studi che indagano gli effetti del knockdown di CD80 e CD86 in DCS sul thedifferentiation di e la secrezione di citochine dalle cellule di aiuto di T nei modelli di murina di asma sono carenti.

Nel presente studio, i segnali di attivazione delle cellule T co-stimolatori sono stati bloccati dalla soppressione dell’espressione delle molecole CD80 e CD86 su DCS utilizzando piccoli RNA interferenti (siRNA), e sono stati valutati gli effetti del knockdown CD80 e CD86 sui livelli di espressione delle citochine tipiche Th1/Th2 IFN-γ e IL-4. Pertanto, il potenziale di CD80 e CD86 come bersagli per l’applicazione dell’interferenza RNA (RNAi) nel targeting terapeutico dell’asma è stato esaminato.

Materiali e metodi

Animali

Un totale di 20 topi sani senza patogeni specifici gradeBALB/c (6-8 settimane; peso medio, 18±2 g) sono stati acquistati dail Centro di animali sperimentali dell’Università Sun Yat-Sen (Guangzhou, Cina). Gli esperimenti sono stati eseguiti secondoprotocoli approvati dal Comitato di studi sugli animali di Sun Yat-SenUniversity.

Modelli di asma

Un totale di 20 topi sono stati assegnati in modo casuale a duegruppi: i) il gruppo asmatico e ii) il controllo normale group.In il gruppo asmatico, ogni topo è stato sensibilizzato all’ovoalbumina( OVULI; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) per via intraperitoneale nei giorni1, 14 e 21 con 100 µg di OVULI emulsionati in 20 mg di allume (Guangzhou Chemical Reagent Co., Guangzhou, Cina). Successivamente, i topi sono stati esposti a una sfida aerosol di 5% OVULI per 30min/giorno in contenitori ermetici (con dimensioni di 50×50×50 cm) ilgiorni 28-34. Nel gruppo di controllo normale, i topi sono stati sensibilizzati e confrontati come sopra con una quantità equivalente di soluzione salina invece della soluzione di proteine OVALI. A 24 h dopo l’ultimochallenge, i topi sono stati sacrificati da una lussazione cervicale approvataprocedura condotta da personale qualificato e completamente addestrato. Thelungs sono stati rimossi e poi fissati in etanolo al 10% per 24 h.I campioni sono stati disidratati, incorporati in paraffina e colorati conematoxilina ed eosina come precedentemente descritto (11). Cambiamenti patologici nei bronchi ei tessuti del polmone sono stati valutati sotto un microscopio Nikon Eclipse Ti lightmicroscope (Nikon Corporation, Tokyo, Giappone).

Separazione di midollo osseo derivedDCs

Tutti i topi sono stati sacrificati dalla dislocazione cervicale 24h dopo la sfida finale. Il midollo osseo è stato lavato da thefemurs e tibiae con terreno di coltura RPMI – 1640 (Gibco; ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, Stati Uniti d’America). A seguito di centrifugazione a 250 × g per 5 min, le cellule sono state trattate con tampone di lisi delle cellule del sangue rosso (RBC) (CWBio Co., Ltd., Pechino, Cina), lavato con soluzione salina tampone fosfato( PBS), centrifugato a 250 × gfor 5 min e coltivato in RPMI-1640 integrato con fattore stimolante le colonie di granulociti macrofagi ricombinantmouse (rmGM-CSF;Peprotech, Inc., Rocky Hill, NJ, USA; 10 ng / ml), e rmIL-4(Peprotech; 10 ng/ml) sono stati utilizzati a sua volta. Dopo 6 giorni di coltura, è stato aggiunto 1µg / ml di lipopolisaccaride (LPS; Sigma-Aldrich) e gli MDC non aderenti sono stati raccolti il giorno 7. DCs sono stati colorati a 4°Cfor 30 min con isotiocianato di fluoresceina (FITC)-conjugatedhamster anti-CD11c (5 µg/ml; 11-0114), ficoeritrina (PE)-coniugato criceto anti-CD80 (5 µg/ml; 12-0801), FITC-conjugatedrat anti-CD86 (5 µg/ml; 11-0862) e PE-coniugato ratto anti-majorhistocompatibility complex (MHC II) (5 µg/ml; 12-5322; alleBioscience, Inc., San Diego, CA, USA) anticorpi monoclonali, e sono stati successivamente analizzati mediante citometria a flusso (BD FACSVerse; BDBiosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) al fine di determinare il tasso di espressione positiva dell’espressione dell’antigene etichettata.

siRNA e transfezione

Le sequenze siRNA specifiche (Tabella I) destinate a CD80 e CD86 sono state progettate e selezionate secondo i metodi di Gu et al(12). Tutto siRNA è stato acquistato Dashanghai GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, Cina). Il transfectionstep è stato eseguito secondo il protocollo del produttore forLipofectamine 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.).In breve, i DCS sono stati coltivati in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti ad un’intensità di 1×105 cellule / pozzetto il giorno prima della trasfezione. Topreparare i complessi lipid-siRNA, 3 µl di lipofectamina 2000 è stato somministrato in 50 µl di Opti-MEM (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) a temperatura ambiente per 5 min, e 12 µl del siRNA indicato eraattualmente combinato con 50 µl Opti-MEM. Il dilutedLipofectamine 2000 e siRNA sono stati successivamente miscelati e incubatoper un ulteriore 20 min a temperatura ambiente per la formazione complessa.Successivamente, il complesso è stato incubato con il DCs in una piastra da 24 pozzetti a 37°C in una CO2 umidificata al 5% in aria atmospherefor 6 h. Quando è stata eseguita la cotrasfezione, quantità equivalenti diCD80 siRNA: Lipofectamine 2000 e CD86 siRNA: Lipofectamine 2000complexes sono stati aggiunti a ciascun pozzetto. FAM-scrambled-siRNA è stato utilizzato come il controllo negativo al fine di determinare la transfectionefficiency. Sono stati istituiti tre gruppi di DCS transfettati: nel gruppo non siRNA, è stata aggiunta solo Lipofectamine 2000, senza aggiungere anysiRNA al DCs. Nel gruppo siRNA, gli MDC eranotrasfetti da SIRNA specifici per CD80 e CD86. Nel gruppo negativesiRNA, gli MDC sono stati trasfettati da non specifici non-targetingFAM-siRNA, che non ha omologia con gli RNA mirati.Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia per ciascun campione.L’efficienza della trasfezione è stata determinata utilizzando la fluorescenzamicroscopia (Nikon Eclipse Ti, Nikon Corporation) e rilevata dalla citometria a flusso.

Reverse transcription-quantitativepolymerase chain reaction (RT-qPCR)

Per valutare CD80 e CD86 mRNA espressione levelsfollowing transfection, RT-qPCR è stato eseguito. Le sequenze di primer (Tabella II) sono state progettate secondo GenBank e sintetizzate da Daan Gene Co., Ltd. di Sun Yat-SenUniversity (Guangzhou, Cina). A 24 ore di post-trasfezione, il totalRNA di 1×106 DCs è stato estratto utilizzando il reagente TRIzol (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) e trascritto e amplificato con QuantiTect SYBR Green RT-PCR kit (Qiagen GmbH,Hilden, Germania) in un Roche LightCycler 480 (Roche Diagnostics,Basilea, Svizzera). Le amplificazioni sono state effettuate secondo il protocollo del produttore per il QuantiTect SYBR Green RT-PCRkit (Takala, Giappone). Le condizioni di amplificazione erano 40 cicli di 93 ° C per 3 min, 93 ° C per 30 sec, 55°C per 45 sec e 72 ° C per 45sec. Ogni campione è stato somministrato a ciascuno dei tre pozzetti. Relativegene expression levels were calculated using the quantificationcycle (Cq) method with normalization to glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) as the reference gene using 2−∆∆Cq(13).

Citometria a flusso

Per rilevare i tassi di espressione positiva di CD80 e CD86 sul DCs in seguito alla trasfezione, la citometria a flusso è stata eseguita sul gate MHC II / CD11c per CD80 e CD86. Sei ore dopo la trasfezione, i DCS sono stati lavati due volte con PBS e incubati con anticorpi marcati con fluorescenza a 4°C per 30 min.Successivamente, le cellule sono state lavate di nuovo con PBS e fissate con10 g/l paraformaldeide. Sono stati utilizzati i seguenti anticorpi monoclonali anti-topo: PE-anti-MHC II, FITC-anti-CD11c, PE-anti-CD80 e FITC-anti-CD86, come menzionato sopra. Tutte le analisi flowcytometric sono state eseguite utilizzando controlli isotipici IgG.

Separazione delle cellule T

Gli Spleens sono stati rimossi dopo che i topi erano stati eutanizzati dalla dislocazione cervicale. Le cellule T sono state separate utilizzando il mezzo di separazione linfocitaria in base al protocollo del produttore (Dakewe Biotech Co., Ltd., Cina). La densità della cella è stata regolata a 1×109 / l prima di ulteriori elaborazioni.

Reazione linfocitaria mista (MLR)

I DCS asmatici derivati dal midollo osseo murino(1×104/pozzetto) e le cellule T sane (1×105 / pozzetto) sono stati co-coltivati in piastre da 96 pozzetti con un rapporto 1:10. I sistemi di co-coltura sono stati suddivisi in tre gruppi: i) Il gruppo non siRNA, ii) il gruppo siRNA, e ii) il gruppo siRNA negativo, con DCS dei gruppi corrispondenti come descritto sopra. Successivamente, gli OVULI sono stati aggiunti a ciascun pozzetto a una concentrazione finale di 10 mg / l in un volume totale di 200 µl. Le celle sono state incubate a 37°C in un’atmosfera di CO2 umidificata al 5% per 72 ore.

Saggi immunoassorbenti legati all’enzima(ELISAs)

Dopo 3 giorni di co-coltura, il supernatante è statoraccolto. I livelli di IFN-γ e IL-4 sono stati analizzati utilizzando kit ELISA specifici per IFN-γ e IL-4 (Dakewe Biotech Co., Ltd.) secondo le istruzioni del produttore. I valori di assorbanza sono stati letti a 450 nm utilizzando un Multiskan MK3 (Thermo Fisher Scientific, Inc.).

Analisi statistica

Le analisi statistiche sono state eseguite con SPSSsoftware, versione 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, Stati Uniti d’America). I dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD). Gli esami sono stati effettuati in triplice copia per ciascun topo. Comparisonsbetween statistici gruppi sono stati eseguiti utilizzando analisi unidirezionale della varianza, e confronti all’interno di un gruppo sono stati eseguiti utilizzando Student’st-test. Le differenze tra i gruppi sono state considerate statisticamentesignificativo quando P< 0.05.

Risultati

Modello asmatico

I 20 topi BALB / c sani di grado SPF sono stati assegnati a gruppi di controllo asmatici e normali, con 10 topi in ciascuno. Allmice sono stati valutati in ultima analisi senza sperimentaliperdita animale. Secondo la patologia del tessuto polmonare, sezioni polmonari dai topi immunizzati agli ovuli hanno mostrato una chiara infiammazione delle vie aeree con infiltrati peribronchiolari e perivascolari. Questi infiltratesconsistevano prevalentemente di eosinofili e linfociti, e le sezioni mostravano mucosa bronchiale e ispessimento della muscolatura liscia,aumento della secrezione di muco, spargimento delle cellule epiteliali delle vie aeree, stenosi delle vie aeree e cellule infiammatorie sparse nel lungointerstizio. Non sono stati osservati cambiamenti patologici significativi inlunghe sezioni del gruppo di controllo normale. Rappresentantei dati istopatologici sono mostrati in Fig.1.

Espressione della molecola della superficie cellulare bymDCs

I livelli di espressione di CD11c, CD80 e CD86 sulle superfici di themDC sono stati rilevati mediante ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza(FACS). Gli MDC del gruppo asmatico hanno espresso CD11c a un livello paragonabile a quello del gruppo di controllo normale; non è stata trovata alcuna differenza significativa tra i due gruppi (P>0.05). Tuttavia, rispetto al normale gruppo di controllo, il gruppo asmaticoha mostrato livelli di espressione CD80 e CD86 significativamente più alti(P<0,05; Fig. 2).

Trasfezione di MDC

I costrutti siRNA specifici per CD80 e CD86 sono stati trasferiti con successo negli MDC. Gli MDC trasfettati sono stati osservati al microscopio a fluorescenza 6 ore dopo la trasfezione.L’efficienza di trasfezione di siRNA rilevata da FACS era ~75% (Fig. 3).

mRNA ed espressione proteica di CD80 e CD86 mediante MDC dopo trasfezione

I livelli di mRNA ed espressione proteica di CD80 e CD86 negli MDC trasfettati sono stati rilevati mediante RT-qPCR e facsanalisi a 24 e 72 h, rispettivamente, dopo la trasfezione. I livelli di espressione dell’mRNA cd80 e CD86 rilevati da RT-qPCR hanno indicato che i livelli di espressione dell’mRNA CD80 nei gruppi non siRNA, siRNA e negativesiRNA erano rispettivamente di 2,09±0,46, 0,60±0,17 e 2,04±0,93 e i livelli di espressione dell’mRNA CD86 erano rispettivamente di 3,58±0,20, 0,91±0,48 e 2,83±0,83. I dati forniti da facsindicavano che i tassi di espressione positiva della proteina CD80 nei gruppi non-siRNA, siRNA e siRNA negativi erano 82,45±15,80,30,79±7,07 e 81,83±10,07%, rispettivamente, e i tassi di espressione positiva della proteina CD86 erano 89,45±10,22, 27,29±6,99 e 87,66±11.74%, rispettivamente. Il livello di espressione dell’mRNA e i tassi di espressione proteinpositive hanno mostrato risultati comparabili. Non c’era alcun significato significativo tra il gruppo non siRNA e il gruppo siRNA negativo (P>0.05). L’espressione di CD80 e CD86 ai livelli di proteina e di themRNA nel gruppo di siRNA è diminuita significantlycompared con quello nei gruppi di siRNA non-siRNA e negativi (P < 0.05; Figs. 4 e 5). Ciò dimostra che l’interferenza mirata a siRNA può sopprimere significativamente i livelli di espressione dell’mRNA e della proteina CD80 e CD86.

Secrezione di IFN-γ e IL-4 da cellule T co-coltivate con MDC

Dopo 72 ore di co-coltura, i livelli di IFN-γ e IL-4 nel surnatante del sistema di co-coltura mDC e T-cell sono stati rilevati da ELISA. Espressione di IFN-γ era significativamente aumentato nel siRNA gruppo (132.73±25.04 pg/ml) rispetto a thenon-siRNA e negativi siRNA gruppi (72.56±26.30 e 80.21±24.42 pg/ml, rispettivamente; P<0.05), mentre non significativo differenceswere rilevato tra il non-siRNA e negativi siRNA gruppi(P>0.05). IL-4 livelli di espressione sono stati significativamente diminuito nel siRNA gruppo (93.04±23.13 pg/ml), rispetto ai non-siRNAand negativo siRNA gruppi (150.69±29.50 e 163.19±25.36 pg/ml,rispettivamente; P<0.05), mentre non vi sono differenze significative weredetected tra il non-siRNA e negativi siRNA gruppi(P>0.05) (Fig. 6).

Discussione

L’asma bronchiale è una malattia infiammatoria cronica delle vie aeree che coinvolge una varietà di cellule infiammatorie, tra cui mastcellule, eosinofili, linfociti e altri componenti cellulari (14-17).Lo squilibrio Th1 / Th2 è un fattore chiave che contribuisce alla gravità dell’asma(18). Gli APC, inclusi DCS, macrofagi e cellule B (19), svolgono un ruolo cruciale nella stimolazione delle cellule T (3). Tra questi, la DC è la più POTENTEAPC, contribuendo alle risposte immunitarie primarie e secondarie,compresa l’immunità allergica. Le DCS mature (MDC) con alti livelli di espressione delle molecole co-stimolatorie CD80 e CD86 possono attivare le cellule T, mentre le cellule dendritiche immature (IDC) con un basso livello di espressione di CD80 e CD86 sopprimono la risposta delle cellule T e inducono tolleranza immunitaria (20,21). I pazienti asmatici affetti da DCsin hanno dimostrato di essere iperattivi(22).

CD80 e CD86 sono due tipi di proteina che areexpressed sulla superficie di APC e che lavorano in tandem ai segnali provideco-stimulatory necessari per andsurvival di attivazione delle cellule T. Studi precedenti hanno dimostrato che i livelli di espressione delle molecole co-stimolatrici CD80 e CD86 sulla superficie mDC sono strettamente associati alla reazione delle cellule Th2 e all’infiammazione delle vie aeree(23,24). Nei pazienti asmatici, MDC che esprimono CD80 e CD86 possono stimolare l’attivazione delle cellule T helper CD4+naïve a differenziarsi verso le cellule Th2, con conseguente squilibrio Th1/Th2. A seguito di ciò, l’inadeguata secrezione di citochine Th1 come IFN-γ, insieme all’aumentata secrezione di citochine Th2 come IL-4 e IL-5, causa infiammazione eosinofila e infiammazione allergica delle vie aeree(10,24,25). Duesegnali sono necessari per la promozione dell’attivazione Th2-cell(26-28). Il primo segnale è la formazione di complessi antitigeni-MHC sulla superficie mDC che si legano specificalmentecon il complesso recettore del recettore delle cellule T-CD3 sulle superfici delle cellule T, e il secondo segnale è l’espressione della molecola co-stimolante e l’attivazione funzionale sulle superfici mDC che si legano specificamente ai recettori sulle cellule T naïve; i due segnali formano un percorso co-stimolante (29). È stato anche suggerito che esiste un terzo segnale (30), poiché alcune molecole cellulari prodotte da DCS, come la linfopoietina stromale timica (TSLP), influenzano la direzione della differenziazione delle cellule Th. Tuttavia, tra tutti i segnali citati, il percorso co-stimolatore CD80/CD86-CD28 è il più classico e importante. Ricerche precedenti hanno indicatoche la via co-stimolante CD80/CD86-CD28 può essere un obiettivo efficace per il trattamento dell’asma dimostrando che il blocco della via co-stimolante CD80/CD86 mediante approcci anticorpali monoclonali può inibire l’infiammazione nei topi asmatici (25). Inoltre, sopprimendo la via CD80 / CD86co-stimolante utilizzando oligonucleotidi antisenso puòsopprimere l’iperattività delle vie aeree (31).

L’RNAi è un fenomeno di silenziamento genico in cui gli RNA a doppio filamento endogeni o esogeni specifici innescano la degradazione dell’mRNA omologo e inducono la perdita dei fenotipi funzionali corrispondenti. Da quando la tecnica è stata scoperta per la prima volta nel 1998 da Fire et al (32), la tecnica ha subito un ulteriore sviluppo per raggiungere un elevato grado di specificità ed efficienza. L’applicazione terapeutica della RNAitechnology è un argomento che ha attirato alti livelli di interesse nella ricerca medica e clinica di base negli ultimi anni.La capacità di RNAi di inibire l’espressione genica virulenta è stata ampiamente utilizzata per trattare una varietà di malattie (33-35).Inoltre, una serie di studi ha riferito che RNAi può essere usato INDCS per diagnosticare e trattare l’asma bronchiale (36-39).Darcan-Nicolaisen et al (40) hanno scoperto che i due principali segni di asma allergico nel modello murino indotto da asma, che sono l’infiammazione delle vie aeree e l’iperattività, sono stati significativamente migliorati dal trasduttore di segnale e dall’attivatore della trascrizione 6 (STAT6) che silenzia nelle cellule epiteliali delle vie aeree utilizzando la somministrazione di gocce nasali siRNA.Moriwaki et al (41)hanno dimostrato che il soppressore mediato da siRNA del silenziamento genico della citochina 3(SOCS3) potrebbe sopprimere la reattività delle vie aeree e l’infiltrazione eosinofila indotta dalla stimolazione allergenica nei topi asmatici. Zheng et al (42) hanno scoperto che l’applicazione di siRNA era in grado di inibire l’espressione genica della tirosina protein chinasi (TPK) nei DCS dei topi asmatici, reprimendo la capacità funzionale dei DCS come cellule che presentano l’antigene, inibendo così l’attivazione e la differenziazione delle cellule T. Tuttavia, gli studi riguardanti gli effetti del knockdown CD80 e CD86 mediato da siRNA in DCS sulla differenziazione delle cellule T nei topi asmatici sono carenti. Nello studio attuale, l’mRNA CD80 e CD86 e l’espressione proteica nei DCS derivati da ossa murine sono stati diminuiti con successo con il siRNA mirato a CD80 e CD86, che ha verificato l’efficienza dell’RNAi.

Nel presente studio, è stato utilizzato un modello murino asmatico stabilito secondo metodi precedentemente riportati(43). I risultati hanno indicato chele MDC ottenute dal gruppo asmatico hanno mostrato un aumento dei livelli di espressione di cd80 e CD86, il che implica che la capacità CD80/CD86 può essere aumentata nei pazienti asmatici. In seguito alla trasfezione degli MDC con SIRNA mirati a CD80 e CD86, i livelli di espressione di RNA e i tassi di espressione positiva delle proteine di CD80 e CD86 sono stati significativamente diminuiti, confermando l’effetto inibitorio che l’approccio siRNA aveva sulle molecole co-stimolatrici CD80 e CD86 a livello trascrizionale e traduttivo. Nel surnatante dalla co-coltura di mDCs e cellule T, RNAi ha indotto un aumento dell’espressione IFN-γ e una riduzione dei livelli ofIL-4, indicando che la diminuzione dell’espressione delle molecole eco-stimolatorie CD80 e CD86 in MDCS ha indebolito la via co-stimolatoria CD80/CD86-CD28 nei topi asmatici. RNAi ha anche influenzato l’espressione delle citochine Th1/Th2, indicando che lo squilibrio originale Th1/Th2 è stato modificato e, di conseguenza, è stata indotta l’immunetolleranza. Questi risultati indicano che CD80 e CD86may sono obiettivi potenziali per l’applicazione di RNAi nel trattamento di asma e forniscono una nuova via per la terapia genica di asma.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto da un progetto aperto Grantsfrom lo Stato Key Laboratory of Respiratory Disease (Guangzhou,Cina) (grant no. 2007DA80154F1107).

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