4.3 BBB-crossing BSABS engineered with single-domain antibodies
Gli SDAB sono piccoli (15 kDa), frammenti monomerici di anticorpi che legano l’antigene che offrono vari vantaggi rispetto ad altri frammenti di anticorpi come “elementi costitutivi” per i bsAbs. Essi si verificano in natura come la porzione antigene-vincolante di anticorpi a catena pesante in specie camelidi (chiamato VHH) e pesci cartilaginei (chiamato VNAR) o possono essere generati da I convenzionali ottenendo o ingegneria monomerica, VH stabile o domini VL (Hamers-Casterman et al., 1993; Hussack et al., 2012; Kim et al. Nel 2014, Nuttall, 2012, Ward, Güssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989). Gli SDAB sono altamente stabili e compatti e possono accedere a epitopi incassati nelle proteine, come le cavità dei recettori o i siti attivi degli enzimi, che sono spesso “nascosti” dallegG convenzionali e possono raggiungere affinità di legame target paragonabili a quelle degli anticorpi convenzionali (Lauwereys et al., 1998; Staus et al., 2014). Queste unità monomeriche antigene-leganti non si accoppiano con catene leggere, che li rendono ottimi mattoni per BSAB eterodimerizzati in quanto evitano difficoltà di accoppiamento catena leggera improprio (Hamers-Casterman et al. nel 1993, Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). I BSAB eterodimerici possono essere creati con uno o entrambi i “bracci” sdAb, quest’ultimo simile nella struttura agli anticorpi a catena pesante camelide (Fig. 3 E). sdAbs può anche essere utilizzato in varie fusioni mono, bi o tetravalenti con anticorpi terapeutici convenzionali o Fab (Fig. 3E), generalmente risultando in molecole più piccole e meno complesse, rispetto a quelle generate con SCFV o FAB come elementi costitutivi, che tendono ad essere biofisicamente ben comportati e facili da produrre (Holliger & Hudson, 2005). L’umanizzazione dei VHHS e l’ingegneria degli SDAB sono ben descritti, consentendo di generare prontamente SDAB umani (ized) con affinità target ottimale e proprietà biofisiche eccezionali (Vincke et al., 2009).
Per valutare il potenziale uso del camelid VHH FC5 come vettore BBB all’interno di anticorpi bispecifici mirati al SNC, sono state progettate e valutate in vitro e in vivo fusioni monovalenti e bivalenti (N-e C – terminus) di FC5 con Fc umano (Farrington et al., 2014). L’affinità apparente di legame (Kdapp) al BEC del ratto della fusione bivalente FC5Fc era di 75 nM, mentre il legame monovalente FC5Fc era nell’intervallo micromolare. L’analisi di apparente trasmigrazione dei tassi (Papp) attraverso un modello in vitro di BBB, apparente SNC esposizione in derivati dal siero/CSF farmacocinetica della somministrazione sistemica di anticorpi costrutti e farmacologici risposte provocate dall’chimicamente coniugato BBB-impermeabile neuroattive peptidi in Hargreaves modello di dolore, ha fornito la prova di una maggiore BBB trasporto di questi grandi (75 kDa) molecole di anticorpo mediata da FC5: (1) in vitro Papp valori sono stati ~ 200 cm/min sia per mono e bivalenti N-terminale di fusione Fc molecole (FC5Fc) rispetto al 4-8 cm/min per il controllo VHH A20.1Fc o EG2Fc fusioni; (2) l’esposizione apparente del SNC della fusione FC5Fc era 30 volte superiore rispetto alle fusioni anticorpo-Fc del dominio di controllo; (3) la potenza farmacologica sistemica dei coniugati FC5Fc con neuropeptidi dalargin o galanina nel modello di dolore infiammatorio di Hargreaves era fino a 60 volte superiore rispetto ai coniugati monomerici FC5–neuropeptide. Questo risultato è stato attribuito alla lunga emivita circolatoria (~96 h) di FC5Fc–rispetto ai coniugati FC5-neuropeptide; (4) vari coniugati di neuropeptide VHH–Fc di controllo non hanno mostrato alcuna efficacia sistemica; (5) la fusione di FC5 al terminale C di Fc ha prodotto una capacità di attraversamento di BBB attenuata. In contrasto con gli anticorpi BBB-carrier targeting per TfR, sia le proteine di fusione FC5Fc mono – che bivalenti hanno mostrato un tasso simile di transcitosi in vitro, profili farmacocinetici plasmatici/CSF simili e una potenza sistemica simile nel modello di farmacodinamica in vivo, nonostante le differenze nell’apparente affinità di legame e valenza (Farrington et al., 2014). Questi studi hanno dimostrato che l’anticorpo FC5 a dominio singolo BBB-crossing può essere utilizzato come vettore di piattaforma BBB in entrambi i “half-anticorpi” eterodimerizzati e come fusione bi-o tetravalente più facilmente scalabile alle I convenzionali (Farrington et al., 2014).
Un altro potenziale vantaggio dei VHHs come portatori di BBB è la loro naturale resistenza a sfide biofisiche estreme, come temperatura e pH, nonché alla degradazione della proteasi (Kim et al., 2014), spesso incontrato in vari compartimenti endocitici durante la transcitosi. Entrambe le fusioni FC5 e FC5Fc sono interiorizzate in BEC tramite vescicole rivestite di clatrina e sono ordinate agli endosomi precoci. È interessante notare che FC5 è stato anche trovato per stimolare lo spargimento di microvescicole extracellulari (esosomi) da BEC (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013; Haqqani, Delaney, et al., 2013) in cui sia FC5 che livelli aumentati del suo recettore putativo Cdc50A sono stati rilevati da Western blot e spettrometria di massa mirata. Questo studio ha suggerito che gli esosomi di capannone possono essere la vescicola finale della via RMT rilasciata dalla superficie abluminale che trasporta il complesso recettore-anticorpo (schematicamente mostrato in Fig. 4). La via RMT e la formazione degli esosomi condividono alcune somiglianze notevoli. Come descritto nella prima scoperta del fatto, un anti-TfR anticorpo è stato monitorato mediante microscopia elettronica in reticolociti (Théry, 2011) dalla superficie delle cellule, in pozzi rivestite di clatrina, all’interno di early endosomes, sulla superficie interna di vescicole di multivesicular endosomes e infine rilasciato il fatto dopo la fusione del multivesicular endosomes con la membrana plasmatica (Fig. 4). RMT sembra svolgersi in modo simile e le microvescicole extracellulari BEC hanno dimostrato di contenere diversi recettori noti per trasportare macromolecole attraverso il BBB via RMT, tra cui TfR, LRPs, LDLR e IR (Haqqani, Delaney, et al., 2013).
Dagli studi descritti, dovrebbe essere evidente che il braccio portante BBB del BSAB mirato al SNC richiede un’attenta ottimizzazione per ciascun recettore RMT. Considerazioni importanti nella progettazione di BSABS per il targeting del SNC sono discusse di seguito in vista delle “lezioni apprese” dallo sviluppo di BSAB TfR-BACE1 e dal nostro lavoro con FC5 come anticorpo BBB-carrier.