La biotina e il suo partner legante avidina sono comunemente usati oggi in biologia molecolare per una serie di tecniche e protocolli diversi. In questo post discuteremo il ruolo naturale della biotina, la biotinilazione, la scoperta dell’interazione biotina-avidina e gli usi della biotinilazione in biologia molecolare!
Ulteriori informazioni sulla biotinilazione in vivo delle proteine di fusione batterica
La biotina è una vitamina essenziale per la vita
Sebbene la biotina sia più comunemente nota per il suo ruolo nella biologia molecolare, la biotina (vitamina H o vitamina B7) è prima un coenzima essenziale richiesto da tutti gli organismi La biotina è sintetizzata solo dalle piante, dalla maggior parte dei batteri e da alcuni funghi, quindi i mammiferi devono ottenere la vitamina attraverso fonti esterne. Gli esseri umani assorbono la maggior parte della biotina di cui hanno bisogno nell’intestino tenue dalla microflora che vi risiedono.
La biotina è un cofattore che nella sua forma attiva è legato covalentemente al sito attivo di enzimi metabolici chiave tra cui la biotina carbossilasi e le decarbossilasi. Questi enzimi catalizzano il trasferimento di gruppi carbossilici agli acidi organici per produrre importanti metaboliti cellulari. La biotina funge da trasportatore carbossilico da un composto all’altro. Questi enzimi dipendenti dalla biotina sono essenziali per processi come la gluconeogenesi, la lipogenesi, il metabolismo degli aminoacidi e la trasduzione energetica.
La biotinilazione è il processo generale mediante il quale la biotina viene aggiunta a una proteina o macromolecola. La biotina può essere aggiunta enzimaticamente o chimicamente. La biotinilazione enzimatica si verifica naturalmente nelle cellule ed è il processo mediante il quale la biotina viene legata covalentemente a una lisina specifica nel sito attivo di un enzima appena sintetizzato. La biotina proteina ligasi (BPL) è responsabile di questa modificazione proteica post-traslazionale altamente specifica. La maggior parte degli organismi ha meno di cinque enzimi nell’intero proteoma che sono biotinilati. In E. coli, ad esempio, il BPL, BirA, è responsabile della biotinilazione di una sola lisina nell’intero organismo sulla biotina carbossil carrier protein (BCCP).
Scoperta dell’interazione biotina-avidina
Alla fine del 1930 è stato osservato che gli animali nutriti con una dieta principalmente di albumi avrebbero sviluppato lesioni cutanee e altri terribili problemi di salute. Questa malattia è stata definita” lesione del bianco d’uovo ” ed è stata determinata per essere dovuto una carenza in vitamina H più successivamente ribattezzata vitamina B7/biotina. La lesione dell’albume d’uovo affligge questi animali anche se la loro dieta veniva integrata con biotina. Così qualcosa nell’albume stava sequestrando la biotina dall’assorbimento. Nel 1940 Esmond E. Snell fu in grado di purificare la proteina responsabile del legame con la biotina, l’avidina. Avidin è stato giustamente chiamato per il pollo,” Aviaria”, uovo è stato purificato da. Snell in seguito ha confermato che avidin era davvero il colpevole di lesioni al bianco d’uovo alimentando ratti purificati avidin (Kresege et al., 2004). L’avidina è una glicoproteina costituita da quattro subunità identiche che possono legare ciascuna una molecola di biotina.
La biotina e l’avidina hanno un’affinità estremamente forte l’una per l’altra. In realtà il legame tra loro è una delle più forti interazioni proteina-ligando non covalenti presenti in natura. Una volta formato il legame non è influenzato da variazioni di pH, temperatura o solventi organici.
Usi della biotina in biologia molecolare
La biotina è una molecola relativamente piccola e solubile in acqua che non interferisce con le macromolecole a cui viene aggiunta. La biotina inoltre ha una catena laterale esposta che può essere manipolata facilmente per fare le specie reattive senza colpire il sito obbligatorio dell’avidina. Con tutte queste caratteristiche non sorprende che gli scienziati abbiano iniziato a sfruttare la biotina e la sua forte interazione con l’avidina per scopi di biologia molecolare e biotecnologia.
Una volta che un polipeptide è biotinilato (più su questo sotto) può essere incubato o co-espresso con avidina o una proteina strutturalmente simile che è stata scoperta nel 1960, strepavidina. Il complesso Biotina-avidina può quindi essere utilizzato e / o manipolato per lo scopo previsto di uno scienziato. Due degli usi più comuni della biotinilazione in laboratorio sono la purificazione delle proteine e gli esperimenti di immunoprecipitazione. Proteine o complessi biotinilati possono essere facilmente purificati utilizzando colonne o perline rivestite con avidina.
L’interazione biotina-avidina è stata anche adattata per l’uso nell’immunoistochimica e nell’etichettatura degli anticorpi. In questi esperimenti, la biotina viene aggiunta a un anticorpo primario o secondario che si rivolge rispettivamente alla proteina di interesse o all’anticorpo primario. Avidin legato a un reporter viene quindi aggiunto alla reazione per un facile rilevamento. I siti di legame multipli della biotina trovati su avidin sono inoltre ideali per amplificazione del segnale durante questi esperimenti. Durante il rilevamento, un enzima reporter biotinilato che viene pre-incubato con avidina libera può essere aggiunto al campione. Qualsiasi sito libero di legame alla biotina su questo complesso può legarsi al tuo anticorpo biotinilato. Questo crea una grande rete di complessi biotina-avidina legati alla proteina di interesse che porta all’amplificazione del segnale reporter e alla rilevazione più facile. Questa strategia è indicata come immunoistochimica (IHC) del complesso di Avidina-biotina (ABC). Per ulteriori informazioni su ABC e IHC consulta la guida di Thermo Fisher Scientific.
Esistono una serie di altre applicazioni di biologia molecolare per la biotina e l’avidina. Un breve elenco di alcune altre applicazioni comuni e link a documenti e pagine Web pertinenti sono elencati di seguito.
- EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays)
- ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
- Southern/Northern Blotting
- Cell surface labelling
- Attaching polypeptides to a substrate
- Flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS)
- In situ hybridization
Methods for biotinylating your macromolecule of interest
To utilize the natural binding of biotina e avidina, macromolecole di interesse prima devono essere biotinilate. Gli scienziati hanno sviluppato diversi metodi per biotinilare chimicamente macromolecole di interesse sia in vitro che in vivo.
Reagenti di biotinilazione:
La catena laterale esposta della biotina può essere reticolata ai gruppi funzionali dell’amminoacido in vivo via i prodotti chimici specializzati (reagenti di biotinilazione). Ci sono una varietà di reagenti di biotinilazione disponibili che differiscono nei gruppi funzionali o residui che mirano, così come la loro solubilità, e quindi diversi reagenti sono utili per la biotinilazione in diversi microambiente. Esistono anche reagenti di biotinilazione reversibili e scindibili per aiutare con l’eluizione specifica delle proteine biotinilate. Per informazioni sulla determinazione del reagente di biotinilazione da utilizzare, consulta lo strumento di selezione dei reagenti di biotinilazione di Thermo Fisher Scientific.
AviTag e BirA:
Le proteine possono anche essere biotinilate sfruttando la specificità dell’E.coli BPL, BirA. Se vi ricordate, BirA biotinylates solo una lisina in tutto il proteoma di E. coli. Utilizzando questa conoscenza, gli scienziati hanno identificato la sequenza di aminoacidi 13 necessaria per il riconoscimento BirA e la biotinilazione. Questa sequenza di 13 aminoacidi è chiamata AviTag. Usando AviTag, si può etichettare una proteina di interesse con biotina semplicemente creando una fusione in cui AviTag viene aggiunto al terminale N o C della proteina. BirA ha dimostrato di biotinilare efficacemente le proteine che esprimono AviTag in batteri, lieviti, insetti e cellule di mammiferi. Guarda Kay et al., 2009 for methods on biotinylating proteins with BirA.
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Etichettatura degli oligonucleotidi:
La biotina può essere aggiunta a uno dei due terminali di una sequenza di DNA durante una reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando un primer biotinilato. La biotina può anche essere incorporata enzimaticamente durante la PCR utilizzando un dUTP marcato con biotina. Esistono diversi tipi di etichette di biotina che possono essere aggiunte a un oligonucleotide a seconda dell’applicazione a valle. Gli oligonucleotidi etichettati con biotina possono essere utilizzati in una moltitudine di applicazioni, tra cui, ma non solo, l’ibridazione in situ, il blotting (settentrionale e meridionale) e il legame di affinità.
Fotobiotinilazione:
La fotobiotina può essere utilizzata per etichettare in modo non selettivo DNA e RNA. L’acetato della fotobiotina consiste di una molecola della biotina attaccata ad un gruppo fotoreattivo dell’arilazide. Sotto una forte luce visibile, il gruppo arilazidico diventa reattivo e forma un legame con gli acidi nucleici vicini (McInnes et al., 1990). La fotobiotinilazione è a volte più facile e meno costosa di altri metodi enzimatici. Gli scienziati hanno comunemente usato questo metodo per attaccare proteine o polipeptidi a un substrato solido (Holden e Cremer, 2003).
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Ulteriori risorse sul blog Addgene
- In vivo biotinilazione delle proteine di fusione batterica
- Scopri come la biotina viene utilizzata in Split-BioID: un metodo migliorato per studiare le interazioni proteina-proteina
- Scopri come la biotina può essere utilizzata con CRISPR