Prevalenza di Escherichia coli multiresistente Isolato da fonti di acqua potabile

Abstract

Il controllo delle malattie infettive è gravemente minacciato dall’aumento del numero di microrganismi resistenti agli agenti antimicrobici. Questo perché le infezioni causate da microrganismi resistenti spesso non riescono a rispondere al trattamento convenzionale, con conseguente malattia prolungata e maggiore rischio di morte. I batteri resistenti agli antimicrobici sono presenti anche in varie fonti d’acqua. Questo studio ha quindi cercato di documentare la qualità microbiologica e gli antibiogrammi degli isolati batterici (ceppi di E. coli) provenienti da sei diverse fonti d’acqua al fine di determinare la loro sicurezza per il consumo umano e di fornire dati antibiotici aggiornati per il trattamento pragmatico dei pazienti. L’isolamento e l’identificazione dei batteri è stato fatto utilizzando API e metodi convenzionali. Il test di suscettibilità agli antibiotici è stato condotto utilizzando il metodo Kirby–Bauer. I risultati ottenuti hanno indicato che tutte le fonti d’acqua testate erano di scarsa qualità. Batteri isolati inclusi E. coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp., Salmonella typhi, Streptococcus spp., Proteus vulgaris, Vibrio cholera, Shigella spp., Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis. The prevalence of multidrug-resistant E. coli was 49.48%. E. coli isolates showed high resistance patterns to the tested antibiotics. They were most resistant to penicillin (32.99%), cefuroxime (28.87%), erythromycin (23.71%), and tetracycline (21.45%). In contrast, they were susceptible to nitrofurantoin (93.8%), cefotaxime and amikacin (91.75%), gentamicin (90.7%), nalidixic acid (89.65%), ciprofloxacin (74.2%), chloramphenicol (69.07%), acido pipemidico (65,97%) e cefuroxima (52,58%). Il sessantatré percento (63%) dei ceppi multiresistenti di E. coli ha registrato un valore di indice di resistenza agli antibiotici multipla (MAR) >0.2. Gli antibiotici sensibili, in particolare la nitrofurantoina, sono quindi raccomandati nel trattamento pratico delle malattie batteriche trasmesse dall’acqua.

1. Introduzione

Gli antibiotici sono probabilmente la forma di chemioterapia di maggior successo sviluppata nel 20 ° secolo e salvano innumerevoli vite umane ogni giorno . L’emergere di batteri resistenti agli antibiotici limita l’uso clinico degli antibiotici e, man mano che i batteri resistenti diventano più diffusi, aumenta la preoccupazione che gli antibiotici esistenti diventino inefficaci contro questi agenti patogeni e più costosi .

Geni resistenti agli antibiotici che conferiscono resistenza a un’ampia varietà di antibiotici sono stati identificati in una vasta gamma di ambienti idrici, compresa l’acqua potabile nei paesi sviluppati e in via di sviluppo . Il principale rischio per la salute pubblica è che i geni di resistenza vengano trasferiti dai batteri ambientali agli agenti patogeni umani. Il potenziale dell’acqua potabile di trasportare agenti patogeni microbici a un numero maggiore di persone, causando malattie successive, è ben documentato nei paesi a tutti i livelli di sviluppo economico . Inoltre, la disponibilità di acqua potabile sicura è una caratteristica indispensabile per prevenire le malattie epidemiche e migliorare la qualità della vita . Secondo l’Organizzazione Mondiale della Sanità, l ‘ 80% di tutte le malattie sono attribuite a acque non sicure . I paesi in via di sviluppo, in particolare, sono afflitti da malattie legate all’acqua, come la diarrea, che rappresentano il 10% del peso della malattia in tali paesi .

Escherichia coli è un membro dei coliformi feacal che contaminano l’acqua potabile dai rifiuti feacal umani e animali. E. coli è stato il principale indicatore di contaminazione fecale nel monitoraggio della qualità dell’acqua per molti decenni. Durante le piogge, questi coliformi possono essere lavati in insenature, fiumi, torrenti, laghi o acque sotterranee. L’acqua potabile non trattata proveniente da queste fonti contiene coliformi tra cui E. coli.

E. coli ha anche dimostrato di essere un serbatoio significativo di geni che codificano per la resistenza ai farmaci antimicrobici e quindi è un indicatore utile per la resistenza nelle comunità batteriche . Sebbene ci siano diversi studi che valutano la resistenza multidrug (MDR) nelle popolazioni di E. coli di origine animale, non è stato fatto molto lavoro sull’ecologia di MDR . La diffusione di MDR in ambienti in cui gli antibiotici non sono utilizzati è una possibilità che non è stata ancora ben studiata, anche se è stato postulato che l’acqua potrebbe diffondere la resistenza antimicrobica . Gli obiettivi di questo studio sono determinare il modello di sensibilità agli antibiotici e l’indice di resistenza agli antibiotici multipli di ceppi di E. coli isolati da sei fonti di acqua potabile durante il monitoraggio batteriologico nell’arco di un anno.

2. Materiali e metodi

2.1. Siti di raccolta dei campioni

Dopo diverse visite preliminari a varie comunità nei distretti, sono stati selezionati 57 siti di campionamento comprendenti sei diverse fonti d’acqua che includono dighe, pozzi trivellati, sorgenti di ruscelli, fiumi, canali e pozzi scavati a mano in 27 comunità. I campioni sono stati prelevati da luoghi rappresentativi delle fonti idriche e/o delle reti di distribuzione da cui l’acqua viene consegnata agli abitanti e / o ai punti di utilizzo basati principalmente su fattori quali la popolazione e l’entità dell’utilizzo o il livello di protezione dell’acqua da queste fonti. La maggior parte delle comunità sono dominate da agricoltori. Ogni comunità selezionata aveva almeno un pozzo trivellato o un ruscello come principale fonte d’acqua per gli abitanti.

2.2. Dettagli dell’osservazione del sito

Prima del campionamento dell’acqua, sono state fatte importanti osservazioni intorno ai siti di campionamento. Queste osservazioni hanno incluso le condizioni sanitarie e le possibili fonti di contaminazione, che potrebbero influenzare la qualità dell’acqua dalle fonti campionate.

Sono stati registrati anche record sul campo per i seguenti fattori ambientali: chiarezza/torbidità dell’acqua (chiarezza visiva nell’acqua, cioè foglie, detriti e alghe), condizioni meteorologiche (temperatura, vento e pioggia), presenza di animali (uccelli/anatre) e altri commenti (ad esempio, problemi di sistema, cioè apparecchiature di disinfezione / filtrazione e incidenti fecali).

2.3. Dimensione del campione e frequenza di campionamento

Un totale di centoventidue campioni di acqua sono stati raccolti per la valutazione tra giugno 2011 e maggio 2012. Il periodo di raccolta del campione si estendeva sulle due stagioni in Ghana, cioè le stagioni secche e piovose. Tutte le procedure di campionamento e conservazione dell’acqua sono state eseguite secondo i metodi standard per l’esame dell’acqua e delle acque reflue e le linee guida dell’OMS per la qualità dell’acqua potabile . Il campionamento per l’analisi batteriologica è stato fatto in modo asettico con cura, garantendo l’assenza di contaminazione esterna dei campioni. Tutti i campioni sono stati trasportati in laboratorio entro 2 ore.

2.4. Isolamento e identificazione dei batteri

Tutti gli organismi Gram-positivi sono stati identificati con metodi convenzionali come la macchia di gram, la catalasi positiva, la coagulasi del tubo, il test delle desossiribonucleasi (DNasi) e così via, mentre un kit API 20E è stato utilizzato per identificare l’organismo Gram-negativo. Il ceppo 25922 di E. coli è stato utilizzato come controllo positivo per gli isolati di E. coli.

2.5. Test di sensibilità antibatterica di E. coli

Ciascuno degli isolati (E. coli) è stato sottoposto a test di sensibilità agli antibiotici utilizzando il metodo Kirby–Bauer che è stato standardizzato e valutato dai metodi del Comitato nazionale per gli standard di laboratorio clinici . Gli isolati coltivati durante la notte su Agar nutritivo sono stati sospesi in soluzione salina normale sterile (0,9% p / v NaCl) utilizzando un anello di filo sterile fino a quando la torbidità era equivalente agli standard 0,5 Mcfarland. Tamponi di cotone non tossici sterili immersi nell’inocula standardizzata sono stati utilizzati per striare l’intera superficie delle piastre di agar Mueller–Hinton. La E. coli isolati sono stati poi testati contro quattordici antibiotici come segue: ampicillina (10 µg), pipemidic acido (20 ug), cloramfenicolo (30 µg), ciprofloxacina (5 µg), co-trimoxazole (25 µg), eritromicina (15 µg), nitrofurantoina (300 µg), penicillina (10 UI), cefuroxima (30 µg), cefotaxime (30 µg), nalidixic acid (30 µg), amikacina (30 µg), tetraciclina (30 µg), e gentamicina (10 µg). I dischi antibiotici sono stati posizionati in modo asettico usando una pinza sterile e tutte le piastre sono state incubate (Gallenkamp England, modello IH-150) a 37°C per 24 ore . I risultati sono stati interpretati utilizzando NCCLS .

3. Risultati

I risultati della Tabella 1 mostrano che durante il periodo di studio sono stati ottenuti un totale di cinquecentoventi isolati batterici (520). Un numero significativo di isolati (305) che rappresentano il 58,65% del totale sono stati ottenuti durante la stagione secca, contro (205) che rappresentano il 41,35% nella stagione delle piogge.

L’organismo più comunemente presente nei campioni d’acqua era Klebsiella spp. (104), che rappresentano il 20% del numero totale di isolati ottenuti. Il più alto numero di Klebsiella spp. (18) è stato isolato da fonti di acqua corrente durante la stagione secca e il più basso (1) dai fiumi durante la stagione delle piogge. Il successivo organismo più presente è stato E. coli (97), che rappresenta il 18,7% degli isolati batterici totali. Questo è stato seguito da Pseudomonas aeruginosa (15,61%), Enterobacter spp. (15,4%), Proteus vulgaris (13,1%) e Enterococcus faecali (9,2%). L’organismo meno isolato era Vibrio cholerae (1,2%) e Shigella spp. (1.2%). Vibrio cholerae è stato isolato in quattro fonti d’acqua, vale a dire, ruscello, pozzo trivellato, pozzi scavati a mano, e sorgenti d’acqua diga, mentre Shigella spp. è stato isolato in 3: ruscello, pozzo trivellato, e sorgenti d ” acqua diga.

Un totale di centoventidue campioni di acqua sono stati raccolti per l’analisi batteriologica. I risultati della Tabella 2 mostrano che novantasette ceppi di E. coli sono stati isolati durante il periodo dello studio. Cinquantotto ceppi che rappresentano il 59,79% sono stati isolati durante la stagione secca contro trentanove che rappresentano il 40,21% nella stagione delle piogge. Il maggior numero di ceppi isolati da una singola fonte d’acqua proveniva da dighe (28), pari al 29%. Seguono le fonti di acqua di ruscello (26) che rappresentano il 27%, i pozzi scavati a mano (24) che rappresentano il 25% e le fonti di acqua di trivellazione (11) che rappresentano l ‘ 11%. Le fonti di acqua fluviale hanno prodotto il minor numero di ceppi isolati (2) che rappresentano il 2% e le fonti di acqua del canale (6) che rappresentano il 6%. Gli isolati più alti durante la stagione delle piogge sono stati ottenuti da dighe (12) seguite da fonti di acqua corrente (10) e pozzi scavati a mano (10). Il maggior numero di isolati durante la stagione secca è stato ottenuto da dighe (16) seguite da fonti di acqua corrente (17). Il minor numero di isolati durante la stagione delle piogge è stato ottenuto dai canali (3) seguiti da fonti di acqua trivellata (4). Nessun ceppo di E. coli è stato isolato dalle fonti d’acqua del fiume. Il minor numero di isolati durante la stagione secca è stato ottenuto dai fiumi (2) seguiti da fonti d’acqua dei canali (3).

Results from Table 3 reveal the antibiotic susceptibility profile of the E. coli strains. Tutti i ceppi sono stati testati contro 14 diversi antibiotici, utilizzando la diffusione del disco Kirby-Bauer, standardizzati e valutati dai metodi del Comitato Nazionale per gli standard di laboratorio clinico . La tabella 3 mostra che i ceppi di E. coli erano più resistenti alla penicillina (32) con il 32,99%, seguiti da cefuroxima (28) con il 28%, eritromicina (23) con il 23,71%, tetraciclina (21) con il 21,45%, cloramfenicolo (18) con il 18,65%, acido pipemidico (13) con il 13,40% e ampicillina (11) con l ‘ 11,32%. Sette dei quattordici antibiotici avevano dieci o meno numero di isolati che mostrano resistenza. Quattro isolati che rappresentano il 4,12% erano resistenti a ciascuno dei seguenti antibiotici: cefotaxima, acido nalidixico e nitrofurantoina. Seguono gentamicina (5) che rappresenta il 5,15%, amikacina (7) che rappresenta il 7,2%, ciprofloxacina (8) che rappresenta l ‘8,5% e infine co-trimossazolo (8) che rappresenta l’ 8,5%. La tabella 3 mostra che i ceppi di E. coli erano più sensibili/sensibili alla nitrofurantoina (91), pari al 93,8%, e questo è stato seguito da cefotaxime e amikacina (89) pari al 91.75%, gentamicina (88) rappresenta il 90,7%, acido nalidixico (87) rappresenta l ‘ 89,65%, ciprofloxacina (72) rappresenta il 74,2%, cloramfenicolo (67) rappresenta il 69,07%, acido pipemidico (64) rappresenta il 65,97% e cefuroxima (CXM) (51) rappresenta il 52,58%. Quattro dei quattordici antibiotici avevano cinquanta o meno numero di isolati che mostrano resistenza. Erano penicillina (14), tetraciclina (29), ampicillina (45) ed eritromicina (50).

Analysis of multiple drug resistance of E. isolati coli dalle fonti d’acqua rivela che quarantotto isolati che rappresentano una grande percentuale di (49,48%) di isolati di E. coli hanno mostrato resistenza contro due o più antibiotici, quindi classificati come resistenza multidrug. Ciò crea un’enorme preoccupazione per la salute pubblica.

4. Discussione

La presenza di E. coli nelle varie fonti d’acqua può comportare rischi per la salute come le malattie diarroiche che rappresentano un notevole grado di morbilità e mortalità negli adulti e nei bambini . Il controllo della diarrea può richiedere la somministrazione di antibiotici. Tuttavia, diversi ceppi di E. coli sono noti per essere resistenti a una vasta gamma di antibiotici . Le resistenze antibiotiche multiple si riferiscono alla resistenza a due o più classi di antibiotici. Le resistenze antibiotiche multiple di E. coli stabilite in questo studio concordano con altri risultati . Ceppi di E. coli e Salmonella spp. ha rappresentato diversi focolai negli Stati Uniti e in tutto il mondo, in parte a causa della resistenza al cloramfenicolo, ampicillina e trimetoprim .

La frequenza della resistenza alla penicillina nell’attuale studio era elevata tra gli isolati rispetto alla resistenza al cloramfenicolo e all’ampicillina osservata negli isolati ottenuti dalle varie fonti d’acqua. Ciò può essere dovuto all’uso generale di antibiotici economici nella comunità ghanese o può essere dovuto alla produzione di enzimi beta-lattamasi. La resistenza di E. coli contro l’ampicillina è stata osservata da Çelebi et. al. , Olowe et al. , e Yurdakoek et al. . La resistenza emergente del co-trimossazolo e della ciprofloxacina dai siti a valle è di seria preoccupazione, poichè questi sono le droghe preferite per molti batteri gram-negativi . Il meccanismo più comune di resistenza al co-trimossazolo è l’acquisizione di enzimi plasmid-mediati, variante diaminopirimidina folato reduttasi . La bassa resistenza all’amikacina e alla gentamicina potrebbe essere dovuta al minor uso di questi antibiotici nella pratica clinica e/o nella medicina veterinaria. La tendenza crescente di resistenza in tutti gli isolati (coliformi totali e fecali) da monte a valle afferma il fatto che gli antibiotici smaltiti possono essere stati lavati lungo le fonti d’acqua e accumulati a valle soprattutto durante la stagione delle piogge che rappresentano l’alta resistenza.

Le differenze nei profili di resistenza in questo studio ambientale riflettono chiaramente le differenze nella pressione della procedura di selezione nei siti / aree studiati. Il più alto livello di resistenza agli antibiotici tra i coliformi dei siti midstream e downstream delle comunità ghanesi è preoccupante poiché la maggior parte degli abitanti fa il bagno, lava i vestiti e persino smaltisce le acque reflue umane nelle fonti d’acqua a midstream e downstream mentre alcuni occupanti e non occupati usano queste fonti d’acqua per bere e/o scopi domestici. In Mangalore, è stato riferito che le acque reflue domestiche non trattate o parzialmente trattate vengono rilasciate in estuari aperti, il che rappresenta l’alto livello di resistenza agli antibiotici .

La resistenza a più farmaci è definita come resistenza a tutti gli antibiotici testati in almeno due delle seguenti tre classi: lattami, aminoglicosidi e chinoloni . I caratteri di resistenza multidrug (MDR) degli isolati sono stati identificati osservando il modello di resistenza degli isolati agli antibiotici. L’indice MAR di un isolato è definito come a / b, dove a rappresenta il numero di antibiotici a cui l’isolato era resistente e b rappresenta il numero di antibiotici a cui l’isolato è stato sottoposto . L’analisi dell’indice MAR rivela che trenta dei ceppi di E. coli multiresistenti avevano un valore di indice MAR molto alto (>0.2). L’alto indice MAR registrato in questo studio riferisce il fatto che le fonti d’acqua potrebbero essere state altamente contaminate da antibiotici a causa dell’elevato utilizzo di queste sostanze chimiche nelle aree circostanti delle varie fonti d’acqua. Questo è in accordo con il Tambekar et al.’s relazione che afferma che i batteri provenienti da un ambiente in cui vengono utilizzati diversi antibiotici di solito producono indice MAR maggiore di 0,2. MAR indicizzazione sotto 0.2 determinato in questo studio era in realtà al di sotto del valore illogico della contaminazione del rischio . Tuttavia, i campioni che hanno prodotto l’indicizzazione MAR superiore a 0,2 hanno indicato un alto rischio di contaminazione. La differenza nell’indicizzazione MAR nelle diverse fonti d’acqua ha indicato l’impatto dell’urbanizzazione sui livelli di resistenza agli antibiotici.

La qualità microbiologica delle varie fonti d’acqua analizzate era bassa in quanto diversi ceppi batterici erano isolati con frequenze diverse. In misura maggiore, sono state rilevate differenze nelle frequenze di resistenza agli antibiotici in E. ceppi di coli provenienti da diverse fonti d’acqua tali che alcuni ceppi di E. coli erano altamente resistenti a cefotaxime, acido nalidixico, nitrofurantoina, gentamicina, amikacina, ciprofloxacina e co-trimossazolo. Le differenze nei ceppi antibiotici delle varie fonti d’acqua potrebbero riflettere l’uso specifico di antibiotici intorno alla fonte specificata. L’alta prevalenza della resistenza alla penicillina e al cloramfenicolo registrata pone una seria preoccupazione per la salute pubblica poiché questi antibiotici hanno meno possibilità di curare i pazienti infetti che utilizzano le fonti d’acqua intervistate come acqua potabile o per scopi domestici. Infatti, la crescente prevalenza di resistenza negli isolati, in particolare, di origine umana, può avere un’importante implicazione terapeutica che richiede cautela nell’uso indiscriminato di antibiotici sull’uomo. Tuttavia, quasi tutti i 97 ceppi di E. coli erano suscettibili ad alcuni antibiotici, vale a dire, nitrofurantoina (93.8%), seguita da cefotaxime e amikacina (91,75%), gentamicina (90,7%), acido nalidixico (89,65%), ciprofloxacina (74,2%), cloramfenicolo (69,07%), acido pipemidico (65,97%), e infine da cefuroxima (52,58%).

Nello studio sono stati registrati valori di indice MAR alti e bassi, che indicano il livello di rischio di contaminazione delle fonti d’acqua campionate, che richiedono politiche più restrittive sullo smaltimento delle fognature umane/animali e sulla balneazione/lavaggio in o vicino ai corpi idrici. Infine, il monitoraggio periodico della sensibilità agli antibiotici delle fonti d’acqua è importante per rilevare eventuali cambiamenti che potrebbero sorgere in futuro al fine di tenere il passo con tali cambiamenti per una migliore formulazione e attuazione di misure curative o politiche.

Disponibilità dei dati

I dati utilizzati per supportare i risultati di questo studio sono disponibili presso l’autore corrispondente su richiesta.

Conflitti di interesse

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Il sincero apprezzamento degli autori va allo staff del Dipartimento di Microbiologia del Noguchi Memorial Institute for Medical Research, Università del Ghana, per la loro assistenza durante le analisi di laboratorio del nostro lavoro. Gli autori hanno anche voluto riconoscere le enormi risorse ottenute dalla tesi “Sensibilità alle radiazioni e caratterizzazione molecolare di Escherichia coli multiresistente all’acqua” verso questo lavoro.