9 Il Ruolo delle Proteine nella Spliceosomal Nucleo Catalitico
Confrontare le dimensioni di snRNAs con il gruppo molto più ampio II introni solleva la possibilità che il gruppo II introne domini potrebbe essere stato sostituito da proteine nel spliceosomes durante l’evoluzione, dando origine alla moderna ribonucleoproteina (RNP) eucariotica splicing macchine. Sebbene non esista ancora una corrispondenza uno-a-uno, è facilmente possibile identificare le proteine spliceosomiali che svolgono una funzione mediata dagli elementi di RNA negli introni del gruppo II. Ad esempio, un certo numero di proteine associate a U2 funzionano nell’avviare e stabilizzare l’interazione del sito di snRNA-ramo U2 (Fig. 6.3).5,85 Negli introni del gruppo II, l’equivalente U2 (parte del dominio VI) è collegato in modo covalente al sito del ramo tramite un anello a forcina iperstabile in una disposizione che garantisce la formazione e la stabilità della loro interazione (Fig. 6.2). Da questa prospettiva evolutivamente, non sorprende che una grande frazione di proteine spliceosomiali si associ direttamente a uno snRNA, spesso aiutandolo nella sua funzione.5,85 Tuttavia, molte proteine spliceosomiali sono coinvolte nell’esecuzione di funzioni regolatorie non richieste nel contesto di un introne auto-splicing e sono probabilmente aggiunte più recenti al complemento proteico spliceosomiale.
Come accennato in precedenza, si pensa che l’ultimo antenato comune degli eucarioti avesse uno spliceosoma altamente evoluto e completamente funzionale che assomigliava a quelli trovati negli eucarioti moderni.1,2 Anche se questo spliceosoma probabilmente conteneva significativamente meno componenti rispetto anche al più piccolo dei moderni spliceosomi, i dati indicano che la maggior parte dei componenti chiave erano presenti nelle prime versioni degli spliceosomi.1-4 In effetti, un sottoinsieme del proteoma spliceosomiale che include proteine associate al nucleo catalitico mostra un significativo livello di conservazione tra diverse specie eucariotiche, con un certo numero di proteine spliceosomiali tra le proteine cellulari più conservate.85,86
Come accennato in precedenza, molti ribozimi ben caratterizzati sono associati a proteine in vivo che migliorano la loro attività catalitica da diversi meccanismi noti.83 Questi includono la stabilizzazione della struttura funzionale degli RNA, l’assistenza nel legame e nel posizionamento dei substrati e l’assistenza nel legame di ioni metallici funzionalmente importanti. Tuttavia, non è stata finora osservata una partecipazione diretta alla catalisi per nessuna delle proteine associate al ribozima studiate.83,87 Se si presume che lo spliceosoma sia un enzima RNA, gli SNRNA spliceosomiali sono ribozimi insoliti sotto molti aspetti. Forse la cosa più importante, sono insolitamente piccoli per un ribozima che catalizza la scissione del legame fosfodiesterico tramite l’attivazione di un nucleofilo non adiacente. Altri ribozimi naturali che catalizzano tali reazioni, vale a dire gli introni del gruppo I e II e la RNasi P, sono almeno due volte più lunghi della lunghezza combinata degli SNRNA U6 e U2 umani. Questi ribozimi sono anche molto più grandi dei ribozimi nucleolitici che attivano un nucleofilo 2′-idrossile adiacente per la scissione del legame fosfodiestere.24,88,89 Si pensa che le dimensioni maggiori consentano a questi ribozimi di piegarsi in strutture complesse stabilizzate da molteplici interazioni terziarie, che a loro volta consentono loro di creare sofisticati siti attivi in grado di posizionare con precisione il sito di scissione, gli ioni metallici del sito attivo e il nucleofilo remoto per l’attacco nucleofilo in linea. È concepibile che gli SNRNA U6 e U2, a causa della loro breve lunghezza, nella migliore delle ipotesi formino un ribozima di splicing inefficiente che richiede altri fattori spliceosomiali per il posizionamento stabile degli elementi del sito attivo e dei gruppi reagenti.
Si ritiene che Prp8, che è la proteina spliceosomiale più conservata, svolga tale ruolo nel sito attivo spliceosomiale. Prp8 è probabilmente la più interessante delle proteine spliceosomiali, in quanto è insolitamente conservata con il 61% di identità tra lievito e umano.86 Tuttavia, ha pochi motivi funzionali chiaramente distinguibili nella sua lunghezza di ~ 2300 aminoacidi, e i domini funzionali che sono stati individuati finora sono degenerati e probabilmente svolgono funzioni non correlate al ruolo cellulare del motivo fondatore originale.86 D’altra parte, Prp8 svolge chiaramente un ruolo molto critico nel sito attivo spliceosomiale. È stato reticolato ai 5′ e 3 ‘ siti della giuntura ed al sito del ramo di RNAs di premessenger, oltre a U5 e U6 snRNAs, che indica che è presente nel centro catalitico di spliceosomal e direttamente contatta i giocatori critici nella reazione d’impionbatura.86,90 Inoltre, è stato dimostrato che Prp8 interagisce con diverse proteine spliceosomiali chiave tra cui Snu114 e Brr2 (vedi sotto).86,91,92
Le mutazioni in Prp8 sono associate ad un ampio spettro di difetti spliceosomiali, tra cui alterazioni nella capacità degli spliceosomi di rifiutare siti di splicing subottimali e soppressione di difetti causati da mutazioni in altri fattori spliceosomiali come Prp28, Brr2, U4 e U6 SNRNA.86,93,94 Un sottoinsieme di mutanti Prp8 modula selettivamente l’efficienza del primo o del secondo passo di splicing, specialmente nei substrati subottimali.58,86,95 – 97 Queste osservazioni sono spiegate meglio da un’ipotesi che afferma che Prp8 è coinvolto nella stabilizzazione di conformazioni alternative, mutuamente esclusive del sito attivo che sono pronte per la catalisi del primo o del secondo passo di splicing, e che alcuni mutanti Prp8 potrebbero portare a iperstabilizzazione selettiva di uno di questi stati.58,96,98 Mentre prove significative suggeriscono che Prp8 è probabilmente coinvolto nel posizionamento dei substrati e nella stabilizzazione del sito attivo, non esiste attualmente alcuna prova diretta che suggerisca o confuti il suo coinvolgimento aggiuntivo nella coordinazione degli ioni metallici o nella partecipazione diretta alla catalisi spliceosomiale.
Questa incertezza deriva dal fatto che si sa molto poco sul modo in cui Prp8 svolge la sua funzione. Un innovativo test di screening mediato da trasposoni ha indicato che ampie regioni di Prp8 sono altamente sensibili all’inserimento di trasposoni e probabilmente funzionano come un’unica unità strutturale, sebbene sia stato possibile inserire trasposoni o addirittura dividere Prp8 in due frammenti in una serie di altre posizioni senza perdita di vitalità.90,92 A parte un segnale di localizzazione nucleare degenerato vicino al suo terminale N e un motivo RRM degenerato (RNA recognition motif) nel mezzo della proteina, solo altri due domini funzionali sono stati identificati in questa proteina lunga ~ 2300 aminoacidi.86
Un degenerato variante del MPN/Jab1 di dominio che è associato con gli enzimi deubiquitinating si trova vicino al C terminale di Prp8.86 Analisi della struttura ad alta risoluzione di un frammento di Prp8 contenente questo dominio ha dimostrato che gli ioni metallici-sito di legame del isopeptidase centro è compromessa, e quindi, probabilmente, non funziona come un enzima deubiquitinating.99.100 In vitro, un frammento di Prp8 contenente questo dominio potrebbe legarsi direttamente all’ubiquitina con un’affinità paragonabile ad altre proteine note che legano l’ubiquitina.101 Diverse mutazioni note di Prp8 che hanno interrotto lo splicing hanno anche interrotto il legame con l’ubiquitina in vitro, aumentando così la possibilità di un ruolo funzionale per l’ubiquitinazione nella regolazione dello splicing. È importante sottolineare che le analisi proteomiche hanno indicato che diversi fattori spliceosomiali, tra cui Sad1, Snu114, Rse1 e Prp8 stesso, sono ubiquitinati in vivo, e inoltre la proteina di base spliceosomiale Prp19 mostra l’attività della ligasi E3 ubiquitina in vitro.101-105 Inoltre, l’ubiquitina svolge un ruolo nella formazione e nel mantenimento di tri-snRNP, possibilmente modulando la regolazione mediata da Prp8 della funzione di Brr2.102 In alternativa, è anche possibile che il dominio MPN/Jab1 funzioni come piattaforma di interazione proteina-proteina. Un certo numero di mutazioni in Prp8 che rientrano in questo dominio portano alla cecità ereditaria retinite pigmentosa,86 e queste mutazioni hanno indebolito l’interazione di Prp8 con Brr2 e Snu114.99
È stata determinata la struttura ad alta risoluzione di un altro frammento di Prp8 che comprende una regione altamente conservata (69% di identità aminoacidica tra lievito e umano) situata vicino al suo dominio C-terminale. L’analisi della struttura ha rivelato la presenza di un dito β-tornante simile a quelli trovati nelle proteine ribosomiali e un dominio degenerato simile alla RNasi H.106-108 Mentre la geometria complessiva del motivo simile a RNase H a livello di struttura secondaria e terziaria era ben conservata, la sequenza primaria ha mostrato un livello di conservazione molto più basso e solo uno dei tre residui catalitici è presente nel sito attivo. Il residuo conservato, un aspartato, è coinvolto nel coordinamento di due ioni metallici catalitici nel sito attivo dei domini canonici della RNasi H. In uno studio, la mutazione di questo residuo in Prp8 in lievito ha provocato nessun difetto rilevabile della crescita, che potrebbe indicare la ridondanza o la mancanza di una funzione critica.108 In un altro studio, il suo effetto non ha potuto essere esaminato poiché la mutazione ha indotto il misfolding del frammento proteico.107 Nessun legame con ioni metallici è stato osservato dalla regione corrispondente al sito attivo del dominio RNasi H quando i cristalli sono stati coltivati in 200 mm MgCl2, indicando che il sito attivo degenerato manca di capacità di legame con ioni metallici. Inoltre, il frammento di Prp8 contenente questo dominio ha mostrato una capacità di legame dell’RNA molto debole, con un Kd da 20 µM a oltre 200 µM a seconda delle specie di RNA testate.106-108 Sebbene il frammento mostrasse un’affinità molto bassa per gli RNA di legame, mostrava una preferenza per gli RNA duplex di legame contenenti giunzioni a quattro vie.108 Negli spliceosomi umani attivati, si prevede che gli SNRNA U2 e U6 formino una tale struttura.53,69 Ciò che ha reso questo dominio simile a RNasi H particolarmente interessante è stato il fatto che gli amminoacidi corrispondenti al suo sito attivo sono posizionati adiacenti ai residui in Prp8 che in precedenza avevano dimostrato di reticolare al sito di giunzione 5′ in spliceosomi precatalitici.109 Tuttavia, l’efficienza della formazione di questo reticolato è stata ridotta man mano che gli spliceosomi precatalitici progredivano fino a diventare complessi spliceosomiali cataliticamente attivi.109 La diminuzione osservata nell’efficienza della reticolazione potrebbe essere interpretata per indicare che questa interazione è interrotta negli spliceosomi attivati. In alternativa, l’interazione può persistere, ma la formazione del crosslink stesso viene abolita a causa di un piccolo cambiamento nell’ambiente dei residui reticolati. Se questo dominio degenerato del tipo di RNasi H è effettivamente posizionato in prossimità del sito della giuntura 5 ‘ in spliceosomi cataliticamente attivi, è possibile che possa partecipare alla stabilizzazione della conformazione attiva degli SNRNA, posizionando i substrati nel sito attivo e/o coordinando ioni metallici catalitici. Mentre il dominio da solo non può legare RNA o ioni metallici, è possibile che in presenza di altri elementi del sito attivo possa formare parte del substrato o delle tasche di legame con ioni metallici. Nonostante queste possibilità intriganti, il ruolo di Prp8 nella catalisi spliceosomiale rimane incerto.