Polimeri derivati da fonti naturali o monomeri
Aminoacidi e materiali a base di saccaridi sono stati ampiamente esplorati per la consegna di acido nucleico, come più accuratamente rivisto altrove . Questi elementi costitutivi naturali hanno il potenziale di ridurre la citotossicità e, se ottimizzati, una funzione complessiva superiore rispetto ai biomateriali completamente sintetici. Qui verranno esaminati i polimeri di rilascio di acido nucleico a base di peptidi e carboidrati (Fig. 29.7 B).
Il primo polimero a base di aminoacidi ad essere perseguito era poly(Lys) , e molte iterazioni di questo polimero cationico sono state ampiamente studiate in modo simile al PEI e alle altre policazioni sintetiche sopra descritte. Poli (Lys) può efficacemente acidi nucleici complessi, ma la sua efficienza di trasfezione è bassa e richiede un trattamento cellulare con agenti endosomolitici come la clorochina per migliorare l’espressione genica. Tuttavia, i primi studi su poly(Lys) hanno prodotto importanti intuizioni meccanicistiche relative alla formulazione di poliplex, al traffico intracellulare e alla fuga degli endosomi . Mentre la promessa clinica di poly (Lys) è limitata, questi primi studi hanno avuto un impatto significativo sul campo.
Poly (istidina) (poly (His)) è un altro polimero a base di aminoacidi che ha dimostrato una certa utilità per la terapia genica. L’aminoacido His ha un imidazolo R-group contenente un’ammina secondaria che conferisce poli (His) con attività di spugna protonica per la fuga endosomiale . Polimeri contenenti sia Lys e His sono stati utilizzati con successo in combinazioni. In questi polimeri ibridi, le ammine primarie su Lys sono completamente protonate e cationiche a pH fisiologico, consentendo un’efficiente complessazione elettrostatica con il DNA. Il pKb inferiore delle ammine secondarie da His fornisce un’attività di spugna protonica complementare per la fuga dell’endosoma . L’efficienza di trasfezione dei polimeri con poli(His) innestati a poli(Lys) è significativamente migliorata dall’aggiunta della clorochina dell’agente di interruzione endosomiale, indicando che i polimeri da soli sono ancora parzialmente inclini all’intrappolamento endosomiale . Architetture altamente ramificate di polimeri His/Lys e policazioni riducibili contenenti His sono state trovate anche per fornire in modo efficiente siRNA . C’è anche un precedente per l’incorporazione di subunità a base di aminoacidi in altri sistemi di terapia genica al fine di produrre “ibridi” con funzionalità di consegna migliorata. Ad esempio, il suo è stato anche usato per modificare il chitosano (discusso più avanti) per migliorare la sua fuga endosomiale e l’efficienza della trasfezione .
I peptidi penetranti nelle cellule (CPPs) e i peptidi fusogenici sensibili al pH sono altre due classi di peptidi che sono stati rigorosamente esplorati per innescare l’assorbimento cellulare e la fuga endosomiale, rispettivamente. Queste classi peptidiche sono state utilizzate sia in combinazione che come componenti di polimeri multifunzionali e sistemi di consegna liposomiale. La maggior parte dei peptidi CPP e fusogenic sono derivati dalle tossine batteriche e dai vettori virali, o sono analoghi sintetici dei peptidi naturali. Il fattore trascrizionale transattivante dell’HIV-1 e il peptide antennapedia derivato dalla Drosophila sono due esempi di CPP ben studiati. Questi peptidi sono in genere ricchi di aminoacidi cationici, e di conseguenza, sintetico, ricco di arginina CPPS di vari tipi sono stati trovati anche per mediare biomacromolecolare assorbimento delle cellule di carico. La fusione di un CPP con un dominio di legame dsRNA è stata utilizzata per fornire siRNA in cellule primarie considerate difficili da trasfettare . Altri CPP derivati da Transportan 10 (designato PepFect) e CADY sono stati progettati per una consegna intracellulare efficiente. Fusioni di tumore-penetrante e CPPs sono stati generati che hanno dimostrato silenziamento di un oncogene migliorata la sopravvivenza nei topi La capacità di CPPs di innescare l’internalizzazione cellulare è stato sfruttato per la consegna di diverse classi di carico terapeutico tra cui plasmide DNA e siRNA (vedere CPP recensioni per ulteriori informazioni).
I peptidi fusogenici sono peptidi sensibili al pH che possono fondersi con o formare pori attraverso la membrana endosomiale. Un esempio è la tossina difterica, che ha una subunità che forma i pori transmembrana negli endosomi che consentono l’ingresso di un frammento di tossina legato al disolfuro nel citosol . Un altro esempio è l’emoagglutinina, una proteina influenzale che crea la fusione della membrana endosomiale dipendente dal pH per consegnare il materiale genetico virale nel citoplasma . Il peptide GALA è un peptide sintetico, pH-dipendente, fusogenico che è stato ampiamente caratterizzato . GALA si autoassembla e si inserisce in doppi strati lipidici a pH acido, formando un poro che permette il transito della membrana . Ad esempio, GALA è stato applicato con successo per migliorare l’efficienza della consegna citosolica del carico di acido nucleico confezionato in PAMAM e liposomi .
Il chitosano polisaccaride, ciclodestrine oligosaccaridi-like, e una varietà di altri glicopolimeri contenenti saccaridi rappresentano un’altra classe polimerica per la consegna di acido nucleico. Ad esempio, i polimeri anionici naturali a base di saccaridi possono essere fabbricati in NPS termodinamicamente stabili, polielettroliti complessi (PEC) attraverso l’associazione spontanea innescata tramite miscelazione di polielettroliti di carica opposta, come riportato da Prokop et al. . Tipicamente, PEC NPs sono fatti mescolando polimeri di nucleo polianionici, come alginato o condroitina solfato con policazioni corona come spermina cloridrato o poli (metilene-co-guanidina) cloridrato. Questo approccio multipolimerico nanoparticolato ha dimostrato di essere efficace per il trasferimento genico in vitro , in particolare nei sistemi cellulari che sono normalmente refrattari al trasferimento genico, come le isole pancreatiche e le cellule che presentano l’antigene. Inoltre, le superfici coronali PEC possono essere decorate con complessi di PEG-ligando per aumentare il targeting cellulare e ridurre l’assorbimento non specifico.
Il chitosano, un polisaccaride composto da unità di glucosamina e N-acetil glucosamina legate tramite legami glicosidici β(1→4), è uno dei polimeri saccaridici più studiati. Il chitosano trae vantaggio dall’essere un approccio” verde”, perché è una risorsa rinnovabile derivata dalla chitina. Questo polimero naturale è anche biodegradabile e non tossico. Il laboratorio Alonso ha introdotto NPS a base di chitosano realizzato tramite gelazione ionotropica, basata sull’interazione tra i gruppi negativi del tripolifosfato pentasodico e i gruppi amminici caricati positivamente sul chitosano. La chimica del chitosano è anche adattabile alla terapia genica nonvirale, poiché contiene diverse ammine primarie e secondarie in grado di endosomolisi attraverso l’effetto spugna protonica. Pertanto il chitosano è stato esaminato come polimero sensibile al pH per la somministrazione di acido nucleico. Howard et al. impiegato chitosano NPs contenente siRNA per abbattere una maggiore proteina fluorescente verde (eGFP) in entrambe le cellule di carcinoma polmonare umano H1299 e macrofagi peritoneali murini (riduzione del 77,9% e 89,3% della fluorescenza eGFP, rispettivamente). Il chitosano NP ha un alto potenziale per la consegna transmucosale. Efficace RNAi in vivo è stato raggiunto in cellule epiteliali bronchiolari di topi eGFP transgenici dopo somministrazione nasale di formulazioni chitosano / siRNA (riduzione del 37% e del 43% rispetto alla mancata corrispondenza e al controllo non trattato, rispettivamente). I principali inconvenienti del chitosano sono la scarsa solubilità nei tamponi fisiologici e l’attività endosomolitica inferiore rispetto ad alcuni polimeri di spugna protonica più forti. Di conseguenza, sono state apportate diverse varianti di chitosano con modifiche per aumentare la fuga e la solubilità endosomiale. Ad esempio, PEI e imidazoli sono stati entrambi coniugati al chitosano per migliorare le sue prestazioni nelle terapie geniche .
I polimeri cationici contenenti beta-ciclodestrine (β-CD) hanno mostrato una promessa precoce per la RNAi clinica. I polimeri cationici a base di β-CD (ßCDPs) sintetizzati dalla condensazione di un monomero diammino-ciclodestrina con un comonomero diimidato sono in grado di formare poliplexi con acidi nucleici e le loro prestazioni di trasfezione dipendono dalla struttura ßCDP . Le policazioni contenenti β-CD sono particolarmente uniche perché le ciclodestrine contengono una cavità interna che può essere utilizzata per formare complessi di inclusione con parti idrofobiche. Ad esempio, β-CD si lega strettamente alla molecola idrofoba adamantina, e questo fornisce una comoda “maniglia” da cui funzionalizzare i poliplexes superficiali fatti da ßCDPs con PEG o targeting ligandi . Il laboratorio Davis ha tradotto questo concetto da benchtop a studi clinici . Questo vettore è stato la base per un rapporto che dimostra il primo esempio di RNAi umano utilizzando NPS polimerici mirati. Questo vettore era composto da ßCDPs funzionalizzato sia con PEG che con la transferrina del ligando mirata al cancro . Dopo questo punto di riferimento, lo studio clinico è stato concluso principalmente a causa di eventi tossici limitanti la dose senza studi di follow-on. Arrowhead Pharmaceuticals si è successivamente concentrato sui coniugati e non sono stati avviati studi clinici di fase III di follow-on.
Una varietà di altri nuovi, glicopolimeri cationici sintetici sono anche nella pipeline di sviluppo per applicazioni cliniche di consegna di acido nucleico . Il Reineke lab ha dato contributi chiave in questo settore (vedi recente recensione Rif. ), e una classe di esempio di glicopolicazioni sviluppate da questo gruppo sono la poli (glicoamidoamina)s (PGAAs) . Una libreria di PGAA è stata realizzata attraverso la reazione di condensazione tra comonomeri di carboidrati e oligoammine. Questi PGAA erano variati in base a una varietà di parametri, tra cui la dimensione dei carboidrati, il numero di idrossile e la stereochimica, il numero di ammine e la presenza o meno di gruppi eterociclici. Questi polimeri sono stati sottoposti a screening per la consegna genica e sono state identificate formulazioni ottimizzate che facilitano l’imballaggio efficiente del DNA e le proprietà di consegna intracellulare. Il gruppo Reineke ha anche cercato una varietà di polimeri a base di trealosio e risultati promettenti continuano a suggerire il potenziale di traducibilità clinica di questa classe di polimeri sicura ed efficiente . Questo glicopolimero è stato anche adattato per fornire un attivatore trascrizionale basato su CRISPR .
Gli esosomi sono vescicole extracellulari derivate dalle cellule contengono una varietà di tipi di acidi nucleici. Questi veicoli naturali partecipano alla comunicazione cellulare e vengono sempre più utilizzati nella somministrazione di farmaci e geni . Una sfida importante nell’utilizzo degli esosomi per la consegna genica è il caricamento dei veicoli con acidi nucleici. Mentre l’elettroporazione è il metodo più comune per caricare il DNA, la sonicazione, l’estrusione e i cicli di gelo-disgelo sono altri metodi per caricare gli esosomi . Il caricamento di siRNA esogeno o DNA rimane una sfida a causa della bassa efficienza e aggregazione durante l’elettroporazione. Per la medicina rigenerativa, gli esosomi derivati da cellule staminali o progenitrici possono incoraggiare la rigenerazione tissutale da soli senza DNA erogato in modo esogeno, compresa la rigenerazione muscolare , la guarigione delle ferite, l’angiogenesi e la riparazione della cartilagine .