Sequenziamento in tempo reale a singola molecola

La cella SMRT per un sequencer RS o RS II

Alla commercializzazione la lunghezza di lettura aveva una distribuzione normale con una media di circa 1100 basi. Un nuovo kit di chimica rilasciato all’inizio del 2012 ha aumentato la lunghezza di lettura del sequencer; un primo cliente della chimica ha citato lunghezze di lettura medie da 2500 a 2900 basi.

Il kit XL chemistry rilasciato alla fine del 2012 ha aumentato la lunghezza media di lettura a più di 4300 basi.

Il 21 agosto 2013, PacBio ha rilasciato il nuovo kit di legame della DNA polimerasi P4. Questo enzima P4 ha lunghezze di lettura medie di oltre 4.300 basi quando accoppiato con la chimica di sequenziamento C2 e più di 5.000 basi quando accoppiato con la chimica XL. L’accuratezza dell’enzima è simile a C2, raggiungendo QV50 tra copertura 30X e 40X. Gli attributi P4 risultanti fornivano assembly di qualità superiore utilizzando meno celle SMRT e con una chiamata variante migliorata. Una volta accoppiato con la selezione di dimensione del DNA dell’input (facendo uso di uno strumento dell’elettroforesi quale BluePippin) produce la lunghezza colta media oltre 7 kilobases.

Il 3 ottobre 2013, PacBio ha rilasciato una nuova combinazione di reagenti per PacBio RS II, la DNA polimerasi P5 con chimica C3 (P5-C3). Insieme, si estendono sequenziamento leggere lunghezze ad una media di circa 8.500 basi, con la più lunga legge superiore a 30.000 basi. Il throughput per cella SMRT è di circa 500 milioni di basi dimostrate dai risultati di sequenziamento della linea cellulare CHM1.

Il 15 ottobre 2014, PacBio ha annunciato il rilascio della nuova chimica P6-C4 per il sistema RS II, che rappresenta la 6a generazione di polimerasi e la 4a generazione di chimica, estende ulteriormente la lunghezza media di lettura a 10.000-15.000 basi, con le letture più lunghe superiori a 40.000 basi. Il throughput con la nuova chimica doveva essere compreso tra 500 milioni e 1 miliardo di basi per cella SMRT, a seconda del campione in sequenza. Questa è stata la versione finale di chemistry rilasciata per lo strumento RS.

Il throughput per esperimento per la tecnologia è sia influenzato dalla lunghezza di lettura delle molecole di DNA sequenziate sia dal multiplex totale di una cellula SMRT. Il prototipo della cellula SMRT conteneva circa 3000 fori ZMW che consentivano il sequenziamento del DNA parallelizzato. Al momento della commercializzazione, le celle SMRT erano ciascuna modellate con 150.000 fori ZMW che venivano letti in due serie di 75.000. Nell’aprile 2013, la società ha rilasciato una nuova versione del sequencer chiamato “PacBio RS II” che utilizza tutti i 150.000 fori ZMW contemporaneamente, raddoppiando il throughput per esperimento. La modalità di throughput più alta nel novembre 2013 ha utilizzato il binding P5, la chimica C3, la selezione delle dimensioni BluePippin e un PacBio RS II ha prodotto ufficialmente 350 milioni di basi per cellula SMRT, sebbene un set di dati umano de novo rilasciato con la chimica in media 500 milioni di basi per cellula SMRT. Il throughput varia in base al tipo di campione da sequenziare. Con l’introduzione della chimica P6-C4 il throughput tipico per cella SMRT è aumentato da 500 milioni di basi a 1 miliardo di basi.

SequelEdit

SMRT Cell per un Sequencer Sequel

Nel settembre 2015, la società ha annunciato il lancio di un nuovo strumento di sequenziamento, il sistema Sequel, che ha aumentato la capacità di 1 milione di fori ZMW.

Con lo strumento Sequel le lunghezze di lettura iniziali erano paragonabili alla RS, poi le versioni successive di chemistry aumentarono la lunghezza di lettura.

Il 23 gennaio 2017 è stata rilasciata la V2 chemistry. Ha aumentato le lunghezze di lettura medie tra 10.000 e 18.000 basi.

L ‘ 8 marzo 2018 è stata rilasciata la 2.1 chemistry. Ha aumentato la lunghezza media di lettura a 20.000 basi e la metà di tutte le letture superiori a 30.000 basi di lunghezza. Il rendimento per cella SMRT è aumentato a 10 o 20 miliardi di basi, rispettivamente per librerie a inserimento grande o a inserimento più breve (ad esempio amplicon).

Punta di pipetta in una cella SMRT da 8 m

Il 19 settembre 2018, la società ha annunciato il Sequel 6.0 chemistry con lunghezze di lettura medie aumentate a 100.000 basi per librerie di inserimento più brevi e 30.000 per librerie di inserimento più lunghe. La resa delle celle SMRT è aumentata fino a 50 miliardi di basi per librerie a inserimento più breve.

Sequel Performance

	V2	2.1	6.0
Media di lettura di lunghezza basi	da 10.000 a 18.000	20,000 – 30,000	da 30.000 a 100.000
velocità per SMRT Cella	5B – 8B	10B – 20B	20B – 50B

8M ChipEdit

Nel mese di aprile 2019 la società ha rilasciato un nuovo SMRT Cella con otto milioni di ZMWs, aumentando la velocità di trasmissione prevista per SMRT Cella da un fattore di otto. I clienti Early access a marzo 2019 hanno riportato un throughput superiore a 58 celle di gestione clienti di 250 GB di resa grezza per cella con modelli di circa 15 kb di lunghezza e 67,4 GB di resa per cella con modelli in molecole di peso superiore. Le prestazioni del sistema sono ora riportate in letture lunghe continue ad alto peso molecolare o in letture HiFi pre-corrette (note anche come Circular Consensus Sequence (CCS)). Per le letture ad alto peso molecolare, circa la metà di tutte le letture ha una lunghezza superiore a 50 kb.

Sequel II ad Alto Peso Molecolare Prestazioni

	Early Access	1.0	2.0
velocità per SMRT Cella	~Il 67,4 GB	Fino a 160 GB	Fino a 200 GB

L’HiFi prestazioni include corretto basi con una qualità al di sopra di Phred punteggio Q20, l’utilizzo ripetuto di ampliconi passa per la correzione. Questi prendono amplicons fino a 20kb di lunghezza.

Sequel II HiFi Corrected Read Performance

	Early Access	1.0	2.0
Raw reads per SMRT Cell	~250 GB	Up to 360 GB	Up to 500 GB
Corrected reads per SMRT Cell (>Q20)	~25 GB	Up to 36 GB	Up to 50 GB