DISCUSSIONE
i Nostri risultati mostrano che, da un’attenta pianificazione, la formazione, e la standardizzazione dei reagenti e protocolli, transnazionale laboratorio di rete ha la capacità di produrre coerenti e comparabili HAI i risultati del dosaggio. I cinque laboratori di sanità pubblica e accademici che hanno partecipato a questo studio facevano parte di PCIRN, che è stato sviluppato per aumentare la capacità nazionale del Canada di sostenere il vaccino e altre ricerche sull’influenza in caso di pandemia. In una situazione pandemica, con test influenzali ad alto volume, ad alta pressione e geograficamente dispersi, la standardizzazione del test HAI sarà di fondamentale importanza per garantire la comparabilità dei risultati tra i laboratori. I laboratori PCIRN hanno mostrato un elevato standard di riproducibilità all’interno del laboratorio, con una precisione del 99,8% dei duplicati (99.dal 2% al 100% per laboratorio), il 97,8% dei titoli entro un intervallo di 2 volte rispetto ai giorni di test ripetuti (dal 93,3% al 100% per laboratorio) e il 91,1% dei sieri di prova che mostrano la riproducibilità del titolo su ogni singola ripetizione del protocollo a sei test (dal 60% al 100% per laboratorio). Anche la riproducibilità interlaboratoria è stata elevata, con titoli mediani su tutte le repliche dei quattro laboratori non di riferimento entro 2 volte il laboratorio di riferimento per il 100% dei sieri testati. Su base per laboratorio, i titoli del 94,3% e 98.9% dei campioni quantificati in un’unica diluizione del laboratorio di riferimento e dei titoli di consenso, rispettivamente (intervalli da 85% a 100% e da 95% a 100%). Queste percentuali soddisfano le soglie tipiche di accettabilità per la variabilità del saggio HAI (cioè, almeno l ‘ 80% dei campioni è entro 1 diluizione dei valori nominali e/o GMT per tutti i saggi ). La specificità del saggio HAI (100%) e la sensibilità (da 87,5% a 100%) nei laboratori PCIRN erano ugualmente ben compresi nei criteri di accettazione degli studi precedenti (es., il 100% dei campioni negativi dovrebbe quantificare come sotto i livelli di quantificazione e almeno l ‘ 80% dei campioni positivi dovrebbe quantificare come positivo ).
Per la componente intralaboratoria della variabilità del saggio HAI, la ripetibilità all’interno dei laboratori PCIRN appare simile a quella mostrata in altri studi (5, 22). Un avvertimento di questi studi precedenti era che non sono state esaminate più di tre ripetizioni, nonostante le comuni pratiche di validazione del test immunitario di esaminare sei o più saggi ripetuti (24-27). Come tale, non è chiaro se i loro dati siano direttamente paragonabili ai risultati determinati su sei saggi in questo studio. Tuttavia, la nostra scoperta di 0% a 6.7% (mediana, 0%) di saggi con risultati che differiscono di oltre 2 volte da quelli di altre ripetizioni di saggi sembra paragonabile al 4.8% a 7.1% notato in precedenza in un laboratorio (22) e il 0% a 15% (mediana, 2%) in nove laboratori (5).
I nostri risultati di alta riproducibilità del titolo HAI tra laboratori PCIRN geograficamente dispersi contrastano con precedenti rapporti che mostrano una sostanziale variabilità tra laboratori internazionali che eseguono questo test (5, 6, 9-12). Ad esempio, i dati di un ampio studio collaborativo (11 laboratori) hanno rilevato GCV per campione che vanno dall ‘84% all’ 803% (GCV mediano per virus del 138%, 155% e 261% ). Altri studi hanno riportato GCV per i campioni H1N1 e H5N1 che si estendevano dal 95% al 345% (11) e dal 22% al 582% (6) e le GMT differivano tra i laboratori fino a 80 volte (11) o 128 volte (9). Mentre i rapporti precedenti spesso includevano un numero maggiore di laboratori partecipanti rispetto allo studio attuale, anche quando solo sei laboratori hanno fornito i dati, il GCV interlaboratorio mediano era dell ‘83% per cinque campioni H1N1, con l’ 80% di essi che superava una differenza di 4 volte tra i laboratori (11). Al contrario, l’attuale studio ha mostrato GCV mediani per virus solo del 39% e del 17%, con il 95% dei campioni entro una differenza di 4 volte tra i laboratori. Un campione ha superato la differenza di 4 volte; il titolo non era quantificabile per questo campione in un laboratorio, e quindi il valore più basso è stato assegnato piuttosto che misurato. Se tale campione fosse omesso dalle analisi, il GCV massimo sarebbe del 75,5%, il che rappresenterebbe un valore inferiore al GCV minimo in altri studi. Sebbene il campione abbia mostrato una variabilità più elevata rispetto ad altri, questo intervallo di misurazione basso è apparso in generale meno preciso rispetto agli intervalli più alti. Ad esempio, GCV variava dal 43,4% al 156,4% a titoli tra 10 e 80 rispetto all ‘ 11,1% al 53,1% a titoli più alti (Fig. 3). Una maggiore variabilità con campioni con titolo inferiore è stata anche precedentemente descritta (23) e probabilmente ha contribuito a classificazioni di sieroprotezione incongruenti nell’attuale studio per i tre campioni H1N1 con titoli più vicini alla soglia di 40 (titoli di consenso di 22, 24 e 43). Nonostante ciò, l’accuratezza diagnostica della sieroprotezione nei laboratori PCIRN è rimasta elevata nel complesso (93,6% quando sono stati utilizzati titoli di consenso per definire la sieroprotezione e 89,5% rispetto ai valori di laboratorio di riferimento).
Un elevato consenso dei titoli HAI interlaboratori nei laboratori PCIRN può riguardare l’attenta armonizzazione delle procedure di dosaggio HAI e dei reagenti in tutto il PCIRN. I partecipanti a studi precedenti che hanno mostrato un’elevata variabilità interlaboratoria hanno generalmente utilizzato metodi di analisi HAI che variavano tra i laboratori. Le variabili del test che si ritiene contribuiscano alla variabilità dei risultati includevano la quantità di virus aggiunto, il sistema di coltura virale (ad es., uova di gallina embrionate rispetto alla coltura tissutale), la durata del trattamento con RDE, la diluizione iniziale del siero, il tipo e l’età dei globuli rossi utilizzati e il tempo consentito per la sedimentazione degli eritrociti (5, 11, 12). Sorprendentemente, tuttavia, quando Wood et al. hanno fornito ai partecipanti commerciali e pubblici di laboratorio coinvolti nei test del vaccino influenzale stagionale in Europa una procedura operativa standard dettagliata da seguire e reagenti/materiali comuni, hanno riferito che la variazione interlaboratoria non è stata significativamente migliorata (10). Gli autori hanno ipotizzato che persistenti ” variazioni tecniche locali”, così come diversi fornitori di RBC, avrebbero potuto influenzare la riproducibilità tra laboratori, ma hanno notato che un’ulteriore standardizzazione era oltre i limiti di fattibilità per il loro studio. Pubblicazioni successive interpretarono questi risultati come indicanti che la standardizzazione del saggio HAI tra laboratori non è, in generale, un approccio fattibile per armonizzare i risultati HAI tra diversi laboratori (8, 12), e almeno un gruppo ha cercato di sviluppare un saggio HAI modificato e più robusto per generare dati più affidabili e riproducibili (22).
Nell’attuale studio, i laboratori PCIRN hanno aderito rigorosamente allo standard, pubblicamente disponibile World Health Organization Hai assay protocol, in cui i punti soggetti a variazioni tecniche o interpretative sono stati armonizzati tra i laboratori prima dell’inizio dello studio. I reagenti chiave (ad esempio, RDE, RBC, scorte di virus) sono stati ottenuti il più possibile dagli stessi fornitori. Inoltre, limitando il test a un singolo tecnologo in ogni sito di prova ha permesso una maggiore standardizzazione. Il possibile effetto dell’uso di più personale in ciascun laboratorio non è stato testato in questo studio. Mentre l’uso di più operatori potrebbe potenzialmente aumentare la variabilità, l’unico studio che ha esaminato questa possibilità per i test HAI non ha mostrato alcuna differenza significativa tra i risultati di due operatori nello stesso laboratorio (22).
Le variazioni potenziali tra i laboratori nei ceppi virali coltivati per l’uso nel test sono state ridotte al minimo tra i laboratori PCIRN utilizzando scorte di semi virali provenienti da un’unica fonte che sono state coltivate nella stessa linea cellulare in condizioni simili in tutti i laboratori. Ipotizziamo che la riproducibilità interlaboratoria potrebbe essere suscettibile di ulteriori miglioramenti se le scorte di lavoro virali fossero prodotte centralmente e distribuite ai laboratori partecipanti. L’importanza delle variazioni del ceppo virale per i titoli degli endpoint HAI è ben illustrata dai titoli da 2 a 3 volte inferiori dimostrati in uno studio quando il test HAI ha utilizzato un ceppo A/Cal pH1N1 rispetto al riassortente X179A che possedeva ancora emoagglutinine e neuraminidasi equivalenti (11). Sfortunatamente, le scorte non sono state sequenziate come parte di questo studio, e quindi non possiamo verificare che tutti i laboratori abbiano utilizzato virus con sequenze identiche di emoagglutinina. Anche se piccole variazioni di sequenza erano state introdotte dalla propagazione locale degli stock di virus, la variabilità tra i laboratori in questo studio era piccola, e quindi è difficile immaginare come l’uso di stock con sequenze HA identiche potesse ridurre ulteriormente la variabilità. Sebbene le differenze non superassero 2 volte in questo piccolo campione, piccole variazioni nella sequenza HA introdotte dalla propagazione locale degli stock virali potrebbero essere una possibile spiegazione per le tendenze alla sottostima dei titoli H1N1 e alla sovrastima dei titoli H3N2.
Vari studi hanno segnalato ridotta variabilità interlaboratorio a HAI titoli calibrando i risultati contro le norme internazionali (6, 11-13); tuttavia, tali norme non esistono per la corrente stagione di influenza B e dell’influenza H3N2 ceppi di virus, e la costante variazioni antigeniche di tensioni stagionali che in auto annuale riformulazione dei vaccini può richiedere il continuo sviluppo e la convalida di nuove norme. In questo studio, la comparabilità interlaboratoria appare superiore a quella ottenuta attraverso l’uso anche degli standard di calibrazione più efficaci. Ad esempio, dopo la calibrazione con IS 09/194, Wood et al. (11) ha riferito che le differenze massime tra GMT nei diversi laboratori sono diminuite da 80 a 64 volte (cioè, un valore ancora sensibilmente superiore al massimo 11 volte nello studio corrente) e che gli intervalli di GCV tra i laboratori sono diminuiti dal 95% al 345% (mediana, 105%) al 34% al 231% (mediana, 109%), cioè ben oltre l’intervallo compreso tra 0% e 156% (mediana, 27%) visto in questo studio. Allo stesso modo, l’uso della sostituzione È 10/202 diminuito il GCV tra i laboratori da un intervallo di 108% a 157% a un intervallo di 24% a 144% su cinque campioni e differenze massime tra i laboratori da 43 a 21 volte (13) e, utilizzando lo standard 07/150, Stephenson et al. (6) ridotto il GCV mediano di 15 campioni NIBRG-14 H5N1 clade 1 dal 125% (range, dal 31% al 582%) al 61% (dal 34% al 535%).
Mentre non è possibile accertare le ragioni esatte dell’elevato livello di accordo tra i laboratori PCIRN rispetto agli studi precedenti, il nostro successo è stato facilitato dall’incentivo che abbiamo avuto come rete nazionale a lavorare verso l’obiettivo comune di stabilire processi riproducibili. L’armonizzazione dettagliata e rigorosa dei processi e dei reagenti tra i siti è forse l’unico aspetto” nuovo ” che abbiamo portato a questo studio, rispetto al corpo di letteratura di lunga data che mostra una scarsa riproducibilità HAI tra i laboratori. Tuttavia, i nostri dati suggeriscono che con un’attenta standardizzazione, le variazioni interlaboratorie nei titoli HAI possono essere ridotte a livelli simili a quelli osservati all’interno di singoli laboratori. I potenziali prossimi passi per ridurre al minimo le variazioni dei titoli HAI nei laboratori di tutto il mondo sarebbero la mobilitazione di reti/consorzi, l’implementazione di linee guida e/o requisiti normativi per l’uso di procedure e reagenti standard, la formazione standardizzata per garantire la riproducibilità e la fornitura di supporto e/o incentivi per i laboratori ad abbracciare il concetto di “standardizzazione”.