Principal Investigator: Zuben E. Sauna, PhD
Office / Division / Lab: OTAT / DPPT / HB
Panoramica generale
Un problema importante con le terapie a base di proteine è la loro immunogenicità, cioè la loro tendenza a innescare una risposta immunitaria indesiderata contro se stessi. Una forma di risposta immunitaria è l’attivazione delle cellule B, che producono anticorpi che si legano alle proteine e riducono o eliminano i loro effetti terapeutici. Tali anticorpi possono anche causare complicazioni che possono essere pericolose per la vita. Pertanto, una parte critica della determinazione della sicurezza clinica e dell’efficacia dei prodotti terapeutici a base di proteine sta misurando la loro tendenza a innescare la formazione di anticorpi.
La risposta immunitaria alle terapie a base di proteine coinvolge anche le cellule T, che aiutano ad attivare le cellule B in modo da produrre anticorpi, compresi quelli che bloccano le terapie proteiche. Ciò accade se la proteina naturale prodotta dal corpo è difettosa in qualche modo. In tal caso, le cellule T rispondono a una proteina terapeutica normale e artificiale come se fosse estranea, poiché è diversa dalla proteina naturale difettosa. Una mancata corrispondenza di risposta delle cellule T come questa a volte si verifica nel caso della proteina FVIII, una proteina che è fondamentale per la capacità del corpo di formare coaguli di sangue per fermare il sanguinamento. Le persone che non hanno quantità sufficienti di FVIII, o il cui FVIII è difettoso in qualche modo, soffrono di emofilia A, una malattia in cui la coagulazione del sangue è difettosa e porta a sanguinamento eccessivo. Il problema del FVIII difettoso è basato geneticamente. Sebbene non esista una cura per l’emofilia A, l’infusione della proteina terapeutica FVIII è stata uno degli esempi di maggior successo di gestione di una malattia cronica. Sfortunatamente, lo sviluppo di anticorpi anti-farmaco contro il FVIII infuso è un ostacolo significativo a questa strategia. Il trattamento dei pazienti che sviluppano una risposta immunitaria è più complesso, meno efficace ed estremamente costoso. Ora sembra che le variazioni individuali nella tendenza allo sviluppo di anticorpi anti-farmaco possono anche essere basate su differenze genetiche. Ciò si riflette nell’osservazione clinica che le persone con emofilia A di discendenza afro-nera hanno il doppio delle probabilità rispetto ai pazienti di discendenza caucasica europea di produrre anticorpi contro le proteine del fattore VIII somministrate come terapia sostitutiva.
Una strategia per prevenire le discrepanze tra FVIII naturale e FVIII sostitutivo consiste nel progettare proteine FVIII geneticamente modificate in modo che non scatenino reazioni immunitarie. Ma ci sono così tante differenze tra i sistemi immunitari delle persone che non è probabile che i ricercatori saranno in grado di progettare una proteina FVIII che sia sicura per tutti loro. Pertanto proponiamo di adottare un approccio personalizzato per prevedere avoiding ed evitare responses le risposte immunitarie alle proteine FVIII. Il nostro obiettivo a lungo termine è quello di sviluppare un approccio basato sul gene per identificare gli individui il cui sistema immunitario è probabile che reagisca a versioni specifiche di proteine terapeutiche geneticamente modificate in modo che questi pazienti possano essere trattati con versioni di queste proteine che hanno meno probabilità di causare risposte immunitarie.
Stiamo anche affrontando il problema delle differenze nelle strutture tridimensionali di proteine-farmaci e proteine naturali che innescano le cellule B per produrre anticorpi contro le proteine terapeutiche. L’attuale metodo per prevedere se alcune parti di tali proteine innescheranno la formazione di anticorpi è impegnativo e costoso. Pertanto, stiamo usando piccoli pezzi di molecole simili al DNA chiamate aptamers per sondare le proteine e determinare le loro forme esatte. Gli aptameri sono costituiti da stringhe di molecole chiamate acidi nucleici che si piegano in forme specifiche che dipendono da quali acidi nucleici sono presenti e dall’ordine in cui si verificano nell’aptamero. Pertanto, identificando quale aptamer si lega strettamente a una parte specifica di una molecola, possiamo prevedere la forma di quella parte della molecola, un po ‘ come prevedere la forma di una serratura conoscendo la forma della chiave che si inserisce in essa.
Ora stiamo usando questa tecnica per determinare le forme sia del FVIII che della parte della tossina dell’antrace chiamata antigene protettivo. Se un aptamer perde la sua capacità di legarsi al FVIII, ad esempio, ciò indicherebbe che parte di questa proteina di coagulazione del sangue ha cambiato forma, aumentando la probabilità che inneschi una reazione immunitaria che riduce la sua attività terapeutica. Stiamo usando questo approccio per determinare se le proteine terapeutiche hanno forme che attiveranno la produzione di anticorpi. E stiamo collaborando con il Center for Drug Evaluation and Research per adattare questa tecnologia per analizzare nuovi prodotti proteici sviluppati come copie di farmaci proteici esistenti approvati (biosimilari) per garantire che siano sicuri ed efficaci.
Panoramica scientifica
1) Prevedere l’interazione degli epitopi delle cellule T con specifici antigeni MHC di classe II.
Il fattore VIII (FVIII) è un componente essenziale della cascata della coagulazione e gli individui carenti di fattori della coagulazione mostrano disturbi emorragici per tutta la vita. Lo sviluppo dell’immunogenicità contro le versioni terapeutiche (infuse) del FVIII è un ostacolo significativo al successo del trattamento degli emofiliaci.
Circa il 50% dei casi di emofilia A sono causati da un’inversione degli esoni del gene F 1-22, che si traduce nella produzione di un polipeptide che rappresenta quegli esoni, ma non 23-26. Tuttavia, c’è un gene nidificato all’interno del promotore F8 che traduce gli esoni 23-26. Tuttavia, l’inversione 1-22 significa che i peptidi sovrapposti generati da questa proteina non includono la giunzione tra 1-22 e 23-26. Mentre i peptidi del farmaco-proteina FVIII infusa che coprono questa giunzione sarebbero quindi estranei al sistema immunitario del paziente, non sono generalmente immunogenici. Piuttosto, immunogenicità, a causa delle differenze tra endogeno e infuso di FVIII è probabile che a causa di una serie di fatti, soprattutto i polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs), ma anche le mutazioni missenso e delezioni e mutazioni di assurdità, così come inversioni,
Pertanto, l’ideale (ma non probabile) soluzione per l’immunogenicità problema di infuso di FVIII sarebbe per la progettazione di FVIII sostituzioni che corrispondono di ogni paziente e HLA aplotipo tipo per evitare di innescare una risposta immunitaria. Mentre progettare tali biologici per soddisfare ogni paziente non è pratico, potrebbe essere possibile nei casi in cui ci sono differenze chiare e significative tra popolazioni specifiche (ad esempio, tra quelle di origine caucasica europea e africana nera). In tali casi sarebbe opportuno adattare i modelli di FVIII endogeno a ciascun gruppo per garantire che una popolazione non ottenga una quota sproporzionata dei benefici di una singola versione di FVIII mentre l’altra popolazione sopporti una quota sproporzionata dei rischi derivanti dallo stesso FVIII infuso.
La tecnologia attuale consente l’identificazione di sfondi aplotipici per il FVIII, nonché lo sviluppo di almeno una gamma limitata di farmaci personalizzati a base di fattore VIII. Pertanto, il nostro obiettivo a breve termine è determinare la 1) distribuzione quantitativa di diversi aplotipi (SNP) in individui di discendenza europea-caucasica e nero-africana; 2) distribuzione di antigeni MHC di classe II in queste popolazioni; 3) composizione del FVIII usato come farmaci; e 4) mutazione, delezione o inversione che causano malattie nel gene F8 (FVIII) di singoli pazienti. Useremo questi dati per predire l’immunogenicità dei singoli prodotti FVIII in diverse popolazioni e / o singoli pazienti.
2) Sviluppo di aptamers come strumento per lo studio degli epitopi conformazionali proteina-farmaco.
Gli aptameri, acidi nucleici in grado di formare conformazioni complesse, sono potenziali strumenti per mappare la conformazione proteica, l’identificazione e la previsione di siti immunogenici e per aggirare l’immunogenicità. Il nostro laboratorio sta sviluppando aptamers a DNA a filamento singolo per il fattore VIII umano ricombinante.
Abbiamo progettato una libreria di DNA ingenuo per generare aptamers utilizzando definito 5’ e 3’ regioni per PCR che fiancheggiano una regione randomizzato 60-base. La biblioteca del DNA naÃve è stata denaturata e i segmenti ssDNA sono stati autorizzati a piegare in forme uniche 3-dimensionali. (Le 60 basi casuali si tradurrebbero teoricamente in 460 conformatori unici.) Abbiamo incubato il pool di ssDNA piegati con FVIII e attraverso cicli iterativi SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment), siamo stati in grado di selezionare aptameri che legano le proteine.
Il nostro laboratorio ha selezionato un campionamento di singoli aptamers nei cicli 3, 5 e 8 e li ha clonati e sequenziati. Stiamo usando questi cloni per caratterizzare gli aptamers attraverso l’analisi della struttura 3-D prevista, delle proprietà di legame e dell’effetto sull’attività del FVIII. Inoltre, stiamo facendo in silico confronti di questi cloni per seguire l’evoluzione degli aptamers.
3) Uso di diverse tecniche analitiche per valutare le caratteristiche proteiche che possono correlare con l’immunogenicità.
In collaborazione con il Drs. Mansoor Khan e Rakhi Shah (Divisione di Qualità del prodotto, CDER) analizzeremo le interazioni degli eccipienti dei farmaci utilizzando metodi termici (calorimetria a scansione differenziale, microcalorimetria, analisi termogravimetrica), tecniche spettroscopiche (infrarosso a trasformata di Fourier, vicino all’infrarosso, Raman), cristallografia (diffrazione dei raggi X) e risonanza magnetica nucleare.
4) Caratterizzazione di anticorpi sensibili alla conformazione.
Un metodo alternativo allo studio degli epitopi conformazionali di proteine terapeuticamente importanti è quello di sviluppare e caratterizzare anticorpi sensibili ai cambiamenti conformazionali. In collaborazione con il Dr. Chava Kimchi-Sarfaty (CBER) abbiamo caratterizzato diversi anticorpi sensibili alla conformazione della metalloproteasi di zinco ADAMTS13, una proteina multi-dominio che scinde il fattore di von Willebrand ed è implicata nella porpora trombotica trombocitopenica. I nostri risultati suggeriscono che questi anticorpi potrebbero essere reagenti utili per distinguere ADAMTS funzionali e non FUNZIONALI13 e per analizzare le transizioni conformazionali durante il ciclo catalitico.
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