WNKs in Wnt/β-catenin signaling

I fattori di crescita Wnt segnalano attraverso la via canonica Wnt (Wg)-Frizzled (Fz)/β-catenin-dependent pathway o attraverso percorsi Wnt non canonici, come la via Wnt/Fz-planar cellular polarità (PCP). Questi 2 percorsi sono evolutivamente altamente conservati dagli invertebrati agli esseri umani. La segnalazione canonica di Wnt / β-catenin è essenziale per molti aspetti dello sviluppo. Nei vertebrati, controlla la specifica dell’asse dorsale–ventrale embrionale (D–V), la proliferazione cellulare, il mantenimento delle cellule staminali e la vascolarizzazione. La segnalazione canonica aberrante di Wnt causa i difetti di sviluppo nocivi e vari cancri.1,2 Pertanto, la regolazione precisa dei componenti canonici di segnalazione Wnt / β-catenina è cruciale per lo sviluppo e l’omeostasi tissutale.

Durante la segnalazione Wnt (canonica), un Wnt (Wingless, Wg in Drosophila) segnala a un recettore Frizzled (Fz) e ai co-recettori LRP5/6 (Arrow in Drosophila), che porta all’inibizione del complesso di degradazione composto dalla proteina di scaffolding Axin, dal gene adenomatous polyposis coli gene product (APC), e GSK3ß, e quindi consente alla β-catenina di entrare nel nucleo e attivare la trascrizione. Dopo l’attivazione della via Wnt, Dsh (Dvl nei vertebrati), una proteina di scaffold a valle di Fz, viene temporaneamente reclutata nella membrana e diventa iperfosforilata. Utilizzando la fosforilazione Dsh come lettura di segnalazione Wnt, abbiamo identificato l’omologo della chinasi Drosophila Wnk (senza lisina), come regolatore positivo della segnalazione Wnt.

Le chinasi Wnk sono note per il loro ruolo nella regolazione dei principali trasportatori di sodio (NCC, Na–Cl cotransporter; SLC12A) e di potassio (ROMK, canale midollare esterno renale K+) nel nefrone distale del rene. Le mutazioni in WNK1 e WNK4 causano la sindrome di Gordon (aka, ipertensione iperkalemica familiare o pseudoipoaldosteronismo di tipo II), caratterizzata da acidosi, iperkaliemia e ipertensione.3 Più recentemente WNK1 è stato collegato alla neuropatia sensoriale e autonoma ereditaria di tipo II (HSANII; ref. 4). Le funzioni di sviluppo di Wnks sono, tuttavia, solo emergenti.

Recentemente abbiamo dimostrato che Wnk è richiesto per i livelli di picco di segnalazione Wnt durante lo sviluppo dell’ala in Drosophila.5 L’esaurimento di Wnk da parte di RNAi o nel tessuto mutante omozigote ha portato a fenotipi canonici di segnalazione Wnt come il margine dell’ala e i difetti della setola del margine. Coerentemente, abbiamo anche stabilito che l’espressione dell’obiettivo Wnt diretto ad alta soglia senza senso è stata ridotta o persa nel tessuto privo di wnk. Inoltre, la riduzione dell’attività wnk sopprime la morte cellulare indotta dall’iperattivazione della segnalazione Wnt (cioè, sovraespressione Dsh guidata da sette) nell’occhio. Allo stesso modo, le setole dell’ala extra indotte dall’iperattivazione della segnalazione Wnt canonica nell’ala (tramite sovraespressione di dFz2 ) vengono soppresse riducendo l’attività wnk. Viceversa, la concomitante sovraespressione di dFz2 e Wnk ha portato ad un aumento significativo del numero di setole del margine ectopico.

Siamo stati in grado di identificare una funzione simile di Wnks in cellule umane coltivate. Il knockdown mediato da siRNA di WNK1 o WNK2 ha ridotto significativamente l’attività di un reporter di segnalazione Wnt TOPFlash e i livelli di β-catenina stabilizzata nelle cellule HEK293T. D’altra parte, la trasfezione di WNK2 ha stimolato l’attivazione di Wnt3a di TOPFlash in modo dipendente dall’attività della dose e della chinasi. Presi insieme agli esperimenti di Drosophila in vivo ed epistasis, questi risultati implicano che i WNKS svolgono un ruolo positivo conservato nella regolazione della segnalazione canonica Wnt / β-catenina.

In che modo Wnk influisce sulla segnalazione Wnt? I nostri dati di epistasi suggeriscono che Wnk agisce a valle del ligando Wg, ma a monte o a livello di Dsh. Nei mammiferi, i Wnk sono noti per fosforilare i canali ionici direttamente o tramite le chinasi intermedie SPAK e OSR1 (STE20 / SPS1-related prolina-alanina rich and oxidative stress responsive protein type 1 chinasi) al fine di regolare l’omeostasi degli ioni. In effetti, noi e altri abbiamo dimostrato che la Drosophila Wnk costituzionalmente attiva è in grado di fosforilare Fray, l’omologo Drosophila OSR1/SPAK, in vitro.5,6 Knockdown of fray, a sua volta, ha portato anche a una riduzione dell’espressione Sens e alla perdita di setole del margine dell’ala in vivo, suggerendo che Wnk possa esercitare la sua funzione regolatrice tramite Fray (Fig. 1). Questo effetto della mischia sulla segnalazione canonica sembra essere conservato negli esseri umani poiché il knockdown mediato da siRNA di SPAK e OSR1 ha anche ridotto l’attività del reporter Wnt nella coltura cellulare.5

Resta da determinare se Fray / OSR1 / SPAK può fosforilare direttamente i componenti della via Wnt o se la regolazione avviene tramite cambiamenti nel trasporto di ioni (Fig. 1). Sebbene i canali NKCC e KCC funzionino in modo neutro per la carica, è stato dimostrato che le pompe protoniche influenzano la segnalazione Wnt. In alternativa, Wnks hanno dimostrato di alterare la localizzazione di alcuni dei loro obiettivi. Ad esempio, è stato riportato che il traffico di NCC verso la membrana plasmatica è influenzato quando WNK4 lo devia per la degradazione lisosomiale.7 Sebbene questo processo non coinvolga SPAK e OSR1, non possiamo escludere che OSR1 / SPAK / Fray possa influenzare la stabilità o la localizzazione dei componenti di segnalazione Wnt.

Recentemente, Wnks hanno anche dimostrato di regolare la trascrizione dei geni bersaglio. Sia nello sviluppo neurale della mosca che del topo, Wnks, insieme a OSR1, regolano l’espressione del fattore di trascrizione LIM-Homeobox Arrowhead/Lhx86 (Fig. 1), mentre durante lo sviluppo della linea laterale zebrafish, Wnk1b reprime il trasportatore KCC2.8 Insieme, questi risultati sollevano domande interessanti sul ruolo delle chinasi Wnk durante lo sviluppo, e il lavoro futuro dovrà chiarire l’esatto meccanismo con cui Wnk modula la segnalazione Wnt e possibilmente altri percorsi.