筋芽細胞は、細長い形状を採用して、アクチンネットワークを拡散領域に分化させ、調節する
細胞の形状、アクチンネットワークおよび焦点癒着との関係を評価するために、フィブロネクチン(fn)の均質な層上にc2C12筋芽細胞を培養した。 培養２ ４時間後に、筋芽細胞を固定し、アクチンについて染色して、それらの形態学的パラメータを決定した（図１ ０Ａ）。 1A）。 ＦＮ被覆基板は、特定の膜貫通インテグリンを募集することにより、特定の細胞-基質相互作用の確立を可能にした。 実際、β1サブユニットと結合するいくつかのαインテグリンサブユニットは、骨格筋形成中に発現され、筋原性細胞の遊走、筋芽細胞の融合、筋線維の成熟または筋インテグリティの維持において重要である32,33。 ラミニン（LAM）コーティングされた基板上で行われた追加の実験は、両方の形態学的パラメータ（細胞形状指数、細胞周囲および細胞面積、補足図）が示された。 細胞−基質相互作用（焦点癒着の数および面積、補足図１Ａ）および細胞−基質相互作用（焦点癒着の数および面積、補足図１Ｂ）。 融合／分化プロセス中のＣ２Ｃ１ ２筋芽細胞の形態をｉｎ ｖｉｔｒｏで研究するためのＦＮ被覆を検証するために、ｆｎおよびＬＡＭについて統計的に類似していた。
筋芽細胞は、アクチンネットワークを拡散領域に分化させ、調節するために細長い形状を採用しています。 （Ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで種々の細胞形状指数（ＣＳ Ｉ）を示す典型的なＣ２Ｃ１ ２個々の筋芽細胞の色分けされたエピフルオロセンスイメージ。 細胞はアクチンのためにファロイジンで染色した。 スケールバーは20μ mです。 (B)CSI(R2=0.80)、(C)セル周囲(R2=0.97)、および(D)セル領域(R2=0.80)の形態素解析。図８ ２）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたＣ２Ｃ１ ２細胞が、平均面積２ ０ ５ ７±６ １ ８μ ｍ２および平均ＣＳ Ｉ０.３ ７±０.１ ５（Ｂ、ＣおよびＤについてｎ＝１ ０ １）を示したことを示している。 赤い曲線はガウス近似です。 （Ｅ）細胞領域の関数としてのアクチンの蛍光強度の線形進化（Ｒ２＝０． （F）細胞面積（R2=0.783、n=28）および（G）およびF-アクチンの強度（n=28）の関数としての全ビンクリン面積の進化。 （Ｈ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣ２Ｃ１ ２筋芽細胞の増殖（黄色）および分化（赤色）のタイムライン。 黒い矢印は、増殖培地を分化培地に置き換えることを示している。 （I、J）P0、P2における筋芽細胞のアスペクト比（増殖段階、P0での平均=0.40±0.16、両方でn=150）およびD2（分化段階、平均=0.24±0.07、n=100）。
我々は、細胞の伸長に関する情報を与えることによって筋芽細胞の形態を特徴とする細胞形状指数（CSI）を定量化した。 丸みを帯びたセルは1に近いCSIを持ち、細長いセルは0に近いCSIを持ちます。 私たちは、0.1から0.8の範囲のCSIを平均値0で発見しました。37±0.15(n=101)であり、細胞形態の大きな変動性を示唆している(図10B)。 1B）。 筋芽細胞は259±82μ mの平均周囲を示した（図。 図１Ｃ、ｎ＝１ ０ １）および広い範囲の拡散領域（〜１ ０ ０ ０〜〜４ ０ ０ ０μ ｍ２）であり、平均値は２ ０ ５ ７±６ １ ８μ ｍ２である（図１Ｃ、ｎ＝１ ０ １）。 1D、n=101）。 C2C12筋芽細胞で得られたこれらの知見は、一次ヒト筋芽細胞上で追加の形態学的測定（CSI、細胞周囲および細胞面積）を行うことによって強化された（16UBIC、 ＦＳＨＤの影響を受けていない患者の上腕二頭筋から生じる（すなわち、図２Ａ）。 4qaの削除を欠いていることが確認されている人）。 図に示すように。 2B-D、我々の結果は、16ubic筋芽細胞のCSIは0.14から0.86 0.44±0.17（n=90）の平均値であったことを示し、c2C12細胞のために観察されるように、ヒト筋芽細胞の 一緒に取られて、我々の結果は、細胞形態の変動は、細胞型または細胞培養物の任意のアーティファクトに依存しないことを示しています。
我々は次に、可変性の広がり領域がアクチン細胞骨格を調節できるかどうかを理解するために、C2C12筋芽細胞の集団におけるアクチンフィラメ その結果、F-アクチンネットワークの全蛍光強度は細胞領域と直線的に関連していることがわかりました（図1）。 1E、n=31、R2=0.748）、筋芽細胞の広がりが大きいほど、より多くのアクチンフィラメントが形成されることを示唆している。 図に示すように。 3、我々は次の細胞形状の変化がC2C12筋芽細胞における細胞-基質相互作用にどのように影響するかを決定するためにビンクリン含有癒着の分布 我々は、細胞あたりの細胞-基質癒着の総面積が細胞面積とともに増加することを見出した（図10）。 ７ ８ ３）およびＦ−アクチンの蛍光強度を有する（図１Ｆ、ｎ＝３ １、Ｒ２＝０． 1G）。 我々の結果は、C2C12筋芽細胞は、細胞の形状と広がり領域の様々な仮定が、順番にそれらの広がりにアクチンフィラメントとビンクリン癒着の量の両方を適応させることを示しています。 筋芽細胞分化のための細胞形状の役割に関するより多くの洞察を得るために、本発明者らは、次に、増殖（６時間でのＰ０および４ ８時間でのＰ２）および分化（９ ６時間でのＤ２）段階の間の細胞アスペクト比の進化を考察する（図１ ０Ａ）。 1時間）。 図に示すように。 1I、Jは、我々の知見は、筋芽細胞が大幅に伸長し、分化するために1：4のアスペクト比を採用することを示唆し、筋芽細胞は0.40±0.16（P0）から0.36±0.09（P2）と0.24±0.07（D2）にそのアスペクト比を増加させたことを示している。 さらに、我々の結果は、アクチンストレス繊維がD2で高度に配向していたことを示した（補足図。 また、有意な核伸長にも対応する（補足図４Ａ、Ｂ）。 4C）。 一緒に取られて、我々の調査結果は、Fアクチンネットワークは筋芽細胞の形態の変更によって変調され、筋芽細胞の分化は1:4のアスペクト比まで細胞の伸長を必要とすることを示していることを示しています。
アクチンネットワークと核の空間組織は、筋芽細胞の形態によって指示されています
我々は、その拡散領域を標準化し、その形状を制御するために、接着剤マイクロパターンを使用することにより、筋芽細胞の形態の本質的な変動を制御しました。 マイクロコンタクト印刷technique20を使用して、我々は1600μ m2の一定面積と異なる形状を持つフィブロネクチン（FN）の接着剤マイクロパターンを作成しました。 四捨五入（CSI=1）、二乗（CSI=0.79）、三角（CSI=0.60）、および長方形の異なるアスペクト比（1：4および1の場合はCSI=0.50および0.34）を使用しました:個々の筋芽細胞を培養するためのFNマイクロパターン（それぞれ図7のアスペクト比）。 2A）。 マイクロパターンのこれらの異なった幾何学は広い範囲上のmyoblast形をin vitroで標準化し、広がり区域を制御することを可能にした。
アクチンネットワークと核の空間組織は、筋芽細胞の形態によって指示されます。 （A）1600μ m2のフィブロネクチン（FN）マイクロパターン上で成長し、F-アクチン（緑）、核（青）およびビンクリン（赤）の免疫染色されたC2C12細胞のEpifluorescence画像。 円形、正方形、三角形および長方形（アスペクト比1：4および1：7）のマイクロパターンは、それぞれCSI=1、0.79、0.60、0.50および0.34に対応する。 スケールバーは20μ mです。 (B)その向きに応じて色分けされているマイクロパターンc2C12細胞におけるアクチンフィラメントの空間組織の典型的な例。 スケールバーは20μ mです。 （Ｃ）円形（黒でｎ＝１ ２）、二乗（赤でｎ＝１ １）、三角形（青でｎ＝１ ９）、および１：４（緑でｎ＝１ ８）または１：７（ピンクでｎ＝１ １）の長方形の微小パターン化筋芽細胞におけるアク （Ｄ）核アスペクト比および（Ｅ）筋芽細胞の異なる幾何学的形状に対する核配向の進化（各ＣＳＩについて１ ０≦ｎ≦１ ５）。
アクチン細胞骨格の空間組織上の細胞ジオメトリの役割を定量的に決定するために、我々は各細胞shape34、35のアクチンフィラメント Phalloidinで染色されたアクチンフィラメントは、アクチンフィラメントが水平軸に平行（0°）に組織されたときの水色から、水平軸に垂直に組織されたものには赤（+90°）またはオレンジ（-90°）の範囲の色勾配で、その向きの関数として色分けされた（図）。 2B）。 我々は、丸みを帯びた細胞のアクチンフィラメントが-90°から+90°の範囲の向きで、ランダムに分布していたことを観察した。 角化細胞は三つの主要な角ドメインで組織されたアクチンフィラメントを示した: 0°から25°、50°から90°および-50°から-90°、三角形の細胞は、主に0°、60°および-60°でパターンの三辺に従って組織されたアクチンフィラメントを示 興味深いことに、我々はアクチンフィラメントが非常に長いセル軸（0°）1：4（CSI=0.50）と1：7（CSI=0.34）アスペクト比の長方形のセルのために平行に配向していた ビンクリン含有癒着の定量化は、細胞形態間の癒着領域の統計的差異を示さなかった（補足図）。 一方、焦点癒着の配向は細胞形状によって調節された（補足図５Ａ〜Ｃ）。 5D,E)、アクチンフィラメントについて観察されるように。 我々の知見は、1:4と1:7の長方形の筋芽細胞の両方がアクチン細胞骨格のより強い組織を可能にすることを示している（図。 このことは、筋芽細胞の伸長が収縮性双極子の形成をもたらすことを示唆している。
筋管における筋芽細胞の分化における細胞核の役割を考慮して、次に、細胞形状および細胞骨格構造の変化が核の形状および配向を調節できるかどうかを調べた36。 我々は、核アスペクト比がCSIの低下とともに有意に増加することを見出した（図。 2D）。 確かに、円形のマイクロパターン上の丸みを帯びた細胞（CSI=1）は、1.11±0.06の平均アスペクト比によって特徴付けられる丸い核を示したが、1:4（CSI=0.50）と1:7（CSI=0.34）のアスペクト比を持つ長方形の細胞は、それぞれ1.39±0.21と2.19±0.23のアスペクト比を持つ大きな核変形を示した。 我々はまた、核の配向が細胞形態によって調節されることに気づいた（Fig. 2E）。 我々は、丸みを帯びた、二乗および三角形の細胞における核の向きは、水平軸に対して-40°（円形、n=11）、-33°（正方形、n=14）および-43°（三角形、n=10）の平均向きで、-15°から-60°までの広い範囲の角度にまたがっていることを発見した。 長方形の細胞のために、我々の結果は、核が-14°（1：4、n=15）と-2°（1：7、n=10）の平均角度で細胞軸に平行に配向していたことを示した。
細胞伸長は筋芽細胞の収縮性を高める
我々が対処した次の質問は、細胞形状の変化が筋芽細胞の収縮性にどのように影響するかでした。 この質問に答えるために、我々は、マイクロパターン筋芽細胞によって発揮される牽引応力を決定するために牽引力顕微鏡（TFM）を使用しました。 図に示すように。 3A我々は、最大のストレスが関係なく、細胞の形状、マイクロパターン筋芽細胞の四肢に発揮されたことを観察した。 他の細胞タイプ37で以前に観察されたように、収縮ストレスは、微小パターン化された筋芽細胞の角（正方形および三角形）または両肢（1：4および1：7の長方形）に優先的に蓄積された。 我々は、細胞形態が細胞収縮性を調節するかどうかを決定するために、個々のマイクロパターン筋芽細胞によって及ぼされる総ストレスを定量化した。 図に示すように。 図3Bに示すように、丸みを帯びたセル（CSI=1）は170.7±46.4N/m2の総応力を発揮し、長方形のセル（CSI=0.34、アスペクト比1：7）はより大きな総応力（295.9±156。8N/m2)、細長いセル形状が増加した牽引応力につながることを示唆しています。 さらに、我々は、長方形のセル（CSI=0.34、アスペクト比1：7）が大きな最大応力値（684.3±257.8Pa、図を示したことがわかった。 3C）、丸みを帯びた筋芽細胞は最低の最大応力値（351.5±123.6Pa）を示した。 収縮応力が細胞周辺に作用し、CSIを低下させると牽引応力が増加することを考慮して、質量中心から細胞の先端までの距離の関数として最大応力値をプロットした（図）。 は、２ ２.６μ ｍ（ＣＳＩ＝１）、２ ８.２ ８μ ｍ（ＣＳＩ＝０.７ ９）、３ ３.９ ８μ ｍ（ＣＳＩ＝０.６ ０）、４ １.２ ３μ ｍ（ＣＳＩ＝０.５ ０）、５ ３.４ ５μ ｍ（ＣＳＩ＝０.３ ４）を表す。 図に示すように。 3D、我々は最大収縮応力は、筋芽細胞の細長い形態がより多くのトラクション力を発揮することを示唆し、細胞（R2=0.958、n=65）の重心からの距離と直線的
筋芽細胞における収縮力の確立におけるアクトミオシンネットワークの寄与を決定するために、C2C12細胞をG-アクチン隔離薬Latrunculin B（LatB）およびミオシンII阻害剤Blebbistatin（Bleb）で処理した。 ファロイジンを用いた免疫染色された筋芽細胞は、LatBおよびBleb処理細胞がびまん性アクチンネットワークを示すことを示した（Fig. 3E）、両方の薬物がF-アクチンの組織に有意に影響を与えたことを実証する。 我々は、異なる幾何学的形状の筋芽細胞における収縮力の確立におけるアクトミオシンネットワークの役割を決定するために、両方の薬物で処理された Ｌａｔｂ処理は細胞伸長とともに増加した収縮性の有意な損失を誘発したことを示した。 実際に、丸みを帯びた細胞は〜62％の収縮応力の損失を示したが、LatBで処理した1：4および1：7の長方形の細胞は、それぞれ〜88％および〜86％の収縮応力の損失によ 3階）。 さらに、1の収縮応力が:Blebで処理された4つの長方形の細胞は、ミオシンII分子モーターが筋芽細胞収縮力の重要なプレーヤーであることを示す、収縮力の-80％の損失によって特徴付けら
まとめると、これらの結果は、平行なアクトミオシン繊維の密なネットワークの確立を介して細長い筋芽細胞でアクトミオシンネットワークの収縮性が増強されることを示している。
細胞対の収縮性は、それらの融合後に増加し、細長いマイクロパターン上で上昇
筋芽細胞の形態が筋管の収縮特性にどのように影響するかを理解するために、我々は二つの筋芽細胞の最小モデルを検討する。 我々はまず、様々な形状のマイクロパターンにめっきされたP1（増殖培地中の24時間）で細胞二重項によって及ぼされる牽引力を決定した（補足図。 6A）。 ＣＳＩの広い範囲の間に収縮応力の統計的差はなかった（補足図。 る（図６Ｂ）。 および核（補足図６Ｃ）を提供する。 6D,E)1:4および1:7の長方形のマイクロパターン。 この観察に基づいて、本発明者らは、次に、５日間の追加の間に、円形（ＣＳＩ＝１）および長方形（ＣＳＩ＝０． 1H)分化培地中で。 本発明者らは、生きたミトコンドリア染色であるＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ Ｃｍｘｒｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、筋芽細胞の二重項が融合されたことを確実にした（図１ ０Ａ）。 4A)38. 図に示すように。 4B、C、我々は総収縮応力がわずかに円形のマイクロパターン（267±64Pa）に成長した融合細胞の二重項で増加したことがわかった円形の未融合細胞の二重項（157±37Pa）と比較して、融合細長い二重項が二倍以上の収縮（543±193Pa）であったのに対し、未融合細長い二重項（211±73Pa）。 これらの結果は，細胞融合後に細胞収縮性が増加し，伸長形態に対して有意に増強されたことを示している。
細胞対の収縮性は、それらの融合後に増加し、細長いマイクロパターン上で上昇した。 (A)c2C12細胞ペアunfused(D)と融合(FD)円形と長方形(1:7アスペクト比)FNマイクロパターンと水戸トラッカーとミトコンドリアの染色のEpifluorescence画像。 スケールバーは20μ mです。 (B)円形および長方形のFNマイクロパターン上に融合したC2C12細胞対によって発揮される収縮応力の代表的なマップ。 (C)円形(灰色)および長方形(紫色)FNマイクロパターン上の融合されていない(D)、(プレーンバー)および融合された(FD、ハッシュバー)C2C12セルペアの総応力の進化。 円D:n=8;円FD:n=5;長方形D:n=6および長方形FD:n=8。 **p<0.01。
アクトミオシン収縮は筋管分化を促進する
我々は、筋芽細胞のアクトミオシン収縮が筋管分化に影響を与えるかどうかを尋ねた。 Ｃ２Ｃ１ ２筋芽細胞を、ｆｎ被覆基質上で増殖培地中で２日間培養した（Ｐ２、図２Ｂ）。 1H)細胞合流に達するため。 その後、ＬａｔｂまたはＢｌｅｂのいずれかを３ ０分間添加し、増殖培地を分化培養培地に置換した。 分化培地中で4日後（D4、図。 1H)、C2C12細胞を固定し、DNAおよび分化のマーカーであるTroponinTについて染色した(Fig. 5). 我々は、コントロール筋管（CTRL）とラトルンクリンB（+LatB）とブレビスタチン（+Bleb）で処理した筋管にアルファアクチニンを染色することにより、LatBとBleb治療の効果を評価した。 補足図に観察されるように。 7、コントロール筋管は、典型的な横紋Zバンドパターンを提示し、LatBおよびBleb治療は筋管の線条パターンを乱す。 対照筋管（CTRL）は、7.99±3.38の平均アスペクト比によって特徴付けられた（図。 ６％の陽性トロポニンｔ面積（図５Ａ）および５ １． 5B）。 我々の調査結果は、LatBとBleb治療は、それぞれ44.9±5.2％と44.4±5.1％にトロポニンt領域の割合を減少させたことを示しています。 さらに、本発明者らは、融合指数が、対照細胞（３ ８±５％）よりも、Ｌａｔｂ（２ ７±３％）およびＢｌｅｂｂ処理細胞（２ ９±３％）の方が統計的に低く、筋芽細胞分化におけるアクトミオシン収縮 5C）。 これらの結果から，筋芽細胞のアクトミオシン収縮性が筋管分化を促進することが示唆された。
アクトミオシン収縮性は筋管分化を促進する。 （Ａ）分化培地における４日後の筋管アスペクト比の分布（ｎ＝１ １ ４、Ｒ２＝０． （Ｂ）トロポニンＴについての陽性面積の割合、および（Ｃ）対照細胞（ＣＴＲ）、ＬａｔｂおよびＢｌｅｂ処理細胞における融合指数の進化（それぞれについてｎ＝２ ０）。 （Ｄ）分化培地中で４日後に形成された対照筋管（Ｃｔｒ）、ＬａｔｂおよびＢｌｅｂ処理筋管の典型的なエピフルオロセンスイメージ。 ＤＮＡ（青）とトロポニンＴ（赤）について筋管を免疫染色した。 スケールバーは100μ mです。 *p<0.05,**p<0.01およびn.s.有意ではありません。
筋芽細胞の伸長は、筋芽細胞の筋管への分化に不可欠であるYAP核輸出を誘発する
筋芽細胞の分化を制御する細胞内機….. この目的のために、本発明者らは、微小パターン化された筋芽細胞における細胞質／核YAP比を定量した（図10B）。 および補足図６ａおよび補足図６ｂ。 8). 細胞伸長1:4および1:7の長方形のマイクロパターンは、細胞質/核YAP比を増加させた（図。 6B)は、細胞の伸長がアクトミオシンネットワークによって加えられる核圧縮力を介してYAP核輸出をトリガーすることを示唆している40。 細胞質または核のいずれかにおけるYAPの局在化が分化プロセスの特定の段階に関連しているかどうかを確認するために、本発明者らは、増殖ステッ 図６ｃおよび補足図６ｃおよび補足図６ｃ。 9). 興味深いことに、我々の結果は、細胞質/核YAP比がP1で0.37±0.07からP2で0.68±0.06に増加し、D2で0.67±0.06に増加し、次いでD9で0.42±0.10に減少 6D）。 興味深いことに、D9での細胞質/核YAP比は、分化した筋管における細胞質/核YAP比が筋芽細胞のそれに類似していることを示唆し、P1値と統計的に異なら これらの結果を検証するために、我々は増殖段階P1（24h）と分化段階D2（96h）で筋芽細胞を収穫し、我々はそれらの細胞質および核物質を単離した。 ビシンコニン酸（BCA）蛋白質アッセイを行い、細胞質および核抽出に含まれる蛋白質を電気泳動によって分析した（図。 6E）。 我々のウェスタンブロット所見は、細胞質/核YAP比がP1で0.62±0.08からD2で0.87±0.24に増加したことを示した（図10B）。 6階）。 YAPのこの生化学的定量化は、C2C12細胞を分化させる上で重要なYAP核輸出を示し、我々の調査結果を強化します。
筋芽細胞の伸長は、筋芽細胞の筋管への分化に不可欠であるYAP核輸出を誘発する。 （Ａ）１ ６ ０ ０μ ｍ２のＦＮマイクロパターン上で増殖させ、ＹＡＰについて免疫染色したＣ２Ｃ１ ２細胞のエピフルオロセンスイメージ。 スケールバーは20μ mです。 （Ｂ）異なる筋芽細胞形態についての細胞質対核ＹＡＰ比（それぞれについてｎ＝１ ０）。 （Ｃ）増殖期の１日目（Ｐ１、２ ４時間）および分化期の２日目（Ｄ２、９ ６時間）および９日目（Ｄ９、２ ６ ４時間）にＹＡＰについて免疫染色された合流性Ｃ２Ｃ１ ２細胞の蛍光画像。 スケールバーは100μ mです。 （Ｄ）Ｐ１（ｎ＝５ ０）、Ｐ２（ｎ＝３ ０）、Ｄ２（ｎ＝３ ０）およびＤ９（ｎ＝３ ０）における細胞質対核ＹＡＰ比。 （Ｅ）Ｃ２Ｃ１ ２増殖および分化におけるＹＡＰ（６ ５ｋＤａ）発現のウェスタンブロット分析。 (F)細胞質から核へのYAP比(平均±S.D.）増殖および分化中（3は、20.106細胞/複製を有する各条件について複製する）。 （Ｇ）Ｄ２での細胞質対核ＹＡＰ比、および（Ｈ）ｄ４での対照（ＣＴＲ）およびレプトマイシン（ＬＭＢ）処理細胞の融合指数。 **p<0.01,****p<0.0001およびn.sは重要ではありません。これらの結果に基づいて、我々は直接exportin141に結合することにより、核からのアクティブな輸出をブロックするレプトマイシンBを使用してYAPの役割を評価 実際、Alberto Elosegui-Artolaらは最近、レプトマイシンB(lmb)が細胞骨格によって働く収縮力がYAP核移動をどのように駆動するかを研究するために効率的に使用できることを示している39。 Ｐ２（４ ８時間）のＣ２Ｃ１ ２筋芽細胞をＬＭＢで処理することにより、本発明者らは、細胞質対核ＹＡＰ比が、Ｄ２（９ ６時間）のＬＭＢ処理細胞で有意に低いことを見出した。 6G）、核輸出が阻害された場合、YAPは主に核内に集中していることを示唆している。 加えて、本発明者らの知見は、ＬＭＢ処理細胞のＤ４での融合指数が示された（図１ ０Ａ）。 6H)は非常に低かった(3.8±1.5％）対照細胞（42.4±9.1％）と比較して、活性核輸出がC2C12分化のために必要であることを実証する。