- 要約
- 1. はじめに
- 2. 材料および方法
- 2.1. 動物
- 2.2. 細胞培養
- 免疫蛍光染色アッセイ
- ウェスタンブロット
- 定量的（リアルタイム）ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムPCR）
- 2.6. ０ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して統計的試験を行った。＜／ｈ５＞＜ｐ＞統計的試験は、ＰＲＩＳＭ ｖ７． ２群間の比較はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて行った。 種々の群間の比較は、Ｔｕｋｅｙのｐｏｓｔｔｅｓｔを伴う一方向Ａ ＮＯＶＡを用いて行った。 全ての値を平均±ＳＤとして示した。 P<0.05の値は統計的に有意であると考えられました。 3. 結果 3.1. 異なる脳領域におけるNDRG2、GFAP、およびS100Βによって標識されたアストロサイトの分布
- 3.2. 異なる脳領域におけるNDRG2、GFAP、およびS100Βによって標識されたアストロサイトの形態
- 異なる脳領域におけるNDRG2、GFAP、およびS100Βタンパク質の発現
- 4. 議論
- データの可用性
- Disclosure
- 利益相反
- 著者の貢献
- 謝辞
- 補足資料
要約
アストロサイトは、それらが発見された脳領域に応じて異なる形態学的特性を有する。 しかし、現在の星状細胞マーカーのいずれも、すべての亜集団に正常にラベルを付けることはできません。 したがって、特定の科学的調査のための適切なマーカーを特定することは重要です。 ここでは、3つのアストロサイトマーカーの分布とタンパク質発現を比較しました: 大脳皮質、海馬、および視床におけるNDRG2、GFAP、およびS100Β。 NDRG2とS100Β陽性アストロサイトは、全体の大脳全体でGFAP陽性アストロサイトよりも均一に分布していた。 GFAP免疫反応性は海馬で最強だったが、NDRG2とS100Β免疫反応性は、背側皮質と視床で最強だった。 また、成体マウスにおけるNDRG2、GFAP、およびS100Βのタンパク質発現レベルは、それぞれ、皮質、海馬、および視床で最も高かった。 我々はまた、アストロサイトの形態を検出し、脳梁と脳花柄で、GFAP陽性アストロサイトはNDRG2とS100Γ陽性アストロサイトよりも多くの長いプロセスで見 これらの結果は、NDRG2およびS100Βが、皮質および視床における星状細胞の数の全体的な分布および変化を視覚化するために、ならびに星状細胞のラベ しかし、gfapは、脳梁、大脳脚、および海馬の星状細胞を標識するためにより適切に使用される。 これらの結果は、適切なアストロサイトマーカーの選択の研究者を導くのに役立ち、それらが発見された組織に基づいてアストロサイトの免疫学的性質
1. はじめに
アストロサイトは、長い間、ニューロンに栄養、代謝、および構造的サポートのみを提供する補助細胞と考えられてきました。 しかし、近年、広範な研究は、それらが脳の生理学的および病理学的機能において重要な役割を果たすことを示している。 アストロサイトはイオン恒常性および血大脳の障壁の維持で、シナプスの形成および取り外し、また大脳の血の流れを制御し、神経伝達物質のリサイ 重要なのは、アストロサイトは、異なる脳領域における形態学的、集団、および機能的多様性を有する。 したがって、アストロサイトの多型および複数のサブグループのための最も適切なマーカーを同定することは、アストロサイト多機能の研究に重要です。
グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）は、最も一般的に使用される星状細胞マーカーであるが、細胞骨格を構成する主要な中間フィラメントとして、GFAPは、総星状細胞容積の約15％しか免疫標識しておらず、星状細胞の40％以上が成体ラット海馬でGFAP陰性であることが判明した。 さらに、GFAPは不完全に原形質ヒトアストロサイトを標識し、線維性アストロサイトの開発の後半に発現していた。
別の一般的に使用される星状細胞マーカーは、細胞質に豊富なCa2+結合ペプチドであるS100Β、および細胞周期調節および細胞骨格修飾に関与する星状細胞の核である。 しかし、S100Βは、成熟したオリゴデンドロサイトの亜集団、脈絡叢上皮細胞、およびいくつかのニューロンにおいても発現される。 アストロサイトの標識におけるGFAPおよびS100Βの欠陥は、アストロサイトの機能を探索する際に不正確または間違いにつながる可能性があります。
N-Myc下流調節遺伝子2（NDRG2）は、PCRベースの減算ハイブリダイゼーション法によって正常なヒト脳cDNAライブラリーで最初に発見されました。 これは、細胞増殖および分化に関連する腫瘍抑制因子および細胞ストレス関連遺伝子である。 NDRG2は、大脳皮質、嗅球、中脳、海馬、および視床で広く発現されている。 最も重要なのは、NDRG2は脳の星状細胞で特異的に発現されることである。 したがって、NDRG2は、特に成熟した、非反応性、および非増殖性アストロサイトのための新規アストロサイトマーカーとみなされています。 しかし、NDRG2が星球マーカーとしてGFAPとS100Βよりも信頼性が高いかどうか、ならびに異なる脳領域におけるそれらの分布と発現の違いは報告されてい
現在の研究では、分布、タンパク質発現、およびマウスの全体の大脳全体の星球マーカー NDRG2、GFAP、およびS100Βの相互共局在を比較しました。 我々は、異なる脳領域におけるアストロサイトのための最も適したマーカーを同定することを目的とした。
2. 材料および方法
2.1. 動物
若い、大人、および古いC57BL/6雄マウス1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、および12ヶ月は、中央南大学の実験動物センターから得られました。 動物は自由に食べ、飲み、25±1℃の温度に保ち、動物の概日リズムをシミュレートするために12:12-hの明暗円で収容した。 すべての努力は、動物の苦しみを最小限に抑え、使用される動物の数を減らすために行われました。 すべての動物実験手順は、Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｃｈｉｎａの動物実験のための倫理委員会によって承認されたプロトコルに従った。
2.2. 細胞培養
HT22細胞（神経細胞株）およびMA1800-57細胞（アストロサイト細胞株）を、10％ウシ胎児血清（FBS、Gibco）、50U/mLペニシリン、および50μ g/mLストレプトマイシン ＯＬＮ−９ ３細胞（オリゴデンドログリア細胞株）を、１ ０％ＦＢＳ、２ｍ Ｍグルタミン、５ ０Ｕ／ｍＬペニシリン、および５ ０μ ｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中に保持した。 細胞は全て、９ ５％の大気空気と５％のＣＯ２の混合物中で３ ７℃に維持した。 HT22細胞、OLN-93細胞、およびMA1800-57細胞をスライド上に播種し、それぞれ微小管関連タンパク質2（MAP2）、α-チューブリン、およびGFAPに対する抗体で染色した。2.3.
免疫蛍光染色アッセイ
マウスをペントバルビタールナトリウム（50mg/kg）で麻酔した後、その大脳を抽出し、0.9％の冷ヘパリン化生理食塩水と4％のパラホルムアルデヒドで固定した。 Postfixationの後で、大脳は20%のスクロースおよび30%のスクロースの解決で引き続いて脱水されました。 １ ０μ ｍの厚さの切片を、Ｌｅｉｃａ ＣＭ１ ９ ０ ０冷凍スライサーを用いて調製した。 脳切片を1％H2O2中で15分間インキュベートし、0.3％Triton X-100中で15分間インキュベートし、各処置の間にpbs穿刺後に3回洗浄した。 次いで、切片を、５％正常ヤギ血清中で室温で１時間遮断し、以下のように一次抗体を加湿ボックス中で４℃で一晩インキュベートした：マウス抗ＧＦＡＰ抗体（＃３ ６ ７ ０、１：５ ０ ０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；ウサギ抗ＮＤＲＧ２抗体（＃５ ６ ６ ７、１：２ ０ ０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；マウス抗Ｎｄｒｇ２抗体（＃Ｄ Ａ２ ８ １−６Ａ５、１：１ ０ ０、Ｓｉｇｍａ）；ウサギ抗Ｓ１ ０ ０Β抗体（＃Ｄ Ａ２ ８ １−６Ａ５、１：１ ０ ０、Ｓｉｇｍａ）；ウサギ抗Ｓ１ ０ ０Β抗体（＃Ｄ Ａ２ ８ １−６Ａ５、１：１ ０ ０、Ｓｉｇｍａ）；ウサギ抗Ｓ１ ０ ０Β抗体（＃Ｄ Ａ２ ８ １−６Ａ５、１：１ ０ ０、Ｓｉｇｍａ）；ウサギ抗Ｓ１ ０ ０Β抗体（＃2017-1,1:500,epitomics);マウス抗グルタミン合成酵素(gs)抗体(#mab302,1:200,millipore);ウサギ抗map2抗体(#Ab32454,1:500,abcam);およびマウス抗α-チューブリン抗体(#T6199,1:500、シグマ）。 次いで、切片を、Ａｌｅｘａ−４ ８ ８（緑色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＡｌｅｘａ−６ ４ ７（赤色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）結合ロバ抗ウサギまたはロバ抗マウス二次抗体の混合物と共に、暗所で室温で２時間インキュベートした。 4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(ZLI-9557、Zsbio)核を染色するために使用されました。 セクションは50%のグリセロールと取付けられました。 最後に、切片をＯｌｙｍｐｕｓ Ｂ Ｘ５ １（Ｊａｐａｎ）蛍光顕微鏡を用いて観察し、撮影した。 我々の研究で使用された抗体は、我々の以前の研究や他の研究者によって広く使用されており、これらの抗体の感度と特異性が確認されている。2.4.
ウェスタンブロット
皮質、海馬、および視床は、1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、および12ヶ月のc57BL/6マウスから収集されました。 試料をＲＩＰＡ緩衝液中で均質化し、タンパク質試料の濃度をＢＣ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳ）によって測定した。 タンパク質試料を、１ ０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｇｅｌ ｋｉｔ、ＣＷ０ ０ ２ ２Ｓ、Ｃｈｉｎａ）によって分離し、ポリビニリデン二フッ化（ＰＶＤＦ）膜に電気的に移した。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルキットの成分は、３ ０％Ａ Ｃｒ−Ｂｉｓ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離ゲル緩衝液、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ積層ゲル緩衝液、ＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）、およびＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）を含んでいた。 その後、膜をTBST(0.05%Tween20を含むTBS)に希釈した5%非脂肪乾燥乳中で室温で1時間ブロックし、次いで特異的一次抗体：マウス抗GFAP抗体（#3670,1）とインキュベート:１：１ ０ ０ ０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；ウサギ抗Ｎｄｒｇ２抗体（＃５ ６ ６ ７、１：１ ０ ０ ０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；ウサギ抗Ｓ１ ０ ０Β抗体（＃２ ０ １ ７−１、１：１ ０ ０ ０、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ）；およびウサギ抗ＧＡＰＤＨ抗体（＃５ １ ７ ４、１：１ ０ ０ ０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を４℃で一晩インキュベートした。WESTERN LIGHTNING CHEMILUMINESCENCE reagent plus（perkinelmer life sciences）を用いて化学発光シグナルを開発した。; Ｌｉ−ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）によって検出された。 タンパク質バンドの免疫反応性は、Bio-Rad®Image Lab™ソフトウェアによって定量的に分析されました。 バンド密度値をＧＡＰＤＨに正規化した。2.5.
定量的（リアルタイム）ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムPCR）
皮質、海馬、および視床は、1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、および12ヶ月のc57BL/6マウスか 全ＲＮＡを、Ｔｒａｎｓｚｏｌ Ｕｐ Ｐｌｕｓ ＲＮＡキット（コードＮｏ． ＥＲ５ ０ １−０ １，Ｔｒａｎｓｇｅｎ，Ｃｈｉｎａ）を用いて定量した。 次いで、１ ０ ０ ０ｎｇの全ＲＮＡを、２ ０μ ｌ反応液中で、４ ２℃で１ ５分間逆転写し、続いて、８ ５℃で５秒間、Ｔｒａｎｓｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ａｌｌ−ｉｎ−Ｏｎｅ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（コードＮｏ． AT341、トランスジェン、中国）。 キットの構成要素は、５×Ｔｒａｎｓｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｏｌｌ−ｉｎ−Ｏｎｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ ＱＰＣＲ（Ｔｒａｎｓｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ、Ｒｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ａｎｃｈｏｒｅｄ Ｏｌｉｇｏ（Ｄ Ｔ）１ ８Ｐｒｉｍｅｒ、Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｎ９）、ｄＮＴＰｓ、ｂｕｆｆｅｒ）、５×Ｔｒａｎｓｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｏｌｌ−ｉｎ−Ｏｎｅ Ｎｏ−ＲＴ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ ＱＰＣＲ、ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ、およびＲｎａｓｅを含まない水を含 ＱＰＣＲのための５×Ｔｒａｎｓｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｏｌｌ−ｉｎ−Ｏｎｅ ＮＯ−ＲＴ対照Ｓｕｐｅｒｍｉｘを陰性対照として使用した。 リアルタイムＰＣＲは、２ ０μ Ｌ反応において、Ｔｒａｎｓｓｔａｒｔ Ｔｉｐ Ｇｒｅｅｎ ｑＲＮＡ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（コードＮｏ． Aq141、トランスジェン、中国）。 使用されるｍＲＮＡプライマー配列は、表１に見出すことができる。 反応を、Ｖｉｉａ７リアルタイムＰＣＲ検出システム（２ ７ ２ ０Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で９ ４℃で３ ０秒、続いて９ ４℃で５秒、６ ０℃で１ ５秒、および７ ２℃で１ ９秒の４ ０サイクルで行った。 相対的ｍＲＮＡ発現から誘導されたプライマーおよび配列を、式を用いて分析した。
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2.6. ０ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して統計的試験を行った。＜／ｈ５＞＜ｐ＞統計的試験は、ＰＲＩＳＭ ｖ７． ２群間の比較はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて行った。 種々の群間の比較は、Ｔｕｋｅｙのｐｏｓｔｔｅｓｔを伴う一方向Ａ ＮＯＶＡを用いて行った。 全ての値を平均±ＳＤとして示した。 P<0.05の値は統計的に有意であると考えられました。
3. 結果
3.1. 異なる脳領域におけるNDRG2、GFAP、およびS100Βによって標識されたアストロサイトの分布
マウス脳の領域は、細胞核を標識することによって同定された。 さらに、対応するマウス脳アトラスを使用して、分析された特定の領域を検証しました（図1）。 我々はその後、NDRG2、GFAP、およびs100Βによって標識されたアストロサイトの分布を検出するために免疫蛍光染色を使用して、6ヶ月齢の成人雄マウスの異な NDRG2およびS100Β陽性アストロサイトは、大脳全体にわたってGFAP陽性アストロサイトよりも豊富であり、より均一に分布していた（図2）。 NDRG2陽性の星状細胞は、背側皮質（領域1）と視床（領域5）に集中していたが、海馬（領域4）、脳梁（領域3）、腹側皮質（領域2）では少なく、脳柄（領域6）では最も少なかった（図2（a）と2（b））。 GFAP陽性アストロサイトは海馬に最も集中していた; 脳梁および大脳脚ではほとんど検出されず、背側皮質、腹側皮質および視床ではほとんど検出されなかった（図2（a）および2（c））。 S100β陽性の星状細胞は、背側皮質および視床に最も集中しており、海馬および腹側皮質にはそれほど集中しておらず、脳花柄および脳梁には少な NDRG2陽性アストロサイトの分布は、S100Γ陽性アストロサイトの分布と同様であった。div>
(a)
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+++:強陽性;++:中陽性;+:弱陽性。
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3.2. 異なる脳領域におけるNDRG2、GFAP、およびS100Βによって標識されたアストロサイトの形態
アストロサイトは、主に二つのタイプに分けられます: 白質の繊維状のアストロサイトおよび灰白質の原形質のアストロサイト。 そこで、脳梁（白質、領域3）と海馬（灰白質、領域4）の異なるマーカーによって標識された二つのタイプの形態を比較しました（図4）。 成体雄マウス（6ヶ月）からの結果は、NDRG2を示した-とS100Γ陽性星状細胞は、いくつかの枝を持っていた短いと粗い細胞質プロセスと一緒に大きな丸い GFAP陽性アストロサイトは、小さな相馬、長いプロセス、およびmultibranchesによって特徴付けられる放射状の形状を提示した(図4)。 さらに、脳梁および脳花柄では、GFAPによって標識されたアストロサイトは、NDRG2およびS100Βによって標識されたものよりも豊富な長いプロセスを示した（図5および7）。
NDRG2は、腹側皮質、脳梁、および脳花柄のアストロサイトでGFAPとほぼ共局在化し、海馬のアストロサイトではほとんどGFAPと共局在化した（図5および8（a））。 NDRG2は、背側皮質および視床の星状細胞において、GFAPとの共局在はほとんどなかった（図5）。 NDRG2とS100Βは、六つの脳領域の星状細胞におけるほぼ完全な共局在を示した（図6と8（b））。 GFAPとS100Βは、腹側皮質、脳梁、および大脳脚の星状細胞で有意な共局在化を示し、海馬の星状細胞ではほぼ完全な共局在化を示した(図7)。 GfapとS100Βは、背側皮質と視床の星状細胞ではほとんど共局在化していなかった（図7）。
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
異なる脳領域におけるNDRG2、GFAP、およびS100Βタンパク質の発現
我々は、成体雄マウス（6ヶ月）の三つの脳領域におけるNDRG2、GFAPおよびS100Βタンパク質の: 皮質、海馬、および視床（図8（c））。 同じ脳領域におけるこれらのマーカーの発現レベルを分析した（図8（d））。 皮質では、NDRG2発現レベルはGFAPおよびS100Β発現レベルよりも著しく高かった（p<0.001、p<0.05）。 S100Βの発現レベルもGFAPよりもはるかに高かった（p<0.05）。 海馬では、GFAP発現のレベルは、NDRG2およびS100Β（p<0よりも高かった。01)、NDRG2発現のレベルはS100Β発現レベルよりも少し低かったが、差は統計的に有意ではなかった。 視床では、S100Βの発現レベルはGFAPおよびNDRG2の発現レベル（p<0.01）よりも有意に高かったが、NDRG2の発現レベルはGFAPの発現レベル
次に、異なる脳領域における同じマーカーの発現レベルを分析した（図8（e））。 皮質におけるNDRG2発現のレベルは、海馬および視床（p<0.01）よりもはるかに高く、海馬と視床の間に有意差は観察されなかった。 海馬におけるGFAP発現のレベルは、三つの領域の中で最も高かった（p<0.001、p<0.01）;皮質と視床の間に有意差は観察されなかった。 視床におけるS100Β発現のレベルは、皮質および海馬よりも有意に高かった（p<0。01)、後者の二つの間に有意差は観察されなかった。また、1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、および12ヶ月の雄マウスの皮質、海馬、および視床におけるNDRG2、GFAP、およびS100Βのタンパク質レベルを検出した（図9（a）-9（f））。 皮質、海馬、および視床におけるNDRG2およびGFAPのタンパク質レベルは、年齢とともに徐々に増加した（p<0.05、p<0.01）。 皮質および視床におけるS100Βのタンパク質レベルは、海馬ではなく、年齢とともに徐々に増加した（p<0。05,p<0.01,p<0.001)。 1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、および12ヶ月の雄マウスの皮質、海馬および視床におけるNDRG2、GFAP、およびS100ΒのmRNAレベルは、タンパク質レベルのものと一致していた（p<0.05、p<0.01、図9(g)-9(i)）。
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
4. 議論
本研究では、NDRG2とS100Βによって標識されたアストロサイトは、若い、成熟した、古いマウスの大脳全体でGFAPによって標識されたものよりも広く、均一に分布していたことがわかった。 これは、NDGR2とS100Βは、全体的な分布とアストロサイトの数の変化を観察するために、より適切なマーカーであることを示唆しています。 また、我々の結果は、異なる脳領域のアストロサイトは、皮質および視床では、NDRG2とS100ΒがGFAPよりも適切なアストロサイトマーカーであることを示唆しているNDRG2、GFAP、およびS100Βに対する免疫反応性の異なるレベルを提示したことを示した。 NDRG2、GFAP、およびS100Βに対するアストロサイトの不均等な免疫反応性も、我々が使用した抗体の感度および特異性に起因する可能性がある。 さらに、NDRG2とS100Βによって標識されたアストロサイトの形態は、互いに類似していたが、これらのマーカーは、異なる細胞骨格構造を標識するため、GFAPによ NDRG2は細胞質および細胞膜を染色し、核を弱く染色する。 GFAPは主に相馬とプロセスを染色しますが、核は染色しませんが、S100Βは核と細胞質とプロセスの一部を染色します。 NDRG2、GFAP、およびS100Βによって標識されたアストロサイトの形態を比較することにより、我々はGFAPが脳梁、脳柄、特に海馬のアストロサイトのためのより適 タンパク質NDRG2とS100Βは、それぞれ、皮質と視床で最も発現していた。 我々は、NDRG2は皮質のアストロサイトに適しているが、s100Βは視床のアストロサイトに適していると推測している。 皮質、海馬、および視床におけるNDRG2、GFAP、およびS100Βの異なるタンパク質発現パターンは、星状細胞の機能的不均一性を確認した。
アストロサイトは恒常性の維持に重要な役割を果たすことが判明しており、虚血性脳卒中、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病などのほ 星状細胞の形態，遺伝子発現，および機能は大脳の異なる領域間で異なっていたことが示されている。 繊維状アストロサイトと原形質アストロサイトは、その形態によって同定された二つの主要な亜集団である。 繊維状の星状細胞は長くて薄いプロセスを持ち、星のような外観をしていますが、原形質のものはシナプスに接触して鞘を作る多数の細かいプロセスを持っています。 興味深いことに、多くの遺伝子はアストロサイトのサブセットによって不均一に発現される。 これらの遺伝子は、グルタミン酸トランスポーターやイオンチャネル、グルタミン酸、ドーパミン、オピオイド受容体などのタンパク質をコードしています。
遺伝子発現の不均一性は、アストロサイトの機能的多様性を示唆した。 例えば、グルタミン酸の取り込みは、異なるサブセット間で異なる。 さらに、自発的なカルシウム振動は、体性感覚皮質の異なる層の間で異なる。 皮質層1アストロサイトは頻繁な非同期Ca2+活性を示したが、層2/3アストロサイトはまれな同期Ca2+活性を示した。 皮質では、アストロサイトはカルシウムの増加とともにグルタミン酸とノルエピネフリンに応答し、海馬アストロサイトはATP、GABA、グルタミン酸、アセチルコリン、プロスタグランジン、およびエンドカンナビノイドにカルシウム応答を示す。 研究はまた、異なる脳領域から培養されたアストロサイトが神経突起の成長および分岐を刺激する異なる能力を有することを示している。 異なる脳領域のアストロサイトは、形態と機能の異なる特性を提示するように、異なる脳領域のアストロサイトのための最も適切なマーカーを同定
いくつかのタンパク質はアストロサイトによって選択的に発現されると報告されているが、すべてのアストロサイト亜型に完全に制限されていることは示されていない。 最も広く使用されている星状細胞マーカーであるGFAPは、灰白質のものよりも白質の星状細胞で優先的に発現され、星状細胞のすべてのプロセスにラベルを付けることができない。 さらに重要なことに、gfap正アストロサイトは時間と電圧に依存しない電流の古典的なパターンを提示するのに対し、電圧依存K+電流を提示するGFAP負アストロサイトのサブセットがあります。
以前の研究では、S100Βは灰白質と白質の両方で星状細胞を標識することができたが、少数の乏突起膠細胞とニューロンでも発現していた。 S100βは、リソソームの存在とオートファゴソームの形成を促進することにより、パーキンソン病におけるDAergic末端の変性によって生成されるDAergicデブリの洗浄に関与する細胞のサブタイプである視床アストロサイトで最も発現されることが判明した。 アストロサイトの転写分析は、アストロサイトマーカーとしてアルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリー、メンバー L1（ALDH1L1）を同定した。 しかし、ALDH1L1はまた、オリゴデンドロサイトを標識した。 同様に、興奮性アミノ酸トランスポーターグルタミン酸/アスパラギン酸トランスポーター（GLAST）、グルタミン合成酵素（GS）、グルタミン酸トランスポーター-1（GLT-1）、ビメンチン、コネキシン43、アクアポリン4、および細胞表面糖タンパク質CD44もアストロサイトをラベリングする際に制限があった。
NDRG2は、ラットおよびマウスの両方の星状細胞において特異的に発現され、発達中の胚性脳の成長および成熟に関連する。 細胞増殖、分化、および膜貫通輸送に加えて、NDRG2はまた、ストレス応答、うつ病、虚血性疾患、および神経変性疾患に関与しています。 マウスおよびヒトでは、NDRG2は、大脳皮質の歩行中心に関連する疾患である注意欠陥/多動性障害（ADHD）の発症に関与している。 Flugge et al. ヒト、マーモセット、ツリーシュルー、ラット、およびマウスの大脳におけるNDRG2の発現を検出し、NDRG2は、特に成熟した、非反応性、および非増殖性アストロサイトのための新しいアストロサイトマーカーであったことを示唆した。 本研究では、最初の異なる脳領域と古典的なマーカー GFAPとS100Βによって標識されたアストロサイトとの違いにおけるNDRG2陽性アストロサイトの分布パター
アストロサイトとアストロサイトマーカーは、正常な脳の老化中に変化しました。 これまでの研究では、アストロサイトは加齢初期に活性化されることが示されており、gfap陽性アストロサイトの有意な増加は、高齢マウスの海馬領域 ＧＦＡＰ蛋白質とＧＦＡＰＭＲＮＡの両方のレベルは，大脳皮質，海馬，小脳などの加齢脳の様々な部分で増加した。 老化脳におけるS100Βの様々な報告の間に矛盾が残っている。 ますます、研究は、NDRG2は、アルツハイマー病などの加齢に関連した疾患と関連していることが示されています。 我々の研究では、皮質、海馬、および視床におけるGFAPおよびNDRG2mRNAのレベルは年齢とともに徐々に増加したが、海馬および視床におけるS100Β mRNAのレベルは年齢とともに増加したが、皮質では増加しなかった。現在、我々が試験したものに加えて、ALDH1L1、GLAST、GLT-1、CD44、およびビメンチンなどの多くのマーカーがアストロサイトを標識するために使用されていることに注 GFAP、S100Β、および大脳のGS：我々の研究では、我々は唯一の新規提案マーカー NDRG2と最も一般的に使用されるマーカーによってラベル付け古典的な脳星状細胞を比較した。
結論として、我々の研究は、NDRG2とS100Βは、それぞれ皮質と視床の星状細胞にとってより適切なマーカーであり、大脳全体の星状細胞の数の全体的な分布と変化を観察するためのマーカーであることを示している。 一方、gfapは、脳梁、脳柄、特に海馬における星状細胞のプロセスおよび枝を標識するとき、NDRG2およびS100Βよりも優れている。 我々の研究は、星状細胞機能を探索する際に神経科学の研究者のためのガイダンスを提供する異なるマウス脳領域における星状細胞のための最も適
データの可用性
この研究の調査結果を支持するために使用されたデータは、記事に含まれています。
Disclosure
Zengli ZhangとZhi Maは共同の最初の著者です。
利益相反
著者は、利益相反がないことを宣言します。
著者の貢献
Zengli ZhangとZhi Maは、この研究にも同様に貢献しました。
謝辞
この作品は、北京自然科学財団（No.7194321To Lixia Zhang）、中国の国家自然科学財団（No.81801138to Yulong Ma、No.81771206to Wangyuan Zou）、中国麻酔科医協会の若手研究助成金（no.21700001to Yulong Ma）、中国PLA総合病院のMiaopu財団によってサポートされていた。（いいえ。 18KMM47Lixia張に）、および北京市科学&技術委員会（No.1811000017180022郭をハングアップする）。
補足資料
補足図1。 アストロサイト内のNDRG2およびGSの共局在化。 補足図2. 細胞株におけるNDRG2タンパク質の発現。 （補足資料）