議論
我々の結果は、慎重な計画、訓練、および試薬およびプロトコールの標準化によって、国境を越えた実験室ネットワークは、一貫した匹敵するHAIアッセイ結果を生成する能力を有することを示している。 この研究に参加している5つの公衆衛生および学術研究所は、パンデミックが発生した場合にワクチンおよび他のインフルエンザ研究を支援するカナダの国家能力を高めるために開発されたPCIRNの一部でした。 パンデミックの状況では、大量、高圧、および地理的に分散したインフルエンザ検査では、HAIアッセイの標準化は、実験室間の結果の比較可能性を確保す PCIRNの実験室は重複の99.8%の精密の内実験室の再現性の高水準を、示した（99。100％）、反復アッセイ日にわたる2倍の範囲内の力価の97.8％（実験室あたり93.3％〜100％）、および6アッセイプロトコールのすべての単一の反復にわたって力価の再現性 実験室間の再現性も高く、試験した血清の100％について、基準実験室の2倍以内の四つの非参照実験室からのすべての複製を横切って力価の中央値が高かった。 実験室ごとに、94.3％および98の力価。参照実験室およびコンセンサス力価の単一希釈内でそれぞれ定量化された試料の9％（範囲、85％〜100％および95％〜100％）。 これらの割合は、Ｈ Ａ ｉアッセイの変動性（すなわち、サンプルの少なくとも８ ０％が、公称値および／または全アッセイＧｍｔの１希釈内である）の典型的な受容性のしきい値を満たす。 HAIアッセイの特異性（100％）と感度（87.5％から100％）PCIRN研究所全体で同様によく以前の研究の受け入れ基準内であった（すなわち、陰性のサンプルの100%はquantitationのレベルの下でとして量を示すべきで、陽性のサンプルの少なくとも80%は陽性として量を示すべきです）。
HAIアッセイの変動性の腹腔内コンポーネントについては、PCIRN研究所内の再現性は、他の研究（に示されているものと同様に表示されます5、22）。 これらの以前の研究の一つの注意点は、六つ以上の繰り返しアッセイ（24-27）を調べる一般的な免疫アッセイ検証慣行にもかかわらず、三つ以上の繰り返し このように、それらのデータが、本研究における６つのアッセイにわたって決定された結果と直接同等であるかどうかは明らかではない。 それにもかかわらず、結果が他のアッセイ繰り返しのものから2倍以上異なるアッセイの0％から6.7％（中央値、0％）の私たちの発見は、4.8％から7.1％が以前に指摘された（22）と0％から15％（中央値、2％）の9つの研究所（5）に匹敵するように見える。
地理的に分散したPCIRN研究所間の高HAI力価の再現性の我々の調査結果は、このアッセイ（5、6、9-12）を実行する国際研究所間の実質的な変動を示す以前の 例えば、大規模な共同研究（11の研究室）からのデータは、84％から803％の範囲のサンプルごとのGcvを発見した（ウイルスあたりのgcvの中央値は138％、155％、および261％）。 他の研究では、95％から345％（11）および22％から582％（6）に及ぶH1N1およびH5N1サンプルのGcvが報告されており、Gmtは実験室間で最大80倍（11）または128倍（9） 以前の報告は、多くの場合、現在の研究よりも参加ラボの高い数が含まれていたが、ちょうど六つの研究室がデータを貢献した場合でも、ラボ間GCVの中央値は83％で、80％が実験室間の4倍の差を超えていた（11）。 対照的に、現在の研究では、ウイルスあたりのGcvの中央値はわずか39％と17％であり、実験室間の4倍の差内のサンプルの95％であった。 一つのサンプルは、4倍の差を超えました; 力価は、ある実験室でこの試料について定量化できなかったため、測定するのではなく最低値が割り当てられた。 そのサンプルが分析から省略された場合、最大GCVは75.5％であり、これは他の研究における最小GCVよりも低い値を表すであろう。 そのサンプルは他のものよりも高い変動性を示したが、この低い測定範囲は一般的に高い範囲よりも精度が低いように見えた。 例えば、ＧＣＶは、１ ０〜８ ０の間の力価で４ ３.４％〜１ ５ ６.４％の範囲であったが、より高い力価で１ １.１％〜５ ３.１％の範囲であった（図１ ０Ａ）。 3). より低い力価のサンプルとのより大きい可変性はまた前に記述され（23）、多分40のしきい値（22、24、および43のコンセンサス力価）に最も近い力価を持つ三つのH1N1 それにもかかわらず、PCIRNの実験室を渡るseroprotectionの診断正確さは高い全面的に残った（一致の力価がseroprotectionを定義するのに使用されたとき93.6%および89.5%参照の実験室の価値と比較された）。
PCIRN実験室における実験室間HAI力価の高い一致は、PCIRN全体のHAIアッセイ手順および試薬の慎重な調和に関連する可能性がある。 高い実験室間変動性を示した以前の研究の参加者は、一般的に実験室間で変化するHAIアッセイ法を使用しました。 結果の変動に寄与すると考えられるアッセイ変数には、添加されたウイルスの量、ウイルス培養系（例えば、ウイルス培養系）が含まれていた。 ｒｄｅ処置の期間、初期血清希釈、使用されたＲｂｃのタイプおよび年齢、およびＲＢＣ沈降に許容された時間（５、１ １、１ ２）。 しかし、驚くべきことに、Wood et al. ヨーロッパの季節性インフルエンザワクチン試験に関与する商業および公的研究室の参加者に、従うべき詳細な標準的な操作手順および一般的な試薬/材料を提供し、彼らは実験室間変動が有意に改善されなかったことを報告した（10）。 著者らは、持続的な”局所的な技術的変化”と異なるRBCサプライヤーは、研究室間の再現性に影響を与えた可能性があると推測したが、さらなる標準化は研究の実現可能性の限界を超えていることに留意した。 後の出版物は、実験室間のHAIアッセイの標準化は、一般的に、異なる実験室間でHAI結果を調和させるための実行可能なアプローチではないことを示すと解釈し（8、12）、少なくとも一つのグループは、より信頼性の高い再現性の高いデータを生成するために変更され、より堅牢なHAIアッセイを開発しようとしています（22）。
現在の研究では、PCIRN研究所は、技術的または解釈的な変動の対象となる点が研究開始前に研究室間で調和した標準、公に利用可能な世界保健機関HAIアッセイプロトコルに厳密に準拠していました。 主要な試薬（例えば、ＲＤＥ、ＲＢＣ、ウイルスストック）は、可能な限り同じ供給業者から得た。 さらに、各テストサイトの単一の技術者にテストを制限することは高められた標準化を可能にした。 各研究室で複数の人員を使用する可能性のある効果は、この研究では試験されなかった。 複数のオペレータの使用は潜在的に変動性を増加させる可能性がありますが、HAIテストのためにこの可能性を検討した唯一の研究は、同じ実験室（22）
アッセイで使用するために成長したウイルス株の実験室間の潜在的な変動は、すべての実験室で同様の条件下で同じ細胞株で成長した単一のソースからのウイルス種子ストックを使用することにより、PCIRN実験室間で最小限に抑えられました。 実験室間の再現性は，ウイルス作業ストックを中心に生産し，参加研究室に配布することにより，さらなる改善に適していると推測した。 HAIエンドポイントの力価のためのウイルス株の変動の重要性はよくHAIアッセイはまだ同等の赤血球凝集素とノイラミニダーゼ（11）を保有していたX179A再集合体と比較してA/Cal ph1n1株を使用したときにある研究で実証された2-3倍低い力価によって示されている。 残念ながら、株式は、この研究の一部として配列決定されていないので、我々はすべての研究室が同一の赤血球凝集素配列を持つウイルスを使用していたことを確認することはできません。 ウイルス株の局所伝播によってわずかな配列変動が導入されたとしても、本研究の研究室間の変動は小さかったため、同一のHA配列を持つ株を使 違いは、この小さなサンプルセットで2倍を超えていなかったが、ウイルス株の局所伝播によって導入されたHA配列のマイナーな変動は、H1N1力価の過少評価とH3N2力価の過大評価の傾向のための一つの可能な説明である可能性がある。
様々な研究では、国際基準（6、11-13）に対して結果を校正することにより、HAI力価の実験室間変動が減少したことが報告されているが、現在の季節性インフ この研究では、実験室間の比較可能性は、最も効果的な校正基準を使用することによって達成されるものよりも優れているように見えます。 例えば、ＩＳ０ ９／１ ９ ４、Ｗｏｏｄ ｅ ｔ ａ ｌ． (11)は、異なる研究室におけるGmt間の最大差が80倍から64倍に減少したこと（すなわち、現在の研究の最大11倍よりもかなり高い値）、および研究室間のGCVの範囲が95％から345％（中央値、105％）から34％から231％（中央値、109％）に減少したことを報告した。すなわち、本研究で見られる0％から156％（中央値、27％）の範囲をはるかに超えている。 同様に、置換の使用は、10/202であり、実験室間のGCVを108％から157％の範囲から24％から144％の範囲に減少させ、実験室間の最大差を43倍から21倍（13）に減少させ、07/150標準を使用して、Stephenson et al. （６）１ ５ＮＩＢＲＧ−１ ４Ｈ５Ｎ１クレード１試料のＧＣＶ中央値を１ ２ ５％（範囲、３ １％〜５ ８ ２％）から６ １％（３ ４％〜５ ３ ５％）に減少させた。
以前の研究と比較してPCIRN研究所間の高い合意の正確な理由は確認できませんが、再現可能なプロセスを確立するという共通の目標に向かって サイト間の詳細かつ厳格なプロセスと試薬の調和は、おそらく我々がこの研究にもたらした唯一の”新しい”側面であり、実験室間のHAI再現性が低いこと しかし、我々のデータは、慎重な標準化では、HAI力価の実験室間変動は、単一の実験室内で観察されたものと同様のレベルに減少する可能性があることを示唆 世界中の研究室におけるHAI力価の変動を最小限に抑えるための潜在的な次のステップは、ネットワーク/コンソーシアムの動員、標準的な手順および試薬の使用に関するガイドラインおよび/または規制要件の実施、再現性を確保するための標準化されたトレーニング、および研究室が”標準化”概念を受け入れるためのサポートおよび/またはインセンティブの提供である。