ヒト糞便中の硫酸還元細菌と炎症性腸疾患との関連

概要

特定の液体培地(Test-kit Labège®,Compagnie Française de Géothermie,Orléans,France)を用いて、肝臓・胃・腸科学ユニットから健康な41人と110人の患者の糞便中の硫酸還元細菌を検索しました。 110人の患者は、炎症性腸疾患を提示する22人の患者と、他の下部（n=30）または上部（n=58）消化管疾患のために入院した88人の患者で分離された。 硫酸還元細菌は、10健康な個人（24％）、炎症性腸疾患を提示する15患者（68％）、および他の症状を有する33患者（37％）から単離された。 Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｐｉｇｅｒ（旧Ｄｅｓｕｌｆｏｍｏｎａｓｐｉｇｒａ），ＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｆａｉｒｆｉｅｌｄｅｎｓｉｓおよびＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓの同定のために多重ＰＣＲを考案し，上記分離株に適用した。 硫酸還元細菌の株は、D.piger（39分離株）、D.fairfieldensis（19分離株）とD.desulfuricans（一つの分離株）から成っていた。 D.pigerの有病率は、炎症性腸疾患患者（55％）において、健常者（12％）または他の症状を有する患者（25％）と比較して有意に高かった（P<0.05）。クローン病（CD）および潰瘍性大腸炎（UC）は、病因不明の慢性炎症性腸疾患（IBD）であるが、環境因子、遺伝因子および免疫因子に依存する可能性が高い。 感染性起源が提案されており、多くの微生物は説得力のある議論がない場合に関与している。 しかし、両方の症候群では、腸の炎症は抗生物療法に反応する。 慢性大腸炎の動物モデルでは、管腔内細菌叢は、疾患が発生するための必須の補因子である。 これはこれらの無秩序の原因として腸の植物相の役割の新たな興味を説明するかもしれません。硫酸還元細菌（SRB）は、エネルギーを得るために異種硫酸還元を行う嫌気性微生物であり、その結果、大量の硫化物が放出される。

それらは一般に環境源から単離されるが、動物およびヒトの消化管にも存在する。 Desulfomonas pigraはDesulfovibrio piger combとして再分類されています。 【送料無料】【 ＳＲＢのヒト分離株は，デスルホビブリオ種のほぼ独占的に構成される。 最近の知見は、SRBがヒト疾患において役割を有する可能性があることを示唆している。 それらはヒト歯周炎の臨床的重症度と関連しており、深遠な膿瘍（腹部または脳）、血液または尿から単離されている。 これらの設定では、ほとんどの株は、16SリボソームRNA遺伝子（16S rDNA）シーケンシングによって、Desulfovibrio fairfieldensis、最近提案された新種として同定されています。 デスルフォビブリオ属のタイプ種であるDesulfovibrio desulfuriicansもヒトの標本から単離されている。 ＩＢＤにおけるＳＲＢの含意は、それらの代謝最終生成物である硫化水素が細胞傷害性化合物であることが示唆されている。 この混合物は酪酸塩の酸化、colonocytesのための主要なエネルギー源の阻止によって機能するかもしれません。 腸の上皮の機能の減損は細胞死および慢性の発火の原因となります。 しかし，ＩＢＤに関連するＳＲＢの種はまだ同定されていない。 それらの同定は、病原性因子ならびに抗菌剤に対するそれらの感受性を探すことを可能にするであろう。

医学研究所では、SRBは成長が遅いため、ヒト試料から単離されることはほとんどありません。 コロニーは、インキュベーションの3日以上後に表示され、彼らが存在する支配的または唯一の種でない限り、付随する植物相によって生い茂っている、気 したがって、特定の培地を使用しない限り、糞便中のそれらの検索は困難である。 このような媒体は、通常、有機化合物（電子供与体および炭素源）、硫酸塩（電子受容体）、鉄および還元剤を含む。 特定の培養基のSRBの成長は硫化第一鉄の沈殿物の形成に終って硫化水素（H2S）の生産による媒体の黒くなることによって容易に検出されます。 臨床試料から単離されると、種レベルでの同定は困難である可能性がある。 例えば、D.fairfieldensisとd.desulfuricansを表現型テストによって区別することはできません。 したがって、遺伝子増幅は、そのような同定を達成するための貴重なツールである。

この研究の主な目的は、Desulfovibrioの種があればIBDに関連している可能性があるかを決定することでした。 この目的のために、特定の液体培地（Ｔｅｓｔ−ｋｉｔ Ｌａｂｅｇｅ（登録商標）、Ｃｏｍｐａｇｎｉｅ Ｆｒａｎｓａｉｓｅ ｄ ｅ Ｇｅｏｔｈｅｍｉｅ、Ｏｒｌéans、Ｆｒａｎｃｅ）を、健康な個体およびＣｅｎｔｅｒ Ｈ Hospitｐｉｔａｌｉｅｒ ｅ ｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｄ Ｅ Ｎａｎｃｙ、ＦｒａｎｃｅのＨｅｐａｔｏ−Ｇａｓｔｒｏ−Ｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｔに入院した患者の糞便からのＳＲＢの増殖に使用した。 種レベルでの分離株の同定のために多重ＰＣＲを考案した。

2材料および方法

2.1患者

41人の健康な個人（男性17人および女性24人）の糞便; 平均年齢38歳、範囲1-101年）と110人の患者（67人の男性と43人の女性;平均年齢57歳、範囲14-100年）センター Hospitalier et Universitaire de Nancy、フランスのHepato-Gastro-Enterology Unitから収集されました。 健康な人は健康診断のために連続して相談しました。 糞便中に病原性微生物は認められなかった。 健康な個人および患者は、サンプルが得られる前の月に抗生物質投与を受けていない。 患者は三つのグループに分離された：IBD（n=22）は17CDと五UCが含まれていました; 他の下部腸疾患（n=30）には、腹痛、腸通過障害および直腸狭窄などの軽度または中等度の症状を呈する23人の患者が含まれ、結腸癌の患者は58人であり、上部消化管疾患（n=58）には胆石、肝硬変、肝細胞癌、胃および膵臓腫瘍が含まれていた。 臨床所見，内視鏡所見，組織学的所見からＩＢＤと診断した。 IBD患者のほとんどは、活動的な疾患を提示した（表1）。

2.2SRB検出および列挙

1グラムの糞便を4mlのリン酸緩衝生理食塩水緩衝液と混合し、遠心分離（3000rpm、5分） １ミリリットルの上清を直ちに液体培地（Ｔｅｓｔ−ｋｉｔ Ｌａｂｅｓｇｅ（登録商標），Ｃｏｍｐａｇｎｉｅ Ｆｒａｎｓａｉｓｅ ｄ ｅ Ｇｅｏｔｈｅｒｍｉｅ，Ｏｒｌéans，Ｆｒａｎｃｅ）中に製造者の指示に従って接種した。 簡単に言えば、テストキットLabège®は、srb検出のために嫌気的に調整された特定の培地（有機化合物：乳酸および酢酸、還元剤：クエン酸チタン）の9mlを含むバイ それはゴム製のキャップを通して注射器で接種される。 この透明な、無色媒体は環境のサンプルからのSRBの検出のために最初に案出された。 嫌気性雰囲気下で並行接種した一般的に使用されるPostgateの固体培地E（有機化合物：乳酸、還元剤：アスコルビン酸およびチオグリコール酸）と比較した。 後者の培地で満たされた細長い管を用いてＳＲＢを列挙し，糞便の十進法希釈液を接種した。 すべての接種培地を37℃で2ヶ月間インキュベートした。 ＳＲＢの存在は液体培地中の黒色沈殿物（硫化第一鉄）の形成と固体培地中の黒色コロニーの出現によって確認された。ＰＣＲプライマーの設計Ｇｅｎｂａｎｋデータベースで入手可能なＤｅｓｕｌｆｏｍｏｎａｓおよびＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ株の１ ６Ｓ ｒＤＮＡ配列を、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｎａｖｉｇａｔｏｒソフトウェアバージョン１.０.１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、フォスター市、カリフォルニア州、米国）。 これは、以前にヒトから単離されたSRBのPCRによる同定のための六つのプライマーを設計することを可能にし、それぞれDに関連していた。 ｐｉｇｅｒ（旧Ｄｅｓｕｌｆｏｍｏｎａｓ ｐｉｇｒａ）ＡＴＣＣ２ ９ ０ ９ ８Ｔ、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ Ｅｓｓｅｘ６ＡＴＣＣ２ ９ ５ ７ ７Ｔ、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ Ｍ Ｂ ＡＴＣＣ２ ７ ７ ７ ４、およびＤ．ｆｅａｒｆｉｅｌｄｅｎｓｉｓ ＡＴＣＣ７ ０ ０ ０ ４ ５。 D.desulfurians Essex6とD.desulfurians MBは、これらの株の16S rDNA配列が3％の差を示すように分化した。 プライマーは、２ ７Ｋ−Ｆ（５’−ＣＴＧ ＣＣＴ ＴＴＧ ＡＴ Ａ ＣＴＧ ＣＴＴ Ａ Ｇ−３’）、２ ７Ｋ−Ｒ（５’−ＧＧＧ ＣＡＣ ＣＣＴ ＣＴＣ ＧＴＴ ＴＣＧ ＧＡＧ Ａ−３’）、Ｅｓｓｅｘ−Ｆ（５’−ＣＴＡ ＣＧＴ ＴＧＴ ＧＣＴ Ａ ＡＴ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＧＴ Ａ Ｃ−３’）、Ｆａｒ−Ｆ（５’−ＴＧＡ ＡＴ Ｇ Ａ Ａ Ｃ ＴＴＴ ＴＡＧ ＧＧＧ Ａ Ａ Ａ ＧＡＣ−３’）、Ｐｉｇ−Ｆ（５’−ＣＴＡ ＧＧＧ ＣＡＣ−３’）であった。およびＰ６ ８ ７−Ｒ（５’−ＧＡＴ ＡＴＣ ＴＡＣ ＧＧＡ ＴＴＴ ＣＡＣ ＴＣＣ ＴＡＣ ＡＣＣ−３’）である。 ０（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースから入手可能なすべての細菌配列について、これらのプライマーの特異性をチェックした。

2.4 SRB identification by multiplex PCR

Four collection strains (D. piger ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774, and D. fairfieldensis ATCC 700045) and 12 clinical strains (two strains related to D. desulfuricans Essex6、D.desulfuricans MBに関連する二つの株とd.fairfieldensisとして同定された八株）を陽性対照として使用した。 PCRの感度は、定量化された細菌株懸濁液の希釈液で評価した。 ＰＣＲの特異性は、タイプ株（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉａ ＡＴＣＣ４ ９ ２ ６ ０Ｔ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｇｉｇａｓ ＤＳＭ１ ３ ８ ２Ｔ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｄｓｍ６ ４ ４Ｔ）および以下の種に属する一般的な腸臨床株を含む陰性対照でチェックした。: バクテロイデス脆性、バクテロイデスmerdae、バクテロイデスthetaiotaomicron、バクテロイデス均一、バクテロイデスvulgatus、カンピロバクター jejuni、シトロバクター freundii、無害な細菌、Enterobacterローマ帝国、Enterococcus faecalis、Enterococcus faecium、大腸菌、Eubacterium small、Eubacterium sticky、Fusobacterium nucleatum、コペンmorganii、Peptostreptococcus big、Proteus wonderful、proteus common、providencia Stuartii、pseudomonas aeruginosa、Serratia marcescens、Staphylococcus Aureus、staphylococcus epidermidis、および Bovisレンサ球菌。

インキュベーション時間の終わりに、すべての151接種されたテストキットLabège®は、マルチプレックスPCRを使用してチェックされました。 ＤＮＡ抽出物を、５ ０ ０μ ｌの培養培地から、遠心分離およびＴ Ｅ緩衝液（１ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）中で再懸濁した後に得た。 手短に言えば、細胞を、連続的にリゾチーム（３ｍｇ ｍ ｌ−１）、ＳＤＳ（１％、ｗ／ｖ）およびプロテイナーゼＫ（０.２ ５ｍｇ ｍ ｌ−１）を使用して溶解した。 37℃で一晩インキュベーションした後、DNAは標準的なフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール法によって抽出された。 ８ｍ Ｍの各デオキシヌクレオシド三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、０． 全ての反応は、Ｇｅｎｅａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２ ４ ０ ０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，ＵＳＡ）を用いて行った。 94℃の4分間の最初の変性ステップに続いて、30サイクルの変性（94℃、1分）、アニーリング（55℃、1分）および伸長（72℃、2分）、および最終伸長（72℃、5分）が続いた。 陰性（ＤＮＡ抽出物の代わりに水）および陽性（Ｄ．ｆａｉｒｆｉｅｌｄｅｎｓｉｓ ＤＮＡ抽出物）対照を各実行に含めた。 増幅された生成物は、臭化エチジウム（1.6mg ml−1）を含む1.5％（w/v）アガロースゲル中の電気泳動によって分解された。 サイズマーカーとして１ ０ ０ｂｐ ＤＮＡラダーを使用した（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）。 D.piger,d.desulfuricans Essex6,D. desulfuricans MBとD.fairfieldensisは、それぞれ255-、255-、396-と534-bpバンドによって同定された。 D.pigerおよびD.desulfuricans Essex6は、さらに、それぞれの特定のプライマーを使用して別々のPCRアッセイによって分化した。 陰性試料については、コンセンサスプライマー２ ７ｆおよび１ ５ ２ ５ｒを用いた１ ６Ｓ ｒＤＮＡ増幅を実施して、汚染物質によるＰｃｒの阻害の不在を確認した。

3の結果

3。1SRBの検出と列挙

健康な個人では、上記の基準に従って、SRBはTest-kit Labège®とPostgateの両方の培地で10糞便（24％）で発見されました。 Hepato-Gastro-Enterology単位からの患者では、SRBはPostgateの媒体を使用して42の糞便から育てられました。 三つの追加のサンプルは、Test-kit Labège®で陽性であった。 したがって、研究された110人の患者のうち、SRBは45人の患者（41％）の培養によって検出された。 三つの追加のサンプルは、Test-kit Labège®（暗褐色の沈殿物の存在）とのあいまいな結果を与えた。 ＳＲＢの増殖の検出の平均時間は、Ｔｅｓｔ−ｋｉｔ Ｌａｂｅｇｅ（登録商標）（１〜１ １日の範囲）およびＰｏｓｔｇａｔｅ培地（３〜３ ９日の範囲）をそれぞれ使用して２日および６日であった。 健康な個体および患者の糞便中のSRBの平均数は105g−1（範囲102−109g-1）であった。 したがって，ＳＲＢ数は患者の臨床状態とは関連しなかった。

3.2マルチプレックスPCRによるSRB同定

マルチプレックスPCRアッセイの感度は、mlあたり100細菌であった。 その特異性は、分化した四つの遺伝子種間の交差反応がないことによって確認された。 各陽性対照は、対応するプライマーのセットのみで陽性であった。 特異性をチェックするために陰性対照として使用されたすべての株は、D.gigasおよびD.vulgarisのタイプ株を含み、四つのプライマーセットで陰性の結果を与えた。 反応の特異性は、増幅された生成物を配列決定することによってさらに確認された。 得られた配列は常に期待される配列と一致した。 PCRによるSRB陰性サンプルの場合、16S rDNA増幅は、汚染物質によるPCRsの阻害の可能性を捨てることを可能にした。