- POU5F1およびSOX2エンハンサーのインターラクトームの同定
- POU5F1とSOX2エンハンサーのインターラクトームは、初期のDNA複製ドメインではなく、ヘテロクロマティック領域と重複します
- エンハンサーインタラクトームは転写開始部位に隣接しており、アクティブなエピジェネティックな特徴を持っています
- POU5F1とSOX2エンハンサー相互作用遺伝子の転写状態
- Pou5F1エンハンサーに関連付けられている遠位遺伝子は、多能性の調節回路に関与している
- いくつかの転写因子結合部位は、POU5F1およびSOX2エンハンサーのインターラクトームに濃縮されている
- RAD21は、エンハンサー相互作用を媒介する他の転写因子と複合体に潜在的にある
POU5F1およびSOX2エンハンサーのインターラクトームの同定
推定POU5F1およびSOX2エンハンサー領域は、脊椎動物(44種)にわたって進化的に保存されており、p300ヒストンなどのエピジェネティックマークによって定義された活性エンハンサー署名を有する。アセチルトランスフェラーゼおよびH3K27ACが、Hescs7におけるh3k27me3ではない（補足図。 1A）。 我々は、多能性H9細胞株におけるPOU5F1とSOX2の”餌”推定エンハンサーの相互作用パートナーを識別するために4C技術を適用しました。 簡単に説明すると、細胞は、近接して染色体を架橋するように固定された。 染色体は、その後、超音波処理によって断片化しました。 相互作用するクロマチン断片を連結し，ＤＮＡ片を精製した。 次いで、「餌」と相互作用するゲノム領域を、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲによって増幅した（補足図１ ４Ａ）。 1B、補足表1)。 我々は、POU5F1とSOX2遺伝子の推定エンハンサーをターゲットに逆PCRプライマーを設計しました。 構築された４Ｃライブラリーは、ＤＮＡ電気泳動によって可視化することができたが、連結されていない対照は、ＰＣＲ産物をほとんど示さなかった（補足図１）。 図１Ｂ）は、４Ｃライブラリーが結紮産物から増幅されたことを示す。
Illumina HiSeqシーケンサーを使用して次世代DNAシークエンシングを行い、同定された4C相互作用を近位または遠位の相互作用として分類しました（方法を参照）。 遠位相互作用は、近位相互作用が300bpと20kbの間のゲノム距離を有する染色体内領域をカバーしているのに対し、染色体間相互作用と20kbより大きいゲノ 3Cベースの研究の結果と一致して、私たちの遠位の相互作用は、4Cライブラリのための約10％–20％、総相互作用のほんの一部を占めて読み取ります（補足表2）。 我々は、次世代配列決定のために独立してPOU5F1とSOX2のための4Cライブラリを構築するためにH9細胞の二つの異なるバッチを使用しました。 POU5F1とSOX2遠位の相互作用の二つの複製は、それぞれ35％と25％で重複しています。 これは、マウスES細胞27におけるCTCF媒介クロマチンインタラクトームの生物学的複製で観察された中程度の重複と一致しており、エンハンサー相互作用、ライゲーショ 確率的効果に起因する可能性の高い相互作用を除外するために、我々は、全ゲノム全体で富化相互作用ドメインを識別するために偽発見率（FDR）ベースの統計 我々はさらに、高信頼性の頻繁な相互作用ドメインであるとして、生物学的複製の間で重複する濃縮相互作用ドメインをマージしました。 合計で、23と9高信頼頻繁に相互作用ドメインは、それぞれ、POU5F1とSOX2インターアクトームのために同定された（図1、補足表3、4）、それらのほとんどは、e4cの結果と同様に、遺伝子が豊富な領域を含む染色体間相互作用である20。
遠位相互作用のCircosマップは、Circosソフトウェア52を使用して提示されます。
青い外輪は遺伝子密度プロファイルを表します。
POU5F1とSOX2エンハンサーのインターラクトームは、初期のDNA複製ドメインではなく、ヘテロクロマティック領域と重複します
我々は、次のPOU5F1とSOX2エンハンサー相互作用ドメイン（1Mbから4Mbまでのサイズ、補足表3、4）は、任意のユニークなエピジェネティックな特徴を持っているかどうかを調べました。 Ryba et al. showed28、DNA複製タイミング相関の空間的近接のクロマチンによって測定して、こんにちは-C解析し、この時期DNA複製が空間的に明確な区画を明らかにした。 我々は、POU5F1とSOX2遺伝子座はhESCsの初期のDNA複製ドメイン内にあることに気づき、それらの相互作用ドメインは、同様のDNA複製タイミングを持ってい 図2Aに示すように、POU5F1およびSOX2エンハンサー相互作用ドメインは、主にhESCsにおける初期のDNA複製ドメインと重複しています。 同定されたPOU5F1とSOX2エンハンサー相互作用部位（50kbの範囲）を囲むゲノム領域内のアッセイ複製タイミング値の分布は、ゲノムワイドアレイ値（P<2と比較して正の値に向かってシフトを示している。2×10-16,対のないウィルコクソンのランク和検定による;図2B). この観察は、POU5F1とSOX2エンハンサーを取り巻く高次の構造がDNA複製タイミングを同期させていることを、興味深いエピジェネティックな特徴を明 初期のDNA複製ドメインはhescs28における活性遺伝子転写に接続されているように、同定された遠位領域とPOU5F1とSOX2エンハンサーの相互作用が機能的意義を持っている可能性があります。 この観察は、マウスES細胞におけるPOU5F1エンハンサー相互作用体で見たものと一致している（データは示されていない）。 また、図2Aで明らかにされた、POU5F1とSOX2相互作用ドメインは、hescs29の強いH3K9Me3シグナルで標識されたヘテロクロマティック領域と重複していない、インターアクトームは、遺伝子調節の面でゲノムの活性部分内にあることを示唆している。 さらに、我々は、ヒト染色体30の核ラミナ関連ドメイン（LADs）との潜在的な関係を検討したが、おそらくLADsは、ヒト線維芽細胞で決定されたという事実のために、
DNA複製ドメインおよびヘテロクロマティック領域とのインタラクトームの関係。
頻繁に相互作用するドメイン内の相互作用部位は、（2A）に示されている（Chr1およびChr2のみが示されている）。 (2B)、全ゲノムに対する相互作用部位の±50kb以内の領域に対するDNA複製タイミング(RT)アレイ値の分布の比較。
エンハンサーインタラクトームは転写開始部位に隣接しており、アクティブなエピジェネティックな特徴を持っています
pou5F1とSOX2エンハンサーインタラクトームの注釈付き遺伝子位置との相関を探るために、エンハンサーインタラクトームの最も近い遺伝子転写開始部位（TSS）へのゲノム距離の分布を分析しました（図3A）。 POU5F1とSOX2エンハンサー相互作用サイトの両方のカーネル密度プロットは明らかにTSSを中心とした鋭いピークを示しています。 全ゲノム中のランダムにシミュレートされたサイトの分布ピークと比較すると、エンハンサーのインターラクトームで観察されたピークは、TSS（P=0.0018、P=0.0047、それぞれ、Kolmogorov-Smirnovテスト）の周りの狭いウィンドウ内で有意に高い。 TSSの周りの相互作用部位の濃縮は、POU5F1およびSOX2エンハンサーが遺伝子を含むゲノム領域との相互作用を好むことを示唆している。 我々はさらに、異なるゲノムregions31でPOU5F1とSOX2エンハンサー相互作用サイトの分布を調べた。 図3Bに示すように、遺伝子プロモーター配列は、POU5F1およびSOX2エンハンサインタラクトームの両方の濃縮された領域の一つである。 さらに、遠位遺伝子間領域の画分は、二つのインターラクトームのために一貫して減少します。 したがって、我々の観察は、活性エンハンサーを取り巻く高次染色体構造が遺伝子調節に直接関与していることを示唆している。 また、初期のＤＮＡ複製領域内のランダム部位（詳細については、方法を参照）が、ｔｓｓとの距離分布を比較するために選択される場合、ＰＯＵ５Ｆ１およびＳＯＸ２インターアクトームは、統計的に有意ではないが、ＴＳＳ周辺でさらに濃縮されている（それぞれ、Ｐ＝０.３ ９ ０、１Ｐ＝０.２ ０ ９ ８、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定、補足図１ ４Ａ）。 2 ).
(a)相互作用部位から最も近いTSS部位までのゲノム距離のカーネル密度推定。 距離はHOMER software34を使用して計算されました。 全ゲノム中の100,000個のランダムサイトの密度マップも含まれています。 (B)異なるgenic領域におけるインターラクトームの濃縮分析。 分布解析はCEAS software31を用いて行った。
ヒストン修飾は、転写因子結合のためのコンパクトなクロマチン構造を脱凝縮することにより、転写調節に関与することが知られている。 3Cベースのゲノムワイドインタラクトーム研究では、h3K9Ac32などの遺伝子転写を活性化するヒストンマークが豊富な活性区画で、核内のアクテ したがって、我々はPOU5F1とSOX2の活性エンハンサーが選択的にアクティブな遺伝子転写を示す遠位領域と相互作用するかどうかを尋ねた。 H3K27Me3、H3K4Me1、H3K4Me2、H3K27Ac、H3K9Ac、H4K20Me1とH3K36Me3h1ES細胞line33のチップSeqタグプロファイルは、インターアクトームに関連するヒストンパターンを分析するために使用された。 エンハンサー相互作用部位の周りのチップ-Seqタグを数え、正規化し、箱ひげ図として視覚化した。 前述のように、ＰＯＵ５Ｆ１およびＳＯＸ２相互作用は、遺伝子活性調節のためのマークであるＨ３Ｋ４Ｍｅ１、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ２およびＨ４Ｋ２ ０Ｍｅ１のより高い強度プロフ 初期のDNA複製領域のランダムなサイトと比較して、調査されたヒストンマークは、一般に、H3K4Me1とH3K9AcがPOU5F1インターアクトームで最も有意に濃縮されたものであるSOX2インターアクトームよりもPOU5f1インターアクトームでより濃縮されている（P<2。2×10-16両方のマークのために、対になっていないWilcoxonランク-和検定）。 興味深いことに、ポリコムを介した遺伝子サイレンシングマークH3K36Me335は、いずれかのインターラクトーム（p=0.485、P=0.922、それぞれ）に濃縮されていません。 また、ゲノム中の5-ヒドロキシメチルシトシン（5-hmC）サイトとPOU5F1とSOX2エンハンサーのインターラクトームの関係を調べた。 以前の研究が明らかにしたように、ゲノム5-hmCサイトはhescs36の活性エンハンサーで濃縮されています。 POU5F1とSOX2上流エンハンサーは5-hmCサイト（5kb以内）に隣接しているので、我々はエンハンサーのインターラクトームも5-hmcサイトで濃縮されているかどう 図４Ｂに示すように、５−ＨＭＣ部位は、初期のＤＮＡ複製領域におけるランダム部位と比較して、ＰＯＵ５Ｆ１およびＳＯＸ２相互作用点の近接性に富む（Ｐ＜ｄｉｖ ｉｄ＝”４ ６ｅ５ ８ｂ０ ４ｂ２”＞＜／ｄｉｖ＞２． したがって、hESCsにおける二つのエンハンサーのインターラクトームは、遺伝子転写の積極的な調節を容易にすることができる活性エンハンサーのエピジェネティックな特徴を持っています。
(a)相互作用するサイトとランダムなサイトの周りの異なるヒストンマークの箱ひげ図。 相互作用部位から±5kb以内のChIP-Seqタグを計数し、正規化した。 （Ｂ）最も近い５−ＨＭＣ部位への相互作用部位およびランダム部位の距離分布を比較した。 100,000ランダムなサイトは、比較のために初期のDNA複製領域から生成されました。
(a)相互作用する遺伝子のRPKM値の比較（相互作用部位から１ ０ｋｂ以下のＴＳＳを有する遺伝子）を、すべてのヒトエンサンブル遺伝子（エンコード中の複製ｒｎａ−ＳＥＱデータからの平均ｒｐｋｍ値を使用した）と一緒に （Ｂ）差動発現を分析して、ｈＥＳＣおよび胎児肺線維芽細胞における相互作用遺伝子を比較した。
POU5F1とSOX2エンハンサー相互作用遺伝子の転写状態
POU5F1とSOX2エンハンサーに関連付けられている遺伝子の転写状態を理解するために、我々はhESCsと胎児肺線維芽細胞におけるRNA-Seqトランスクリプトームデータを分析した37、10kb以内のTSSを持っている遺伝子に焦点を当てた。エンハンサー–相互作用サイト。 HESCでは、POU5F1およびSOX2エンハンサー相互作用遺伝子の発現は、hESCのすべての遺伝子の発現よりも有意に高い（P=7.5×10–6およびP=1。2×10-6は、それぞれ、対のないWilcoxon rank-sumテストによって;図5A)、インターラクトームが積極的に転写された遺伝子で富化されていることを示している。 したがって、活性POU5F1およびSOX2エンハンサーは、関連する遠位遺伝子の転写を仲介することに関与する可能性がある。 RNA-Seqトランスクリプトーム解析はまた、もともとhESCsにおける活性POU5F1とSOX2エンハンサーに関連付けられている遺伝子が分化した肺線維芽細胞でダウンレギュレートされていることを明らかにした（p=1.2×10-5とp=0.013、それぞれ、ペアWilcoxonランク-サム試験によって;図5B）。 これらの結果は，これら二つの幹関連遺伝子のエンハンサーがｈｅｓｃで高度に発現されるが線維芽細胞で抑制される遺伝子群と相互作用することを示している。
Pou5F1エンハンサーに関連付けられている遠位遺伝子は、多能性の調節回路に関与している
POU5F1とSOX2エンハンサー相互作用遺伝子がhESCsの自己再生と多能性に寄与するかどうかを探索するために、我々はhescs38のPOU5F1プロモーターレポーターアッセイを用いてゲノムワイドRNA干渉スクリーンからのデータを分析した。 トランスジェニックＰＯＵ５Ｆ１−ＧＦＰ発現の干渉を、幹性に関連する傾向を表すＧＦＰ蛍光強度を反映するＦａｖ値で定量する（図６Ａ）。 スクリーニングされたすべての遺伝子と比較して、POU5F1エンハンサー相互作用遺伝子（TSSから相互作用部位へのゲノム距離が10kb未満で、相互作用部位に最も近い遺伝子）は、統計的に有意ではないが、Fav値を減少させる傾向を示す（P=0.08、対のないWilcoxonランク–sum検定）。 しかし、ＳＯＸ２標的化遺伝子については、Ｆａｖ値は、スクリーニングされたすべての遺伝子に類似している（Ｐ＝０。98,unpaired Wilcoxon rank-sum test). したがって、これらのデータに基づいて、POU5F1interactomeの遺伝子は、SOX2interactomeの遺伝子よりも幹細胞の多能性のために重要であるように見えます。p>
(A)多能性とインタラクトーム遺伝子の相関。 HESCs中のPOU5F1-GFPレポーター遺伝子を使用してsiRNAアッセイでスクリーニングされた相互作用遺伝子は、分析のために含まれていた。 相互作用する遺伝子についてのＦａｖ値の分布（蛍光の変化）を、元のアッセイでスクリーニングされた全ての２ １ １ ２ ２遺伝子と比較する。 （Ｂ）ｈＥＳＣおよび胎児肺線維芽細胞における同定された転写調節因子の差動発現の分析。
遺伝子オントロジー分析39の39POU5F1相互作用遺伝子と20SOX2相互作用遺伝子は、それらのかなりの部分が転写調節に関与していることを明らかにした（30.8％と35.0％POU5F1とSOX2相互作用遺伝子は、それぞれ30.8％と35.0％）。; 補足表5、6）およびPOU5F1およびSOX2相互作用ドメイン内の8および4つの異なる相互作用ドメインにそれぞれ分配され、一つの相互作用ドメイン内の3つ以下の遺伝子を有する。 Hescsと胎児肺線維芽細胞におけるこれらの転写調節因子の差動発現解析は、HESCSにおける多能性調節ネットワークにおけるこれらの遺伝子のための積極的な役割を示唆し、HESCSにおけるより高い発現を有するPOU5F1インターアクトーム（11の12同定された転写調節因子は、RNA-Seqデータを有する）の9を明らかにした。 SOX2インターラクトームにおけるそれらの転写調節因子のために、3の5はhESCsにおける発現の増加を示した。 したがって、POU5F1エンハンサー相互作用体は、SOX2エンハンサー相互作用体よりも幹細胞多能性において大きな役割を果たす可能性がある。
いくつかの転写因子結合部位は、POU5F1およびSOX2エンハンサーのインターラクトームに濃縮されている
転写因子結合は、エンハンサーが所有 POU5F1とSOX2推定エンハンサーは、hESCsにおける複数のDNA結合タンパク質の会合のためのホットスポット知られています。 特定の転写因子がPOU5F1とSOX2エンハンサー相互作用領域に濃縮されているかどうかを理解するために、我々は体系的にhESCsにおける32DNA結合タンパク質のChIP–Seqプロファイルを分析した（方法を参照）。 4C相互作用部位の中心の周りの正規化されたChIP-Seqタグ数を計算し、箱ひげ図を用いて視覚化した（図7A）。 対照として、初期のDNA複製領域におけるランダム部位の中心周りのカウントも計算した。 統計解析では、ATF3、CTCF、GABPA、JUND、NANOG、RAD21およびYY1部位が、対照と比較して両方のエンハンサー相互作用点において最も濃縮されたタンパク質であった（P<0.01、対になっていないWilcoxランク-sum検定）。 しかし、多能性関連転写因子OCT4は、POU5F1またはSOX2インターラクトームのいずれかで濃縮されていません。 したがって、ATF3、CTCF、GABPA、JUND、NANOG、RAD21およびYY1は、HESCSにおけるPOU5F1およびSOX2エンハンサーインタラクトームにおける特徴的なタンパク質であり、その存在は機能的に重要である可能性がある。
(a)エンハンサー相互作用部位およびランダム部位（初期のDNA複製領域から）の周りの異なるDNA結合タンパク質の箱ひげ図。 相互作用部位から±5kb以内のChIP-Seqタグを計数し、正規化した。 （Ｂ）ＲＡＤ２ １は、インターラクトームにおいて他の転写因子と共局在化する。 Pou5F1とHESCSのSOX2インターラクトームのRAD21ピークサイトの周りの平均強度プロファイルは、転写因子ATF3、CTCF、GABPA、JUND、NANOGとYY1のためにプロットされています。
RAD21は、エンハンサー相互作用を媒介する他の転写因子と複合体に潜在的にある
図7Aに示すように、RAD21はhESCsのPOU5F1およびSOX2エンハンサー RAD21はDNAの鎖の架橋剤として知られている結合の複合体の部分です。 コヒーシンは、マウスES細胞におけるPou5F1遺伝子プロモーターとPou5f1遠位エンハンサーのループを仲介することが示されている40。 Rad21は、マウスES細胞identity40を維持する上でCtcfと他の転写因子と協力していることを以前の報告と一致して、HESCSのPOU5F1とSOX2インターアクトームの両方でRAD21 凝集プロットは、POU5F1およびSOX2相互作用点におけるRAD21部位の中心におけるATF3、CTCF、GABPA、JUND、NANOGおよびYY1結合プロファイルのピークシグナルを明確に示 マウスES細胞におけるGabpaのノックダウンはOct3/4発現を減少させることが知られているが、Gabpaの過剰発現は、マウスES細胞培養におけるLIFなしでもOct3/4の発現を維持する41。 Hescs38のゲノムワイドsiRNAスクリーンでは、rad21、CTCF、GABPA、JUND、NANOG、YY1などの濃縮タンパク質のほとんどのノックダウンは、大幅にfav値で、gfpレポーターにリンクされているトランスジェニックPOU5F1プロモーターの発現を減少させた。-1.50421, -1.05828, -1.44161, -1.07731, -1.82749, -2.57204, それぞれ（スクリーニングされたすべての遺伝子の上位25％以内）。 さらにクロマチン–クロマチン相互作用を理解するために、我々は、単一細胞レベルで二つのゲノム遺伝子座の共局在を可視化するためにDNA蛍光in-situハイブリダイゼーション（FISH）を適用しました。 12番染色体上のRARG遺伝子座は、hESCsのPOU5F1インターラクトームで同定されている。 RARGは最近、多能性において非常に重要な役割を果たすことが示され、2つの大きさによってiPS細胞誘導を増強することができる42。 POU5F1インターアクトームの一部ではない染色体12上の別の遺伝子座は、コントロールとして使用されました。 RARG遺伝子座（chr12）間の共局在頻度: 51751589-51956291）およびPOU5f1遺伝子座（chr6：31169844-31340561）は、対照遺伝子座（chr12：80380971-80564119）とPOU5f1遺伝子座（9.35％対5.61％、P<0.05、補足図。 3A）。 RARGとPOU5F1遺伝子座の間の高い接触頻度は、我々の配列決定データと一致しており、より安定な相互作用が二つの遺伝子座の間に形成されていることを示唆している。 ＲＡＲＧ遺伝子座および対照遺伝子座の検査（補足図。 3B）は、頻繁な共局在を有するRARG遺伝子座において、より多くのRAD21および他の転写因子結合部位が存在することを明らかにした。 複数の転写因子のrad21含有結合部位と染色体相互作用頻度の一致は、RAD21が長距離クロマチン-クロマチン相互作用を整理するために他の転写因子と協 したがって、RAD21は、一緒に複数の転写因子と、多能性ネットワークの一部としてhESCsにおけるPOU5F1とSOX2エンハンサーを囲む高次の染色体構造に貢献 しかし、4C-Seq研究から得られたこの仮説を確認するためには、追加の分子研究が必要である。