T細胞の活性化は、エフェクターとメモリ表現型分化に関連付けられているCD25とFoxp3の発現を誘導する
PBMCはブリオスタチン-1(5nM)で刺激された。イオノマイシン（１Μ Ｍ）（Ｂ／Ｉ）を、８ ０ｕ／ｍｌのｉｌ−２（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下、１ ６時間投与した。 B/I活性化は、それぞれプロテインキナーゼC活性と細胞内カルシウムを増加させることによってT細胞活性化をもたらす細胞内シグナルを模倣 細胞を３回洗浄し、４ ０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含む完全培地中で１ ０ ６細胞／ｍＬで３日間培養し、ｆｏｘｐ３の発現をフローサイトメトリー分析を用いて決定した。 Ｆｏｘｐ３の発現はまた、０日目に新たに単離されたＴ細胞についても決定した。 図に示すように。 図１Ａ（上部パネル）では、ＩＬ−２のみの３日間の存在は、０日目のベースラインレベルを上回るＦｏｘｐ３またはＣＤ２ ５の発現を顕著に増加させなかった（図１Ａ）。 1C）。 しかし、Ｂ／ｉ活性化は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ｔ細胞においてＦｏｘｐ３およびＣＤ２ ５の発現を誘導した（図３）。 1Aの中間のパネル）。 Ｂ／ｉ活性化の際に、ＣＤ４＋ＣＤ２ ５＋Ｆｏｘｐ３＋ｔ細胞を１％から２ ３％に増加させ（Ｐ＝０.０ １ ６）、ＣＤ８＋ＣＤ２ ５＋Ｆｏｘｐ３＋ｔ細胞を０.６％から９％に増加させ（Ｐ＝０.０ １ ３）、Ｂ／ｉ活性化の際に、ＣＤ４＋ＣＤ２ ５＋ＦＯＸＰ３＋ｔ細胞を１％から２ ３％に増加させた（ｐ＝０.０ １ ６）。 さらなる刺激なしにＩＬ−２の存在下で６日間培養を延長すると、ＣＤ４＋ＣＤ２ ５＋Ｆｏｘｐ３＋ｔ細胞が非活性化Ｔ細胞のベースラインレベルを上回る（１％対７％；Ｐ＝０． これらの結果は、ＣＤ４＋ＣＤ２ ５＋Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３の活性化誘導発現が、ＣＤ８＋ＣＤ２ ５＋ｔ細胞におけるそれよりも安定であることを示唆している。 Ｔ細胞の絶対数は、Ｂ／ｉ刺激およびＩＬ−２の存在下での増殖の３日後および６日後に増加した（図１）。 1B）。 抗CD3/CD28Absによる3日間のT細胞の活性化は、CD4+CD25+Foxp3+T細胞を0.4%から8.7%に増加させることによるB/I活性化と同様の結果を生じた(図 1C）。 Ｔ細胞の表現型分析は、Ｂ／ｉ活性化の前および６日後に、ＣＤ４ ４＋エフェクターおよびＣＤ４ ４＋ＣＤ６ ２Ｌ＋記憶表現型を明らかにした（図１）。 1D、トップパネル）。 エフェクター ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は活性化後に減少したが（それぞれ１ ８％〜９％および２ １％〜１ ３％）、記憶ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ｔ細胞は増加した（それぞれ８ ２％〜９ １％およ Ｂ／ｉ活性化時に、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４ ４＋、ＣＤ６ ２Ｌ＋表現型においてＦｏｘｐ３発現の６倍の増加を示した（ＣＤ４ ４＋：２． 加えて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が、０日目のＦｏｘｐ３Ｌｏｗ発現と比較して、活性化後にＦｏｘｐ３Ｈｉｇｈ発現を示した（図１ ０Ｂ）。 1D、中間および底パネル）。 全てのＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ｔ細胞はＣＤ４ ４を発現し、そのうちの８ ０％はまたＣＤ６ ２Ｌを発現した（図１ ０Ｂ）。 1D、中央パネル、右端）。 これらのデータは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の２ ０％がエフェクターであり、８ ０％が記憶表現型であることを示す。 同様の表現型の傾向がＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３＋ｔ細胞について検出され、１ ０ ０％のＣＤ４ ４＋が示され、うち６ ７％がＣＤ６ ２Ｌ＋Ｔ細胞であった（図３）。 1D、下のパネル、右端）。 これらの結果は、ＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の３ ３％がエフェクターであり、６ ７％が記憶表現型であることを示す。 データを図１に示す。 ＣＤ４ ４＋ＣＤ６ ２Ｌ−エフェクター Ｔ細胞の相対パーセントがＢ／ｉ活性化後に減少したので、エフェクター Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３Ｈｉｇｈの発現の増加は、細胞増殖よりも細胞分化に起因することを示唆している。 同様のメカニズムは、0日目にFoxp3Lowと比較して活性化後のFoxp3Highの発現のために記憶T細胞に存在する可能性がある。
T細胞活性化後のFoxp3発現。 健康なボランティアからｔ細胞を単離し，二つのグループに分割した。 対照群は未活性のままで、ＩＬ−２の存在下で３日間培養し（ａ；上部パネル）、別の群をＢ／ｉで１ ６時間活性化し、ＩＬ−２の存在下で３日間培養し（ａ；中央パネル）また プールされた試料上のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を、培養後０日目、３日目および６日目に、フローサイトメトリー分析（Ｂ）によって決定した。 Ｆｏｘｐ３およびＣＤ２ ５の発現を、新たに単離されたＣＤ４＋ｔ細胞（０日目）において、および抗ＣＤ３／ＣＤ２ ８Ａｂｓ（Ｃ）による３日間の刺激の後に決定した。 新たに単離し、Ｂ／ｉ活性化Ｔ細胞をフローサイトメトリーに供してＴ細胞表現型を決定した（ｄ；上部パネル）；ｆｏｘｐ３＋エフェクターおよびメモリー Ｔ細胞を、ゲートＣＤ４＋ｆｏｘｐ３＋細胞またはゲートＣＤ８＋ＦＯＸＰ３＋細胞中で決定した（Ｄ；下部パネル）。 代表的なデータは、重複した実験で二つのドナーから示されています。CD4+T細胞における活性化誘導Foxp3発現は、in vitroで調節機能を伝達するために失敗します
T細胞は、CFSEで標識し、B/I活性化CD4+CD25+Foxp3+の存在またＴ細胞（２：１および２ ０：１応答者：サプレッサー比）を３日間投与する。 フローサイトメトリー分析は、誘導性Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の非存在下または存在下で、ゲートＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の同様の速度を示した（図１ ０Ａ）。 および６ ５％対６ ０％および６ １％）である。 ＣＤ３／ＣＤ２ ８活性化はまた、レスポンダー ＣＤ４＋ｔ細胞においてＦｏｘｐ３発現を誘導した。 ゲート化されたＣＤ４＋Ｆｐｘｐ３＋ｔ細胞もまた、活性化時に７ ０〜７ ５％の増殖を示した（図１ ０Ａ）。 2A）。 Ｔ細胞アポトーシスの分析は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ｔ細胞の非存在下または存在下で、応答者Ｔ細胞において同様のアポトーシス速度を明らかにした（図１ ０Ａ）。 ５ ７および５ ９％）。 Ｂ／ｉ活性化ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞（７ ４〜７ ６％）の大部分は、応答者Ｔ細胞との共培養における抗ＣＤ３／ＣＤ２ ８活性化中にアポトーシスであることが見出された。誘導性ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ｔ細胞の存在下でのＴ細胞増殖。 共培養抑制アッセイを行うために、レスポンダー Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、異なる比率の誘導性Ｆｏｘｐ３＋ｔ細胞（２ ０：１および２：１）の非存在下または存在下で、抗ＣＤ３／ＣＤ２ ８Ａｂｓの存在下で３日間培養した。 ゲート化されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＦＳＥ希釈を示した（Ａ、左パネル）。 ３日間の活性化のためにＦｏｘｐ３を発現したレスポンダＣＤ４＋Ｔ細胞もゲート化し、ＣＦＳＥ希釈について分析した（Ａ、右パネル）。 共培養抑制アッセイ（Ａ、左パネル）から得られた細胞もまた、応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ、左パネル）およびＢ／ｉ活性化ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ｔ細胞（Ｂ、右パネル）におけるアポトーシスを決定するために、アネキシンＶについて染色した。
MLR中のT細胞の同種異系活性化は、エフェクター/メモリ表現型に関連付けられているCD4+CD25+T細胞におけるFoxp3発現を誘導する
我々は、T細胞におけるFoxp3発現の誘導がMLR中に安定であったかどうか、およびそのような誘導Foxp3+発現がT細胞増殖を阻害する可能性があるかどうかを決定するために8日間の同種MLRを行った。 レスポンダー細胞と刺激細胞は、異なる健康なドナーから得られた。 刺激細胞を照射し（５ ０ ０ ０ｒａｄ）、１ ０μ ＭのＢｒｄｕ（Ｂ Ｄ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で８日間応答細胞と共に培養した。 次いで、細胞を関連するＡ Ｂｓで染色し、フローサイトメトリー分析に供した。 図に示すように。 図３Ａ（上部パネル）ＣＤ４＋ＣＤ２ ５＋ｔ細胞の８ ６％およびＣＤ８＋ＣＤ２ ５＋Ｔ細胞の９ ３％が、細胞増殖の結果としてＢｒｄｕの取り込みを示した。 応答細胞または刺激細胞のみで増殖は検出されなかった（データは示されていない）。 このような同種増殖は、ＣＤ４＋Ｔ細胞において活性化誘導されたＦｏｘｐ３発現の存在下で行われ、その結果、ＣＤ４＋Ｔ細胞の８％がＣＤ２ ５＋ＦＯＸＰ３＋であった（図 図３Ａ、底部パネル）。 一方、ＣＤ８＋ＣＤ２ ５＋Ｔ細胞は、Ｆｏｘｐ３の安定な発現を示さなかった。 これらの結果は、図１の我々の観察と一致している。 ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３の発現が、Ｔ細胞活性化の６〜８日後のＣＤ８＋ｔ細胞における発現よりも安定であることを示す図である。 以前の報告では、in vitroでの抑制アッセイは、t細胞の活性化および増殖に対する抑制機能を決定するために、応答細胞に対するCD4+CD25+T細胞（Treg）の高比 応答細胞に対するＣＤ４＋ＣＤ２ ５＋Ｔ細胞の比率のこのような人工的な増加は、観察のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を低下させるであろう。 ＭＬＲ中に誘導されたＣＤ４＋ＣＤ２ ５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の頻度は８％であり、これは他の群によって報告された生理学的に関連する範囲内であると考えられる。 マウスの自然発生するTregの頻度はこの範囲のまわりにまたあります、けれども自己免疫の阻止のための調整する効果をもたらします。 ＣＤ４＋Ｔ細胞を発現するＦｏｘｐ３が何らかの調節機能を有していた場合、それはｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養中の細胞増殖を阻害していたはずである。 Ｂ／ｉ誘導性Ｔ細胞活性化と同様に、ＭＬＲ中のＴ細胞表現型は、ＣＤ４ ４＋エフェクター（１ ６％）およびＣＤ４ ４＋ＣＤ６ ２Ｌ＋記憶Ｔ細胞（８ ４％）を含んでいた（図４）。 3B）。 再び、全てのＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ｔ細胞はＣＤ４ ４を発現し、そのうちの９ ０％はまたＣＤ６ ２Ｌを発現した（図１ ０Ｂ）。 2B）。 これらのデータは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ｔ細胞の１ ０％がエフェクターであり、９ ０％が記憶表現型であることを示す。 同様の表現型の傾向がＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３＋ｔ細胞について検出され、１ ０ ０％ＣＤ４ ４＋を示し、そのうち７ ６％がＣＤ６ ２Ｌ＋Ｔ細胞であった。 これらの結果は、ＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の２ ４％がエフェクターであり、７ ６％が記憶表現型であることを示す。 これらのＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞における調節機能の欠如は、ヒト記憶Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３の発現がサプレッサー活性の低下をもたらしたことが報告されて さらに、Ｔｒｅｇ１型（Ｔｒ１）細胞は、Ｆｏｘｐ３発現の非存在下でサプレッサー機能を付与する。 マウスにおけるTreg系統のコミットメントと維持のマスターレギュレータとしてFoxp3の役割を考えると、それはヒトT細胞におけるTreg系統のコミットメント
同種異系MLRに続くFoxp3式。 細胞を、８日間ＭＬＲの後にフローサイトメトリーによって分析した。 ＢｒｄＵの取り込みを、ゲート化ＣＤ４＋ＣＤ２ ５＋またはＣＤ８＋ＣＤ２ ５＋ｔ細胞（ａ；上部パネル）で決定した。 ゲート化されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ２ ５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の検出のために分析した（ａ；底部パネル）。 ゲート化されたＣＤ４＋ｔ細胞（Ｂ；上部パネル）またはＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ；下部パネル）を、ＣＤ４ ４、ＣＤ６ ２Ｌ、Ｆｏｘｐ３の発現について分析した。 ＣＤ４ ４＋およびＣＤ６ ２Ｌ＋Ｔ細胞を、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋またはＣＤ８＋ＦＯＸＰ３＋ｔ細胞上でゲーティングすることによって決定した。 代表的なデータは、重複した実験で二つのドナーから示されています。
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