ビオチンとその結合パートナーアビジンは、一般的に異なる技術とプロトコルの配列の分子生物学で今日使用されて この記事では、ビオチン、ビオチン化、ビオチン-アビジン相互作用の発見と分子生物学におけるビオチン化の使用の自然な役割について説明します！
細菌融合タンパク質のin vivoでのビオチン化について学ぶ
ビオチンは生命に不可欠なビタミンです
ビオチンは分子生物学における役割で最も一般的に知られていますが、ビオチン（ビタミンHまたはビタミンB7）は最初に生命のためにすべての生物によって必要とされる必須補酵素です。 ビオチンは植物、ほとんどの細菌およびある菌類によってだけ総合されます、従ってほ乳類は外的な源を通してビタミンを得なければなりません。 ヒトは、そこに存在する微生物叢から小腸に必要なビオチンの大部分を吸収する。
ビオチンは、その活性形態で、ビオチンカルボキシラーゼおよびデカルボキシラーゼを含む主要代謝酵素の活性部位に共有結合している補因子である。 これらの酵素は、カルボキシル基の有機酸への移動を触媒し、重要な細胞代謝産物を産生する。 ビオチンは、一方の化合物から他方の化合物へのカルボキシル担体として作用する。 これらのビオチン依存性酵素は、糖新生、脂肪形成、アミノ酸代謝およびエネルギー伝達などのプロセスに不可欠である。ビオチン化は、ビオチンがタンパク質または高分子に添加される一般的なプロセスである。
ビオチン化は、タンパク質または高分子に添加される。
ビオチン化は、タンパク質または高分子に添加される ビオチンは酵素的または化学的に添加することができる。 酵素的ビオチン化は細胞内で自然に起こり、ビオチンが新たに合成された酵素の活性部位で特定のリジンと共有結合するプロセスである。 ビオチン蛋白質のリガーゼ(BPL)はこの非常に特定のポスト翻訳蛋白質の修正に責任があります。 ほとんどの生物は、ビオチン化されたプロテオーム全体に五つ未満の酵素を持っています。 例えば、大腸菌では、BPL、BirAは、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（BCCP）上の生物全体の一つのリジンのみをビオチン化する責任があります。
ビオチン-アビジン相互作用の発見
1930年代後半には、主に卵白の食事を与えた動物は、皮膚病変や他のひどい健康上の問題を発症することが観察された。 この病気は”卵白損傷”と呼ばれ、後にビタミンB7/ビオチンと改名されたビタミンHの欠乏によるものであると判断された。 卵白の傷害は彼らの食事療法がビオチンと補われていてもこれらの動物を苦しめる。 したがって、卵白の中の何かが、ビオチンが吸収されるのを隔離していました。 1940年、エズモンド-E-スネルはビオチン、アビジンの結合に関与するタンパク質を精製することができた。 アビジンは適切に鶏、”鳥”、から浄化された卵のために示されました。 Ｓｎｅｌｌは後に、アビジンが実際に精製されたアビジンをラットに給餌することによる卵白損傷の犯人であることを確認した（Ｋｒｅｓｅｇｅ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2004). アビジンは、それぞれビオチンの一つの分子を結合することができる四つの同一のサブユニットからなる糖タンパク質である。
ビオチンとアビジンは互いに非常に強い親和性を持っています。 実際には、それらの間の結合は、自然界に見られる最も強力な非共有結合タンパク質-リガンド相互作用の一つです。 結合が形成されると、pH、温度または有機溶媒の変化に影響されない。分子生物学におけるビオチンの使用
ビオチンは、それが添加される高分子に干渉しない比較的小さく、水溶性の分子である。 ビオチンにまたアビジンの結合場所に影響を与えないで反応種を作るために容易に処理することができる露出された側鎖があります。 これらの特徴すべてによって科学者が分子生物学および人間工学の為にアビジンとのビオチンそして強い相互作用を開発し始めたことは驚
ポリペプチドがビオチニル化されると（以下の詳細）、アビジンまたは1960年代に発見された構造的に類似したタンパク質であるstrepavidinとインキュベートまたは共発現させることができる。 次いで、ビオチン−アビジン複合体を、科学者の意図された目的のために使用および／または操作することができる。 実験室でのビオチン化の最も一般的な用途の2つは、タンパク質精製および免疫沈降実験である。 ビオチン化タンパク質または複合体は、アビジンで被覆されたカラムまたはビーズを用いて容易に精製することができる。 ビオチン-アビジン相互作用は、免疫組織化学および抗体標識における使用にも適応されている。
これらの実験では、ビオチンは、それぞれ関心のあるタンパク質または一次抗体を標的とする一次抗体または二次抗体に添加される。 次に、レポーターに結合したアビジンを反応物に添加して検出を容易にする。 アビジン上に見出される複数のビオチン結合部位は、これらの実験中のシグナル増幅にも理想的である。 検出の間に、自由なアビジンと前孵化するbiotinylatedレポーターの酵素はあなたのサンプルに加えることができる。 この複合体上の任意の遊離ビオチン結合部位は、あなたのビオチン化抗体に結合することができます。 これはレポーター信号およびより容易な検出の拡大をもたらす興味のあなたの蛋白質に区切られるビオチン-アビジンの複合体の大きいmeshworkを作成する。 この戦略は、アビジン-ビオチン複合体（ABC）免疫組織化学（IHC）と呼ばれています。 ABCとIHCの詳細については、Thermo Fisher Scientific’s guideをご覧ください。
ビオチンとアビジンのための他の分子生物学のアプリケーションの配列があります。 いくつかの他の一般的なアプリケーションの短いリストと関連する論文やwebページへのリンクを以下に示します。
- EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays)
- ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
- Southern/Northern Blotting
- Cell surface labelling
- Attaching polypeptides to a substrate
- Flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS)
- In situ hybridization
Methods for biotinylating your macromolecule of interest
To utilize the natural binding of ビオチンとアビジン、関心のある高分子は、最初にビオチン化する必要があります。 科学者たちは、in vitroとin vivoの両方で関心のある高分子を化学的にビオチン化するためのいくつかの方法を開発しました。
ビオチン化試薬：
ビオチンの露出した側鎖は、特殊な化学物質（ビオチン化試薬）を介してin vivoでアミノ酸官能基に架橋することができ それらが標的とする官能基または残基、ならびにそれらの溶解度が異なる様々なビオチニル化試薬が利用可能であり、したがって、異なる試薬は、異なる微小環境におけるビオチニル化のために有用である。 またbiotinylated蛋白質の特定の溶出と助けるべきリバーシブルおよびcleavable biotinylationの試薬があります。 どのビオチン化試薬を使用するかを決定するために、Thermo Fisher ScientificのBiotinylation Reagent Selection Toolをチェックしてください。
AviTagとBirA:
タンパク質は、Eの特異性を利用することによってビオチン化することもできます。
AviTagとBirA:
タンパク質は、Eの特異性を利用することによってコリコリ、ビラ。 あなたが思い出すならば、BirAは大腸菌のプロテオーム全体に一つのリジンだけをビオチン化します。 この知識を使用して、科学者はBirAの認識およびbiotinylationに必要な13のアミノ酸順序を識別しました。 この13アミノ酸配列は、AviTagと呼ばれます。 AviTagを使用すると、単にAviTagがタンパク質のN末端またはC末端のいずれかに付加される融合物を作成することによって、ビオチンで目的のタンパク質を標識することができる。 BirAは細菌、イースト、昆虫および哺乳類の細胞の蛋白質を表現するAviTagを効果的にbiotinylateするために示されていました。 Kayらをチェックしてください。,2009BirAとビオチニル化タンパク質に関する方法のために. あなたはAddgeneでAviTagとBirAの両方を含むプラスミドを見つけることができます！
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オリゴヌクレオチドラベリング：
ビオチンは、ビオチニル化プライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）中にDNA配列のいずれかの末端に添加 ビオチンはまたビオチンによって分類されるdUTPを使用してPCRの間に酵素的に組み込むことができます。 あなたの下流の適用によってオリゴヌクレオチドに加えることができる多数のタイプのビオチンのラベルがあります。 これらに限定されないが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ブロッティング（Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）および親和性結合（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）を含む多数の用途に使用することができる。
光ビオチン化：
光ビオチンは、DNAおよびRNAを非選択的に標識するために使用することができる。 酢酸光ビオチンは、光反応性アリールアジド基に結合したビオチン分子からなる。 強い可視光の下では、アリールアジド基は反応性になり、近くの核酸との結合を形成する（Ｍｃｉｎｎｅｓ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1990). 光ビオチニル化は、他の酵素法よりも容易で安価であることがある。 科学者は、固体基質にタンパク質またはポリペプチドを付着させるためにこの方法を一般的に使用している（Holden and Cremer、2003）。
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Addgeneブログの追加リソース
- 細菌融合タンパク質の生体内ビオチン化
- ビオチンがスプリットバイオイドでどのように使用されているかを学ぶ：タンパク質-タンパク質相互作用を研究するための改良された方法
- ビオチンがCRISPRでどのように使用されるかを学ぶ