ホスホリラーゼキナーゼの活性化には、プロテインキナーゼAによるβサブユニットのリン酸化とca2+のδサブユニットへの結合が必要である。
この酵素は、可逆的リン酸化とアロステリック調節の2つのプロセスによって調節される。
前者では、プロテインキナーゼA（PKA）が決定的な役割を果たす。 これは最初に弱く活動的なホスホリラーゼのキナーゼのβサブユニットに隣酸塩グループを移します。 その結果、キナーゼの活性レベルが増加する。 PKA自体は、第二のメッセンジャー、キャンプによって非アクティブなフォームから活性化されます。 CAMPリリースの一つの理由は、アドレナリンやグルカゴンなどのホルモンの存在です。
しかしながら、ホスホリラーゼキナーゼは、Ca2+レベルの増加によって部分的に活性な形態に活性化することもできる。
カルシウムセンサーはカルモジュリンであり、これは酵素のδサブユニットに対応する。
ホスホリラーゼキナーゼのβサブユニットの両方がリン酸化された形態で存在し、カルモジュリンがδサブユニット内に結合したカルシウムイオンを有する場合、酵素は完全に活性である。