土壌細菌群集構造、多様性および機能の駆動力温帯草原および森林における土壌細菌群集構造、多様性および機能の駆動力

土壌試料の一般的な特性

土壌試料は、土壌組織およびエダフィック特性に関して有意な差を示した(表1、補足材料表S1およびS2)。 森林土壌は草地土壌よりも酸性であり，Ｃ：Ｎ比が高く，粘土量が少なかった。 異なる探査から得られた森林土壌試料は，測定されたすべてのエダフィック特性に有意差を示した。 Ｓｃｈｏｒｆｈｅｉｄｅ-Ｃｈｏｒｉｎ森林土壌はｈａｉｎｉｃｈ-ＤｕｎおよびＳｃｈｗａｖｉｓｃｈｅａｌｂ土壌に比べてより酸性であり，ｃ：Ｎ比が高かった。 さらに，Ｓｃｈｏｒｆｈｅｉｄｅ-Ｃｈｏｒｉｎ森林土壌は，すべての探査所の中で最も重量比の低い含水量，粘土およびシルト量を示した。

異なる探査から派生した草原土壌サンプルも、すべての測定されたエダフィック特性の間に有意差を示した。 Ｈａｉｎｉｃｈ-Ｄｕｎ草原土壌は，Ｓｃｈｏｒｆｈｅｉｄｅ-ＣｈｏｒｉｎおよびＳｃｈｗａｖｉｓｃｈｅａｌｂ土壌と比較して，最も高いｐｈ値，最も低い重量水分content有量および最も高いシルト量を有し，有意差はなかった。 Ｓｃｈｏｒｆｈｅｉｄｅ-Ｃｈｏｒｉｎ草地土壌は他の二つの探鉱所に比べて最も高いＣ：Ｎ比と砂量を示した。 粘土量はＳｃｈｏｒｆｈｅｉｄｅ-Ｃｈｏｒｉｎ草地土壌で最も低く，次いでＨａｉｎｉｃｈ-Ｄｕｎ土壌であった。 最も高い粘土量はＳｃｈｗａｖｉｓｃｈｅａｌｂ草地土壌について決定した。 異なる管理レジーム間の土壌パラメータの有意差は記録されなかった（ANOVA,p>0.5すべてのケースで）。

土壌細菌群集

土壌細菌群集の組成と多様性は、16S rRNA遺伝子のパイロタグシークエンスによって評価されました。 品質フィルタリング、ノイズ除去、および潜在的なキメラと非細菌配列の除去の後、約2,700,000 525bpの平均読み取り長さと高品質の配列は、さらなる分析のた 全ての配列は門レベル以下に分類された。 リッチ推定量データ（Michaelis-Menten fit）に基づく; 補足材料表S3)78-88%の操作分類学単位(OTUs)の80%の同一性(門レベル)と27-55%のOTUsの97%の同一性(種レベル)の調査努力によってカバーされました(希薄化曲線については、補足材料Fig S1およびS2を参照)。

得られた配列は203,530OTUs（97％の同一性）にクラスター化され、51の細菌門、574の注文と1,215の家族に割り当てられました。 支配的な門とプロテオバクテリアクラス（>すべてのサンプル間のすべての配列の1％）は、アクチノバクテリア（23.75％±8.55％）、アルファプロテオバクテリア（20。43%±5.21%)、アシドバクテリア(18.39%±9.19%)、デルタプロテオバクテリア(7.22%±2.84%)。 Bacteroidetes(5.15%±2.60%)、Chloroflexi(5.09%±2.10%)、Betaproteobacteria(4.64%±2.38%)、Gammaproteobacteria(4.32%±1.23%)、Gemmatimonadetes(1.88%±0.92%)、Firmicutes(1.18%±3.20%)、およびNitrospirae(1.14%±2.20%)％±1.10％）。 これらの系統発生群は全ての試料中に存在し、この研究で分析された全ての配列の９ ５％以上を占めていた（図１ ０Ａ）。 1). これらの結果は、草原24と温帯ブナ林25に関する以前の研究と一致しています。 最も豊富なフィロタイプ（3.99％±2。44）は、アシドバクテリアのサブグループ6の未培養のメンバーである。 属に割り当てることができる五つの最も豊富なphylotypesは、それぞれ、すべての配列のBradyrhizobium（2.66％±1.45％）、Candidatus Solibacter（2.00％±1.86％）、Haliangium（1.39％±0.74％）、Variibacter（1.36％±0.58％）とGaiella（1.34％±1.31％）です。

土壌細菌の多様性とコミュニティ構成の生物地理的変化

多様性（シャノン指数H’で表される）と土壌細菌のコミュニティ構造（PERMANOVA、P<0.001）は、三つの生物多様性探検所の間で異なっていた。 Hainich-Dün探索は、Schorfheide-Chorin（H’=9.72）およびSchwäbische Alb（H’=9.92）と比較して、最も多様な細菌群集（H’=10.22）を保有していた。 さらに、草原土壌は森林土壌よりも有意に多様であり（H’=10.12およびH’=9.48、それぞれP<0.001）、これはNackeおよびcolleagues9の以前の知見を支持し、細菌群集は門レベルで草原でより多様であることを報告した。 森林土壌由来のサンプルは草地土壌サンプル（P<0.001）よりも酸性であったため、pHの違いは多様性の違いを説明するかもしれません（表1）。

完全なデータセットの最も支配的な細菌の順序は、三つの探検にわたってそれらの分布が異なっていた。 これらの違いは、おそらく探検家のedaphic特性の違いから生じた。 そこで，Ｂｒａｙ-Ｃｕｒｔｉｓ非類似度に基づくＮＭＤＳ解析により環境因子の相関を試験した。 Edaphic特性を叙階に当てはめると，ｐｈがコミュニティの最強のドライバーとして明らかになった。 制約としてpHを使用した追加の標準対応分析（CCA）は、pHがコミュニティ構造の変化の26％を説明することを示した（P<0.001、補足図S3）。 さらに、サンプリング領域（PERMANOVA、P<0.001）と二つの土地利用タイプの草原と森林（PERMANOVA、P<0.001）（補足図S4）によって土壌細菌 したがって、我々は、各探索における細菌群集の構造の変化を駆動する要因の詳細な分析に興味を持っていた。 さらに、両方の土地利用タイプのコミュニティ構造が強く分離されているため、草原と森林の間でデータを分割しました。

細菌群集のキードライバー

各探索における各土地利用タイプの土壌細菌群集構造のキードライバーを特定するために、我々は六つのサブセットのNMDS 土壌pHが唯一の特性であり、各サブセットのコミュニティ構造に影響を与えました（図1）。 2). 草原や森林のコミュニティ構造に影響を与えるもう一つの特性は、細孔サイズ、水とガスのフラックス、および栄養素の利用可能性を表す土壌の質感（粘土、砂、および/またはシルトの量）であった26、27。 さらに、土壌の質感は、ニッチの分離と捕食からの保護のために重要です28。

草原土壌では、C：N比はSchwäbische AlbおよびSchorfheide-Chorinの細菌群集構造に影響を与えたが、Hainich-Dünでは影響を与えなかった。 これは、土壌細菌群集に関するPFLAベースの研究によって支持されており、土壌組織、pH、CおよびN濃度などのエダフィック特性が土壌細菌群集の構造化に関与していた10。 土地利用強度指数（LUI）はSchwäbische Alb草原コミュニティとのみ相関していた。 しかし、LUIは受精の原因ではなく、量を占めています。 Schwäbische Alb草原では、ほとんどのプロットは有機肥料（肥料、糞）を受けましたが、Hainich-DünとSchorfheide-Chorinの受精はミネラル肥料の施用によって支配されました。 これらの知見は、有機肥料を受けている農業システムの土壌微生物群集が、従来の鉱物施肥システムおよび制御土壌のものと比較して異なっていた最近の研究を支持している29。 GeisselerとScow30と一致して、長期的な鉱物肥料施用による細菌群集構造の変化を示唆する明確な傾向は、私たちの調査では見つかりませんでした。

森林土壌では、樹種はすべての探検で細菌のコミュニティ構造と相関していたが、林業管理指数（SMI）はSchorfheide-Chorinのコミュニティ構造に有意に影響した（Fig. 2). 広葉樹（ブナとケルカス）と針葉樹（マツとピシア）の木の下の土壌細菌群集は、異なるパターンを形成した。 これは、以前の研究の結果に従っています9,20。 Nacke et al.9は、Schwäbische Albに由来する土壌サンプルのサブセットを分析し、ブナ（ブナ）とトウヒ（ピケア）の下で細菌のコミュニティ構造が異なることを発見しました。 これは、針葉樹と広葉樹の下の細菌群集を比較した研究と一致しています20。 広葉樹間の土壌群集構造の違いは、ブナ対ティリアとAcer31のために記載されているが、我々は、二つの広葉樹種の違いを観察しませんでした。 これらの効果は、部分的に土壌の酸性化の減少とティリアとAcer32の葉リターの高い回転率によるものである可能性があります。 トウヒ（Picea abies）やマツ（Pinus sylvestris）などの針葉樹種は、土壌pHを有意に低下させることが知られている（ref. 33)常緑樹のくずの特別な化学構造または大気酸性compounds34の捕獲が原因で。 これは土の細菌に対する間接pHの効果で起因します。 さらに、これは、樹種が分析されたすべての森林サンプルにおける細菌群集の構造化に重要な役割を果たす理由の一つである可能性がある。

同じ土地利用の下で細菌のコミュニティ構造と多様性が同様の方法で影響されるという仮説によれば、シャノン指数（H’）で表される細菌の多様性を、異なる管理レジーム間で比較した（補足資料表S4）。 ＳｃｈｗａｂｉｓｃｈｅａｌｂとＳｃｈｏｒｆｈｅｉｄｅ-Ｃｈｏｒｉｎの樹種について多様性の違いが検出された。

興味深いことに、草原（牧草地、牧草地、牧草地）および森林（管理されていない森林、年齢-lass森林、選択森林）の管理体制は、細菌の多様性に有意な影響を示さなかった（PERMANOVA、P<0.05）。 これは、Willらによる以前の研究とは対照的である。22、WhoはHainich-Dünの低い土地利用の強度の牧草地の土のより高い細菌の多様性を見つけました。 対照的に、Ｔａｒｄｙ ｅ ｔ ａ ｌ．17は、土地利用強度の勾配に沿って細菌の多様性を調査し、適度に管理された土壌で最高の細菌の多様性を観察した。 著者らは、この効果が細菌群集のストレス応答に関連していることを示唆している。 ストレスの高い環境では、土地利用強度が高い場合と同様に、競争力のある種の優位性と競争力のある排除のために多様性が減少し、ストレスのない環境では、選択による適応種の優位性によって多様性が減少する。 我々の仮説によれば、pHなどの土壌条件は、一貫して細菌群集構造と多様性を駆動するが、管理体制と土地利用強度は有意な影響を及ぼさないことが さらに、我々は、pHが細菌群集の最良の予測因子であることを示すことができた。

草地および森林土壌における細菌機能

我々はさらに、細菌機能が細菌群集構造および多様性と同様の方法で駆動されたと仮定した。 この仮説を明らかにするために、我々は炭素、窒素、リン、硫黄の循環に関与する経路に焦点を当てた（Fig. 3)そして、二つの土地の間の主要な酵素コード遺伝子の相対的な存在量を比較した草原と森林を使用しています。 酵素コード遺伝子の存在量は、新規バイオインフォマティックツールTaxa4Fun23に由来した。 Tax4funは、16S rRNAコピー数（NCBIゲノムアノテーションから得られる）によって正規化されたKEGG生物の分類学的プロファイルにシルバベースのOtuを変換します。 土壌には未知の生物や未培養生物が生息しているため、すべての16S配列がKEGG生物にマッピングできるわけではありません。 Spearman相関解析全体メタゲノームシーケンシングから派生した機能プロファイルと16S rRNA遺伝子配列から推定されたプロファイルのsoils23 0.8706の相関係数の中央値を明らかにした。 これはtax4Funがmetagenomic散弾銃の配列決定のアプローチから得られる機能プロフィールによい近似を提供することを示した。 メタゲノムショットガンシーケンシングによって大規模なサンプルセットの各サンプルの代表的なカバレッジを達成することは困難な作業にな

C、N、S、およびPのサイクルに関与するほとんどの主要な酵素コード遺伝子は、草原または森林土壌でより豊富である（Mann-Whitney test、P<0.05、補足材料表S5）。 例えば、酸ホスファターゼをコードする遺伝子は1で観察された。アルカリホスファターゼは反対の傾向を示したが、森林土壌の機能プロファイルの4倍の高い存在量は、草原土壌よりも。 我々は、pHが細菌群集の最良の予測因子であることを示したので、この効果は土地利用タイプ間のpHの差に起因する可能性があると仮定する。 ウレアーゼをコードする遺伝子は、草原で1.2倍より豊富であった。 これらは部分的に肥料や糞で受精されたり、動物によって放牧されたりしたので、尿素の利用可能性は草原サンプルで高かった。 キチナーゼ遺伝子も1つを示した。森林土壌と比較して草原で2倍高い豊富さ。 これは、このグループがキチナーゼ遺伝子の数が多いことが知られているので、草原土壌中のアクチノバクテリアの豊富さが高いことに起因する可能性がある35。 多芳香族炭化水素（PAH、ここではリグニン）分解に関与する遺伝子は、草原でより豊富である。 森林系では、このプロセスは主に木質バイオマスを分解することができるリグニン分解真菌（主にサプロトロフィック担子菌）によって行われる36。 好気性メタン酸化のための一つの重要な酵素であるメタノール脱水素酵素は森林土壌で特に豊富であった。 森林土壌中のメタン酸化は、大気中のメタン4の最大の生物学的シンクであり、したがって、この温室効果ガスのフラックスに重要な役割を果たし さらに、脱窒の最後のステップを触媒し、Ｎ２ＯをＮ２に還元する亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）還元酵素もまた、森林土壌中でより豊富である（データは示さない）。 これらの結果は、温暖な森林生態系がメタンの規制と除去に重要な役割を果たすだけでなく、温室効果ガス亜酸化窒素の重要な役割を果たすことを示している。興味深いことに、窒素固定の重要な酵素、ニトロゲナーゼは、森林土壌よりも草原ではあまり豊富ではありません。

興味深いことに、窒素固定の重要な酵素、ニトロゲナーゼは、森林土壌 本研究では，バルク土壌のみをサンプリングしたため，おそらく自由生活性窒素固定細菌のみが検出できた。 森林系では自由生菌による窒素固定が大きな役割を果たしているのに対し，本研究ではカバーされていなかった共生細菌や根圏細菌が草地系での窒素固定の大部分を担っている可能性がある。

得られた結果は、異なる土地が異なる細菌集団のために選択するだけでなく、その細菌集団内の特定の機能的形質のためだけでなく、草原や森 本研究で分析した草原や森林は長期的に確立されたシステムであるため、同様の適応がより若いシステムにも存在するかどうかを評価することは

土壌pHは、細菌群集の最良の予測因子である

本研究では、phに関係なく、探索と土地利用の細菌群集に影響を与えた唯一の要因であった。 さらに，それは細菌群集構造だけでなく，土壌細菌の機能的プロファイルにも影響を与えた。 すでに述べたように、CCA分析は、pHがコミュニティプロファイルの総分散の26％を説明することを明らかにした（補足図S3）。 したがって，ｐｈは細菌群集構造の最も強い予測因子であった。

私たちは、細菌のコミュニティ構造と機能が同様の方法で形成されると仮定しました。 Tax4Fun由来の機能プロファイルとの環境相関を、Bray-Curtisの非類似度に基づいてNMDSによって試験した（図10B）。 4). 結果はコミュニティ構造で得られた結果と同様である。 PHは、機能プロファイルの形成に重要な役割を果たし、分散の32％を説明した（CCAによって試験された、P<0.001、補足図S5）。 これは、細菌群集の構造と機能が同様のメカニズムによって形成されているという仮説を支持する。 機能プロファイルはまた、草原と森林システムの間の分離を示した。