変形性関節症のウサギモデルにおける軟骨分解に対するDu-Huo-Ji-Sheng-Tangの作用機序

要約

Du-Huo-Ji-Sheng-Tang（DHJST）は、変形性関節症の治療に使用される伝統的 本研究では，変形性関節症のウサギモデルにおける軟骨分解に対するＤＨＪＳＴの治療効果を検討した。 ウサギの膝関節において，実験的変形性関節症を誘発するために前十字靭帯切離（ＡＣＬＴ）を行った。 第六週の終わりに、ACLTを持つ30ウサギは、別の4週間続いた六つのグループ、対照群、DHJST群とオサミネタシン（OSA）群に分けられました。 ACLTとウサギの他の三つのグループは、6週間後に犠牲にされたDHJSTまたはOSAで未処理であり、6週間のタイムポイントコントロールとして役立った。 その結果，手術後六週の終わりに，対照群では正常群に比べて有意な組織学的変性が認められた。 対照群では、組織学的変性の平均スコアは10週目にさらに増加し、DHJST群では対照群に比べて組織学的変性の平均スコアが有意に低かった。 潜在的なメカニズムを研究するために、VEGFおよびHIF-1αの発現レベルを検出した。 VEGF mRNAおよびHIF-1α mRNAの発現は正常群では低く、対照群では活性が徐々に増加する。 しかし、同じ時点モデル群と比較して、VEGFおよびHIF-1αの活性はDHJST群で有意に減少した。 結論として、DHJSTは変形性関節症のウサギに有意な治療効果を発揮し、メカニズムはVEGFとHIF-1α発現の阻害に関連付けられています。

1. はじめに

変形性関節症（OA）は、罹患した個体に臨床的に現れるまでに何年もかかることがある進行性および衰弱性疾患である。 軟骨の老化と軟骨細胞の老化は、OAの病因と発達に重要な役割を果たしています。 OAの開発の間に、頻繁に細胞死の焦点増加があります。 軟骨細胞の老化は、軟骨細胞が関節軟骨組織を維持および修復する能力を低下させることによって、軟骨変性のリスクに寄与することが多くの報告 各軟骨細胞は周囲の細胞外マトリックスの維持に関与しており、組織の一つの領域で産生されるマトリックス分子は組織を横断する能力が非常に限られていると理論化されているため、生存可能な細胞の焦点損失は、組織の軽度の損傷を修復することができないことに部分的に関与している可能性がある。

現在、OAの治療法はなく、利用可能な治療法は病気の進行を遅らせるだけです。

現在、OAの治療法はありません。

過去20年間、伝統的な中国医学（TCM）は、患者の臨床所見を改善し、炎症反応および軟骨変性を阻害するなど、OAに対して有意な進歩を見てきました。 生体内および生体外の調査はまた中国のハーブの方式がOAに対して多数の広範囲の行為であることを示しました。 基数Angelicae Pubescentis、Herba Taxilli、Herba Taxilli、基数Acanthopanacis Bidentatae、Herba Asari、基数Gentianae Macrophyllae、皮質CinnamomiおよびPoriaで構成されるDu-Huo-Ji-Sheng-TangはOAの処理のために広く利用されています。 それは患者のための臨床徴候、膝機能および生活環境基準を改善できます。 ＴｃｍにおけるＯ Ａ病因に関する知見に基づいて，ウサギにおけるＯ Ａの軟骨変性の予防に及ぼすＤＨＪＳＴの影響を調べ，そのメカニズムを観察した。

2. メソッド

2.1. デッドエンド比色アポトーシス検出システム（ＴＵＮＥＬアッセイ）は、Ｎａｎｇｉｎｇ Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｃｈｉｎａ）から入手した。 Ｔｒｉｚｏｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅ Ｘ ＴａｑｔｍおよびＰｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ｋｉｔは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃ Ｏから購入した。 （米国）。 DJSTのハーブ（上海Huayuの中国のハーブCoによって提供される基数のAngelicaeのPubescentis、HerbaのTaxilli、HerbaのTaxilli、基数のAcanthopanacisのBidentatae、HerbaのAsari、基数のGentianaeのMacrophyllae、皮質のCinnamomiおよびPoriaで構成される。 (株)、中国）は伝統中国医学の上海の市立病院によって準備された標準的な議定書に従ってpharmacognosistによってみなされていました部品は比率と順序での混合されま2 : 1 : 1 : 1 : 0.2 : 1 : 0.3 : 1 (乾燥重量）を用いて、薬物を中国薬局方（中国薬局方および委員会、2000）に従って標準的な方法で抽出した。 これらの生薬を蒸留水に浸漬し、30分間二回煮沸し、薬液をメッシュで濾過した後、濾液を真空ポンプで4g mL−1に濃縮し、使用まで-20℃で保存した。 Osaminethacine（OSA）は、各タブレット25mgのインドメタシンおよび75mgのaminoglucoseを含んでいます（河北Jizhong薬剤Co.によって供給されて。 (株)、中国）は、陽性対照薬として使用された。

2.2. ウサギと組織の準備

四十から八ヶ月齢のニュージーランドの白いウサギは、中国科学院に実験動物センターによって供給されました。 全身麻酔下に片側前十字靱帯切除術（ＡＣＬＴ）を施行した。 正常なウサギは処置を受けなかった。

第六週の終わりに、ACLTを有する30匹のウサギを、対照群、DHJST群およびOSA群の六つの群に分け、さらに4週間続いた。 ACLTとウサギの他の三つのグループは、6週間後に犠牲にされたDHJSTまたはOSAで未処理であり、6週間のタイムポイントコントロールとして役立った。 煎じ薬は投与量0で経口投与した。923g(kg−1·d−1)を4週間、osa群のウサギにOSA0.09g(kg−1·d−1)を4週間投与し、モデル対照群と正常群に同量の生理食塩水を経口投与した。

ウサギはサンプリングのために犠牲にされました。 このプロトコルは、中国上海市の大学医療センターの動物実験委員会の承認を受けた。 ウサギ脛骨を除去し、脛骨関節軟骨を直ちに-80℃で保存した。 脛骨は慎重に解剖され、隣接する筋肉からクリアされ、すぐに10％ホルマリンで24時間固定されました。 脛骨はその後、4週間100g/Lエチレンジアミン四酢酸で脱灰し、PBSで洗浄し、一連のエタノールを介して脱水し、適切な配向を確実にするために標準化された方法でパラフィンに埋め込まれた。 パラフィン組織切片（7μ m）は、標準化された方法で切断した。 組織化学的分析のために切片を脱脂した。2.3.

軟骨の組織学的評価

組織学的評価は、DHJST群、OSA群および対照群のウサギの大腿骨関節に対して行われた。 切片をＳａｆｒａｎｉｎ Ｏ−ｆａｓｔ ｇｒｅｅｎで染色した。 各部位からのこれらの組織学的切片は、二人の独立した、ボード認定獣医病理学者によって修正されたMankinグレーディングシステム（表1）を使用して評価され tr>

スコア 構造 軟骨細胞損失 サフラニンO-高速グリーン染色 サフラニンO-高速グリーン染色 サフラニンo-高速グリーン染色 サフラニンO-高速グリーン染色 サフラニンo-高速グリーン染色 サフラニンo-高速グリーン染色 サフラニンo-高速グリーン染色 サフラニンo-高速グリーン染色 サフラニンO-高速グリーン染色 サフラニンO-高速グリーン染色 サフラニンO-高速グリーン染色 サフラニンO-高速グリーン染色 サフラニンO-高速グリーン染色 サフラニンO-高速グリーン染色 サフラニンO-高速グリーン染色>tidemark整合性 0 正常 細胞の減少なし 関節軟骨全体の均一な染色 無傷 1 表面凹凸 細胞の最小減少 染色損失顆の長さの半分以下のための表面的なゾーンで 2 > 細胞の中程度の減少 顆またはプラトーの長さの半分以上の表面ゾーンにおける染色の損失 3 3 1-3表在裂 細胞の著しい減少 顆またはプラトーの長さの半分未満の表在および中間ゾーンにおける染色の損失 4 1-3中間ゾーンに延びる裂け目 1-3中間ゾーンに延びる裂け目 非常に 細胞の広範な減少 顆またはプラトーの長さの半分以上のための表在および中間ゾーンにおける染色の損失 5 深いゾーンに延びる1-3裂 三つのゾーンすべてにおける染色の損失 6 石灰化した軟骨に伸びる裂け目 顆またはプラトーの長さの半分以上の三つのゾーンすべてにおける染色の損失

2.4. Ａｐｏ−Ｄｉｒｅｃｔｔｍキット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ Ａ）を用いて、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ＤＵＴＰ ｎｉｃｋ末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイを実施することにより、Ｈ２Ｏ２誘導アポトーシスを検出した。 TUNELは製造業者の指示に従って行った。 簡潔に述べると、前処理およびＨ２Ｏ２への曝露の後、細胞を回収し、洗浄し、固定し、透過処理し、ＤＮＡ鎖切断について標識した後、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ Ｅｌｉｔｅ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＵＳＡ）で分析した。 すべてのアッセイは三連で行った。2.5.

蛍光定量PCR

Trizol試薬を用いて関節脛骨の軟骨50mgから総RNAを抽出した。 Ｒｅｖｅｒｔ Ａｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔに含まれるランダムプライマーおよび試薬を用いて、試料あたり４μ ｇの全ＲＮＡを用いてｃＤＮＡの合成を行った。 各試料の２マイクロリットル（２μ ｌ）を、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ２ ０ ０ ０ｓｙｓｔｅｍ（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）においてリアルタイムＰＣＲに使用した。 相対定量は、デルタサイクル閾値（）相対定量を使用して計算した。 内因性対照CAPDH mRNAおよび標的シグナルの閾値サイクル（）を決定し、血管内皮増殖因子（VEGF）に使用されるプライマーの

配列が5′-TGCCCACCGAGGAGTTCA-3（順方向）および5′-GGCCCTGGTGAGGTTTGAT-3（逆方向）（生成物長：75bp）である比較法を用いて相対RNA定量を計算した。低酸素誘導性因子−１α（ＨＩＦ−１α）に使用されるプライマーの配列は、５’−ＣＡＧＴＧＣＡＡＡＡＧＡＣＡＧＧＴＧＧＡＡＧ−３（順方向）および５’−ＣＣＣＴＧＴＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴ−３（逆方向）（生成物長さ：１ ０ ７ｂｐ）である。ＧＡＰＤＨに使用されるプライマーの配列は、５’−ＣＣＧＡＧＧＧＣＣＣＡＣＴＡＡＡＧＧ−３（順方向）および５’−ＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＡＣＡＧＧＡＧＡＣＡＡ−３（逆方向）（生成物長さ：８ ８ｂｐ）である。2.6.

2.6. 統計分析

すべての結果は、平均および標準偏差（SD）として表されました。 測定データは、分散の一元化分析（Ａ ＮＯＶＡ、ＳＰＳＳ１ １． ランクデータは、ｒｉｄｉｔで分析した。 P<の結果。05は統計的に有意であると考えられた。

3. 結果

3.1. ウサギにおけるACLT誘発組織学的変性はDHJSTによって減少した

代表的な組織学的切片を図1に示す。 10週目の終わりに、我々は正常なグループで関節表面の正常な完全性を観察した（図1（a））。 対照群では、変性が増加すると、中および深部に広がる裂け目形成に伴うサフラニンO-fast green染色の損失があり（図1（b））、DHJST群では、早期の軽度の線維化に伴って失われ、軟骨細胞のクラスタリングとともにサフラニンO-fast green染色の損失が観察された（図1（c））。 OSA群は、サフラニンO-fast green染色の喪失を伴い、これらの変化はDHJST群と同様であった（図1(d))。 手術後6週目の終わりに、対照群には正常群と比較して有意な組織学的差異があった（P<。01). 対照群では、Ｓａｆｒａｎｉｎ ｏ−ｆａｓｔ ｇｒｅｅｎ染色の平均スコアは、６週目のそれと比較して１ ０週目にさらに増加した（Ｐ＜ｄｉｖ ｉｄ＝”５ ６ ５ ９ｃｅｄ３ １ｆ”＞＜／ｄｉｖ＞。01)(図2(a))。 第10週末には、対照群とDHJST群の間でマンキンスコアに有意差があり、DHJST群のサフラニンO-fast green染色の平均スコアは対照群と比較して有意に低かった（P<。（図２（ｂ））、およびＤＨＪＳＴ群とＯＳＡ群との間のマンキンスコアに統計的に有意な差はない（Ｐ＜div id=”１ １ ８ｂ７ １ ６ ９ ６ ４”>）。05).

3.2. DHJSTは軟骨細胞のアポトーシスを阻害した

手術後の第六週の終わりに、正常群と比較して対照群のアポトーシス細胞の指標は有意に差があった（P<。01). 対照群では、アポトーシス細胞の指標は依然として大幅に増加した（第六週の平均±SD0.35±0.13から0.62±0.10第10週に;P<。01)(図2(c))。 10週目の終わりに、DHJST群と比較して、対照群でアポトーシス細胞の指標が著しく増加する（P<。01)(図2(d))。 Osa群とDHJST群の間にアポトーシス細胞指数に有意差はなかった（P>。05).

3.3. 軟骨細胞におけるVEGFおよびHIF-1α発現の阻害は、DHJSTに関連して治療効果を発揮する

蛍光定量PCRは、VEGF mRNAおよびHIF-1α mRNAの発現は正常群では低いことを示したが、活性は正常群と比較して対照群で徐々に有意に増加する（P<。01);対照群では、関節軟骨細胞におけるHIF-1αは、手術後の第六週に増加し始め、第六週のそれと比較して第10週にさらに増加する(平均±SD94.21±20.12週目、160.35±72.27週目、10週目;P<。05）（表2）。 第10週末に、DHJST群におけるVEGF mRNAおよびHIF-1α mRNAの発現は、投与後の対照群と比較して有意に減少した（P<。01). OSA群のVEGF mRNAおよびHIF-1α mRNAレベルは、対照群のそれと比較してOSA治療の4週間によって低下する傾向があったが、有意差はなかった（表3）。

4. 議論

ACLTモデルは、OAの最も広く使用されている実験モデルの一つです。 疾患の発症が急速であるため、ウサギACLTはOA研究でますます使用されています。 ACLの破裂はヒトで起こり、OAの発症にもつながるので、実験的なACLTモデルの使用は特に臨床的に関連している。 手術により誘導されたウサギにおいて，ＯＡの進行期に大量の軟骨細胞アポトーシスが存在することを示した。 軟骨細胞アポトーシスはＯ Ａ軟骨の特徴的な変化の一つである。 有害な刺激の条件下での病理学的アポトーシスは、走化性または炎症因子の放出をもたらし、軟骨損傷を悪化させ、痛みを活性化させる可能性がある。 したがって，軟骨細胞アポトーシス阻害はウサギ膝関節の変性変化に対する重要な戦略であると考えられる。 ＤＨＪＳＴ群の軟骨細胞アポトーシス指数はモデル群と比較して有意に減少し，軟骨細胞アポトーシスの阻害が変性変化に対するＤＨＪＳＴの重要なメカニズムの一つであることを示唆した。

以前の研究では、関節軟骨細胞の微小環境の低酸素性が示されている。 興味深いことに、変形性関節症の関節は、さらに酸素レベル、OAの病因の間に低酸素症の役割を減少させた表示されます。 最近の研究では、関節軟骨細胞で異化と低酸素ストレスは、低酸素レベルへの細胞適応の主な調節因子である転写因子HIF-1の強い誘導因子であるこ HIF-1は、軟骨発達中の軟骨細胞の生存および成長停止、ならびに健康な骨関節炎軟骨における軟骨細胞のエネルギー生成およびマトリックス合成に 変形性関節症の軟骨では、HIF-1の蛋白質のレベルはかなり高められ、活動は退化的な軟骨の変更の厳格に相関します。 本研究では、低酸素性関節軟骨の完全性を維持するための転写因子HIF-1αの重要性を文書化している。 HIF-1αの余剰レベルは、関節軟骨細胞のアポトーシスの増加と一致し、ウサギの膝関節の変性変化につながった。 DHJSTの投与後、HIF-1α発現はモデル群のそれと比較して減少する。 結果は、軟骨細胞の調節機能に対するDHJSTの作用は、HIF-1αの阻害活性を介して可能性があることを示している。DHJST群とOSA群との間でVEGFとHIF-1αの発現の違いが投与後に有意であることは興味深い。

投与後にVEGFとHIF-1αの発現の違いが有意であることは興味深い。

投与後にVEGF いくつかの研究では、インドメタシンのような特定の非ステロイド性抗炎症薬は、インドメタシンがホスファチジルイノシトール3-キナーゼまたは細胞外シグナル調節キナーゼ/マイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路だけでなく、Erk活性を阻害することができなかったため、HIF-1α活性とは無関係に抗炎症効果を引き起こすことが示されている。 対照的に、インドメタシンはサリチル酸ナトリウムまたはアスピリンに敏感ではないペルオキシソーム増殖剤活性化受容体-γを活性化することができる。 ホスファチジルイノシトール3-キナーゼまたはErk経路の阻害は、HIF-1αおよび血管新生因子の阻害に関連している。

低酸素症および様々な成長因子/サイトカインはVEGF発現を増強する。 VEGFは最も重要な血管新生因子の一つであるだけでなく、OAの炎症過程にも関与し、滑膜を標的とすることにより痛みや腫れなどの症状に寄与し、慢性炎症応答はしばしば血管増殖を誘導する血管新生因子の産生に関連し、関節リウマチではVEGFは滑膜細胞で高度に発現される。 機械的過負荷はoaの原因因子の一つであるため、DHJST投与後にVEGFの発現が減少するウサギの軟骨に対するVEGF発現への影響を調べた結果、DHJSTは軟骨細胞におけるVEGFの発現を抑制することによって関節軟骨を保護できることを示している（図3）。

5. 結論

これまで、DHJSTの生物活性成分は不明であるが、我々の研究では、DHJSTは、軟骨細胞のアポトーシスを阻害し、軟骨細胞におけるVEGF、HIF-1αの発現を調節する機 これはoaの処理のDHJSTを適用するために医院に科学的な証拠を提供します。

資金調達

上海自然科学財団（助成番号：08JC1418800）。