多様なモチーフアンサンブルがマクロファージにおけるAP-1ファミリーメンバーの非冗長DNA結合活性を明らかにする

統計解析

図1に示すように、マクロファージにおけるAP-1ファミリーメンバーの非冗長DNA結合活性を明らかにする。 図１ｃを参照して、遺伝子発現の差を、２回の複製実験（ｎ＝２）において独立したＴ検定（自由度＝１、両側）を用いて試験した。 で発現される遺伝子である。 1bは、デフォルトパラメータでEdger55を使用し、カットオフFDR<0を使用して識別されました。05とlog2倍の変更№2。 である。 各単量体についての各群における遺伝子座の数は、以下の通りである：ＡＴＦ３（Ｖｅｈ＝１ ４ ４ ７、Ｓｈａｒｅｄ＝７ ４ ６ ０、ＫＬＡ＝６ ９ ９ ７）、Ｊｕｎｄ（２ ３ ９ ０、３ ７ ５ １、３ ４ ０ １）、Ｊｕｎｄ（１ ３ ５ １、５ ９ ７ ６、６ ４ ２ ２）。 図中のモチーフの意義。 図４Ａは、Ａｔｆ３（ｎ＝２ ３，１ ６ ０）、Ｊｕｎ（ｎ＝１ ５，５ ４ ８）、およびＪｕｎｄ（ｎ＝１ ９，６ ５ ３）について、Ｖｅｈ処理マクロファージ中に結合した全ての遺伝子座における完全ＴＢＡモデルおよび摂動ＴＢＡモデ 補足の図のモチーフのための重要性。 図４Ｃは、ＧＭ１ ２ ８ ７ ８（ｎ＝７ ４ ５ １）、Ｈ１−ｈＥＳＣ（ｎ＝１ ２，９ ３ １）、Ｈｅｐｇ２（ｎ＝４ １，３ １ ８）、Ｋ５ ６ ２（ｎ＝４ ７，４ ７ ７）、およびＳＫ−ｎ−ＳＨ（３ ８，９ ６ ０）において、Ｊｕｎｄによって結合された全ての遺伝子座における完全ＴＢＡモデルと摂動ＴＢＡモデ 図中のモチーフの意義。 図５Ｂ、補足図５Ｂ、補足図５Ｂ。 図５ｂおよび補足図５Ｂを参照のこと。 図５Ｃは、Ａｔｆ３（ｎ＝３ ６，７ ４ ５）、Ｊｕｎ（ｎ＝１ ７，４ ８ １）、Ｊｕｎｄ（ｎ＝３ １，６ ４ １）、Ｆｏｓ（ｎ＝２ ４，３ ６ ５）、Ｆｏｓｌ２（ｎ＝１ ０，６ １ ９）、およびＪｕｎｂ（ｎ＝１ ３，３ ７ ６）について、ＫＬＡ処理マクロファージに結合したすべての遺伝子座における完全ＴＢＡモデ のための有意性値。 Ｆ検定を用いて、６ｆおよびＳ６Ｆを計算した。; ビヒクル処理マクロファージ中の単量体について分析される遺伝子座の数は、ＡＴＦ３（ｎ＝４ １ ６ ３）、Ｊｕｎ（ｎ＝３ ０ ０ ４）、およびＪｕｎｄ（ｎ＝４ １ ４ ８）であり；ＫＬＡ処理マクロファージ中の単量体につい

balb/cJのカスタムゲノムを生成する

mouse Genomes Project（バージョン3VCFファイル）によって報告された対立遺伝子でmm10ゲノムの不変位置を置 Ｃ５ ７ＢＬ／６Ｊのために、ＵＣＳＣ ｇｅｎｏｍｅ ｂｒｏｗｓｅｒからのｍｍ１ ０参照ゲノムを使用した。 分析中のＢＡＬＢ／ＣＪとＣ５ ７ＢＬ／６Ｊとの間の比較を可能にするために、ＢＡＬＢ／ＣＪのカスタムゲノムの座標を、ＭＲＡＧＥ３ ４を使用して、ｍｍ１ ０参照ゲノムの位置に一致するよ BALB/cJの削除に含まれる読み取りは分析しませんでした。 挿入と重複した読み取りは、参照ひずみの最後の重複位置に割り当てられました。

ChIP-seqピークの解析

Chip-seq実験からのシーケンシング読み取りは、デフォルトのパラメータ56とBowtie2の最新バージョンを使用して、マウス参照ゲノム（またはBALBc/J マップされたChIP-seqは、治療条件に対応する入力チップ実験を使用して、HOMER57findPeaksコマンド（パラメータサイズ200-L0-C0-fdr0.9）で推定TF結合部位を識別するために読 偽陽性ピークの数を減らすために、各ピークでIDRを計算しました（バージョン2.0を使用しています。各反復実験について計算されたホーマーピークスコアをIDRへの入力として用い、IDR≧0.0558を有するすべてのピークをフィルタリングした。 デ-ノボモチーフは、ホーマーで計算されたfindMotifsGenome.pl デフォルトのパラメータを持つコマンド。 デノボモチーフの濃縮は、を用いて計算されたfindKnownMotifs.pl デフォルトのパラメータを持つホーマーのプログラム。

RNA-seq実験から生成されたRNA発現読み取りの定量化は、デフォルトのパラメータを持つSTAR alignerを使用してmm10マウス参照ゲノム（またはBALBc/Jカスタムゲノム）に整列させた59。 各遺伝子の発現レベルを定量化するために、本発明者らは、エクソン内にあった読み取りを用いてＲＰＫＭを計算した。 非正規化シーケンス読み取りは、Edger55で差動発現遺伝子を識別するために使用された;我々はFDR<0.05と二つの実験条件の間の発現の変化を二倍以上 新生Rnaの発現を定量化するために、我々はHOMERを使用してピーク中心の500bps以内であったGRO-seq読み取り（10万に正規化）の数で私たちのChIP-seqピークに注釈を付けannotatePeaks.pl コマンド。

TBAモデルトレーニング

各処理条件下での各AP-1単量体について、我々はランダムに選択されたゲノム遺伝子座のセットから各単量体の結合部位を区別するためのモデルを訓練した。 各モデルを訓練するために使用されるランダムな背景遺伝子座のセットは、以下の基準に従って選択された：（1）背景遺伝子座のGC含量分布は、所与の単量体の結合部位のGC含量と一致し、（2）あいまいまたはマッピング不可能な位置を含まない、および（3）背景配列の数は、結合部位kの数と一致する。 結合部位と背景遺伝子座の組み合わせセット内の配列のそれぞれについて、我々は、両方の向きでmodel60モチーフマッチに含まれるnモチーフのそれぞれに 0未満のLog-oddsスコアは0に設定されました。 線形モデルを学習する前の標準的な前処理手順ごとに、各モチーフの対数オッズスコアを標準化し、平均値が0で分散が1になるように各モチーフのスコアのセットをスケーリングしました。 標準化は、すべてのモチーフのスコアを同じ範囲にスケールし（長いモチーフの最大スコアが大きい）、モデルトレーニングに対するマルチ共線性の影響を減 したがって、モデルを訓練するために使用される特徴は、各行にわたって標準化された対数オッズスコアのn×2k行列です。 ラベルの対応する配列を生成するために、我々は、各結合部位に１のラベルを割り当て、各背景遺伝子座に０のラベルを割り当てた。 この特徴行列とラベル配列を使用して、scikit-learn Python package61によって実装されたL1ペナルティロジスティック回帰モデルを使用して、各motifの重みを訓練しました。 我々の分析に示されているモチーフの重みは、学習のためのデータの80％と各ラウンドでのテストのための20％を使用して、交差検証の五ラウンドにわたる平均値 モデルは、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（受託番号ＧＳＥ４ ６ ４ ９ ４）およびエンコードデータポータル（）からダウンロードされたデータと同様に、本研究で生成されたチ

多重共線性の定量化

我々は我々のモデルを訓練するために使用されるモチーフスコア特徴における多重共線性の程度を評価するために、我々は、各実験に対応する各特徴行列を取り、各motif38のためのVIFを計算しました。 VIFを計算するために、最初に、1つのモチーフの対数オッズスコアを残りのモチーフの対数オッズスコアに対して回帰することによって、各モチーフの決定係数R2を決定します。 次に、決定係数を用いて、各モチーフの許容誤差を、１と決定係数（１−Ｒ２）との間の差として計算することができる。 VIFは、許容誤差\(\frac{1}{{1-R^2}}\)の逆数です。 決定係数を計算するために、sklearn Pythonパッケージのlinear_modelモジュールを使用しました。

モチーフのクラスタリングとマージ

我々は、motifs62の特定のペアに対応する整列位置確率行列（Ppm）のピアソン相関を計算することにより、DNA配列モチ 長さiのモチーフAとBのペアのピアソン相関は、次の式を使用して計算されます。

Ppmは最初にSmith–Waterman alignment algorithm63を使用して整列されました。 短いモチーフは、アライメントの前に背景周波数値でパディングされます。 アライメントのギャップは許可されず、アライメントの各位置はPearson相関でスコア化されました。 次に、最適アライメントを使用して、Ｐｅａｒｓｏｎ相関を計算した。 次に、0.9以上のピアソン相関を持つPpmを持つモチーフのセットは、反復的にセット内の各PPMを整列させ、各位置でのヌクレオチド周波数を平均化するこ

tbaのモチーフの有意性を評価する

tbaのp値を対数尤度比検定を用いて計算した。

TBAのp値を対数尤度比検定を用いて計算した。

各モチーフは、摂動TBAモデルを訓練するために使用される特徴のセットから削除されました（五倍交差検証を使用して）。 次に、完全モデル（すべてのモチーフを含む）と摂動モデルを使用して、与えられた単量体およびすべての背景領域のすべての結合部位および背景配列 次に、完全モデルと摂動モデルによって計算された尤度の差を使用して、各モチーフのカイ二乗検定を実行しました。 カイ二乗検定は、scipy python package64を使用して実行しました。

他の方法との比較

BaMM motifとgkm-SVMは両方ともデフォルトパラメータで実行されました。 大規模なgkm-SVM、LS-GKM（8/25/16のhttps://github.com/Dongwon-Lee/lsgkmからダウンロードしたソースコードからコンパイル）、およびBaMM motif;v1.0からダウンロードしたBaMM motif;v1.0、65を使用しました。 両方のモデルは、五倍交差検証を使用して訓練されました。 モデルのパフォーマンスは、sklearnのmetricsモジュールのroc_auc_score関数とprecision_score関数を使用してスコア化しました。

一時間KLA処理後のAP-1結合の変化を予測する

KLA処理後の結合の変化を予測するために、我々は、車両処理データ（Wveh=）で訓練されたTBAモデルと1-h KLA処理データ（Wkla=）で訓練されたtbaモデルによってnモチーフ（wn）のそれぞれについて学んだモチーフの重みを活用し、各AP-1単量体について。 各配列の結合における予測された変化は、次に、配列のそれぞれについて計算された標準化されたモチーフスコアの内積（Sk=）とKLAモチーフ重みとの間の差、モ 予測は、ビヒクルまたはKLA処理条件のいずれかでAP-1単量体のいずれかのピークと交差するすべてのゲノム遺伝子座のために行われました。

tbaとの株特異的結合の予測

株特異的結合を予測するために、我々はC57BL/6Jデータを用いて各AP-1単量体のTBAモデル（W=）によってnモチーフ（wn）の各モチーフウェイトを活用し、c57BL/6JおよびBALBc/J（SC57、k=、SBAL、k=）のゲノム配列を用いてk結合部位ごとに計算されたモチーフスコアを活用した。 次に、C57BL6/JとBALBc/J（Dn=）のモチーフスコアの差を計算し、BALBc/JをC57BL/6Jと比較するときに変異を有するすべてのk結合部位にわたって各モチーフのスコア差を標準化し、各結合部位の標準化されたモチーフスコア差をもたらした（Zn=標準化（Dn）=）。 最後に、我々は、モチーフの重みの内積とk番目の変異結合部位（Δ C57-BAL=W β）のC57BL6/EiJとBALBc/Jの間のモチーフスコアの標準化された差を計算することによ

TBA-2strainモデルトレーニング

AP-1単量体のいずれかのピークと交差する各ゲノム遺伝子座について、C57BL/6JまたはBALBc/Jのいずれかで、我々は、k結合部位（SC57、k=、SBAL、k=）のそれぞれのモチーフスコアの二組をもたらし、両方の株からのゲノム配列を使用して、モデルに含まれるnモチーフのそれぞれについて最高のlog-oddsスコアを計算した。 両方の方向のモチーフの一致が考慮された。 0未満のLog-oddsスコアは0に設定されました。 モチーフスコアを使用して、我々は上記のセクション（Zn=）に記載されているように、二つの株にわたってモチーフスコアの標準化された差を計算します。 したがって、モデルの学習に使用される特徴は、各行にわたって標準化された対数オッズスコアのn行k列の行列です。 次に、本発明者らは、株特異的結合の程度を表すために、Ｂａｌｂｃ／Ｊと比較したＣ５ ７ＢＬ／６ＪにおけるＣｈｉｐ−ｓｅｑ読み取りの数のｌｏｇ２倍比を計算した。 この特徴行列を使用して、2つの株間の結合のlog2倍比を従属変数として設定し、scikit-learn Pythonパッケージによって実装された線形回帰を使用して、各モチーフの重みを訓練しました。 我々の分析に示されているモチーフの重みは、学習のためのデータの80％と各ラウンドでのテストのための20％を使用して、交差検証の五ラウンドにわたる平均値 ひずみ特異的結合の予測は、前のセクションの手順に従って計算された重みを使用して行うことができる。

ChIP protocol

InvitrogenからのProtein AおよびG Dynabeads50/50mixは破片（10001D、10003D）のために訴えられます。 IP mixは、2000万個の細胞チップあたり20μ lビーズ/2μ g抗体で構成されています。 AP-1ファミリーメンバーに対する抗体は、非特異的結合の可能性を最小限に抑えるために、非保存領域の標的化のために選択された。 抗体は、補足表３に列挙される。 調製のために、ビーズを2×0.5％BSA–PBSで洗浄し、次いで、ビーズ–抗体を、回転体上で少なくとも1時間インキュベートした（4℃）。 2×を0で洗う。５％ＢＳ Ａ−ＰＢＳを希釈緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ、２ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、１ ５ ０ｍ Ｍ Ｎａｃｌ、２ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７． チップのための二重架橋：培地を１ ０ｃｍプレート中の細胞からデカントし、ＰＢＳ（Ｒ Ｔ）で１回短時間洗浄した。 グルタル酸ジスクシンイミジル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔ＃２ ０ ５ ９ ３）（ＤＭＳＯで２ ０ ０ｍ Ｍで希釈）／ＰＢＳ（Ｒ Ｔ）を１ ０分間使用した。 次いでホルムアルデヒドを１％の最終濃度に加え、さらに１ ０分間添加した。 反応物を氷上で1:10 1M Tris pH7.4でクエンチした。 細胞を回収し、冷たいＰＢＳで２回洗浄し、１ ０ ０ ０×ｇで５分間回転させた。 核単離および超音波処理：1mLの核単離緩衝液（50mM Tris–pH8.0、60mM KCl、0.5％NP40）+PIに細胞ペレットを再懸濁し、氷上で10分間インキュベートする。 核を200μ lの新鮮な溶解緩衝液(0.5%SDS、10mM EDTA、0.5mM EGTA、50mM Tris–HCl(pH8))+PIに再懸濁させる。 超音波処理：次いで、薄い壁管（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ Ｃａｔ＃Ｃ３ ０ ０ １ ０ ０ １ ０）を使用して、Ｂｉｏｒｕｐｔｅｒ（設定＝３ ０秒＝Ｏｎ、３ ０秒＝Ｏｆｆ、培地）中で２ ５分間、核を超音波処理（１ ０ ０ ０万細胞）した。 超音波処理後、4℃で10分間最大速度を回転させます。: 超音波処理されたＤＮＡを、８ ０ ０希釈緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ、２ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、１ ５ ０ｍ Ｍ Ｎａｃｌ、２ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７． 入力サンプル(5%)のアリコートが削除されます。 回転しながら4℃でサンプルをオンにします。 洗浄：チップをTSE I（20mM Tris–HCl pH7.4、150mM NaCl、0.1％SDS、1％Triton X-100、2mM EDTA）で1×、TSE III（10mM Tris–HCl pH7.4、250mM LiCl、1％IGEPAL、1％デオキシコール酸塩、1mM EDTA）で2×、TE+0.1％Triton X-100で1×洗浄し、0.1%トライトンx-100 溶出: 溶離緩衝液200μ l(1%SDS,10mM Tris pH7.5)で室温で20分間溶離し、渦またはナテータまたは回転子で振とうする。 脱架橋：10μ lの5M NaClを加え、65℃（または少なくとも8時間）でインキュベートする。 Zymo ChIP DNA CleanとConcentratorを使用してサンプルをクリーンアップします。 100μ lで溶出する。 40µ lを取り、図書館の準備の議定書に進んで下さい。Ｒｎａ単離：ＴＲＩＺＯＬ−ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ ｃａｔ＃１ ５ ５ ９ ６ ０ １ ８）およびＤＩＲＥＣＴ−ＺＯＬ ＲＮＡ ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ ｋｉｔ（ｃａｔ＃１ １−３ ３ ０Ｍ Ｂ）を用いてＲＮＡを単離した。 ポリA RNA単離：0を使用します。理想的な地図を描く効率および最低のclonalityのための出発材料として2総RNA。 10μ l oligo(dT)(NEB cat#S1419S)ビーズをRNAサンプルあたり収集します。 ビーズを１×ＤＴＢＢ（２ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ ｐＨ７． ビーズを５ ０μ ｌの２×ＤＴＢＢ中に再懸濁した。 ５ ０μ ｌのビーズを５ ０μ ｌのＲＮＡと混合し、６ ５℃に２分間加熱した。 その後、ＲＮＡビーズを回転させながらＲＴで１ ０分間インキュベートした。 次いで、ｒｎａビーズを磁石上に集め、ＲＮＡ ＷＢ１（１ ０ｍ ＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌ ｐＨ７．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ０ ０）およびＷＢ３（１ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ ｐＨ７． 50μ lのトリス–HCl pH7.5を加え、80℃に2分間加熱して溶出する。 RNAを収集し、第二のOligo-dTビーズ収集を実行します。 ３）、３ ７ ５ｍ Ｍ Ｋｃｌ、１ ５ｍ Ｍ Ｍｇｃｌ２（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＳＳＩＩＩ ｋｉｔ Ｃａｔ＃１ ８ ０ ８ ０ ０ ９ ３）であった。 断片化：その後、10μ lの2×第一鎖緩衝液と10mM DTTおよび断片DNAを94℃で9分間添加する。 磁石にビーズを集め、断片化したmRNAを含む溶出液を新しいPCRストリップに移します。 10μ lの断片化されたRNAを回収する必要があります。 断片化RNAを、0.5μ lのランダムプライマー（3μ g/μ l）Life Tech#48190-011、0.5μ lのoligo-dT（SSIIIキットから50μ m）、1μ lのdNTP（10mM Life Tech、cat18427088）および0.5μ lのSUPERase-In（ThermoFisher Cat#AM2696）と混合し、50℃ すぐに氷の上に置きます。 次いで、5.8μ lのDDH2O、0.1μ lのアクチノマイシン（2μ g/μ l Sigma cat#A1410）、1μ lのDTT（100mM Life Tech cat#P2325）、0.2μ lの1％Tweenおよび0.5μ lのSuperscript IIIを添加し、25℃で10分間、次いで50℃で50分間インキュベートした。 ビーズクリーンアップ: 36μ lのRNAClean XP（Ampure XP）を添加し、混合し、氷上で15分間インキュベートした。 次いで、ビーズを磁石上に集め、７ ５％エタノールで２×洗浄した。 次いで、ビーズを１ ０分間風乾し、１ ０μ ｌのヌクレアーゼを含まないＨ２Ｏで溶出した。 １μ ｌのｄＵＴＰ（１ ０ ０ｍ Ｍ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｃａｔ＃７ ７ ２ ０ ６）、０.２μ ｌのＲｎａｓｅ Ｈ（５Ｕ／μ ｌのＥｎｚｙｍａｔｉｃｓ ｃａｔ＃Ｙ９ ２ ２ ０Ｌ）、１μ ＬのＤＮＡポリメラーゼｉ（１ ０Ｕ／μ ｌのＥｎｚｙｍａｔｉｃｓ ｃａｔ＃７ ７ ３ ３ ０）、１μ ｌのＤＵＴＰ／ｄＮＴＰミックス（１ ０Ｍ Ｍ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｃａｔ＃７ ７ ２ ０ ６）、１μ ｌのＲＮＡＳＥ Ｈ（５Ｕ／μ ｌのＥｎｚｙｍａｔｉｃｓ ｃａｔ＃Ｙ９ ２ ２ ０Ｌ）、１μ ｌの１ ５μ ｌの１％Ｔｗｅｅｎ−２ ０および１．05μ lのヌクレアーゼフリー水。 ビーズのクリーンアップ：反応ごとに1μ lのSeradyn3EDAC SpeedBeads（Thermo6515-2105-050250）を28μ lの20％PEG8000/2.5M NaCl（13％最終濃度）中に添加し、室温で10分間インキュベートすることによ 次いで、ビーズを磁石上に集め、８ ０％エタノールで２×洗浄した。 ビーズを１ ０分間風乾し、４ ０μ ｌのヌクレアーゼを含まない水に溶出させた。 DNAはライブラリの準備の準備ができています。

ライブラリー準備プロトコル

dsDNAエンド修復：チップまたはRNAプロトコルから40μ lのDNAを2.9μ lのH2O、0と混合しました。５μ Ｌの１％Ｔｗｅｅｎ−２ ０、５μ ｌの１ ０×Ｔ４リガーゼ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ ｃａｔ＃Ｌ６ ０ ３ ０−Ｈ Ｃ−Ｌ）、１μ ｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ（１ ０ｍ Ｍ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ７ ７ １ １ ９）、０.３μ ｌのＴ４ＤＮＡ ｐｏｌ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ Ｐ７ ０ ８ ０Ｌ）、０.３μ ｌのＴ４ＰＮＫ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ Ｙ９ ０ ４ ０Ｌ）、０.０ ６μ ｌのＫｌｅｎｏｗ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ Ｐ７ ０ ６ ０Ｌ）を２ ０℃で３ ０分間５Ｍ Ｎａｃｌ（１ ３％最終）９ ３μ ｌ中の１μ ｌのＳｅｒａｄｙｎ３ＥＤＡＣ Ｓｐｅｅｄｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ６ ５ １ ５−２ １ ０ ５−０ ５ ０ ２ ５ ０）を添加し、１ ０分間インキュベートした。 ビーズのクリーンアップ：ビーズを磁石上に収集し、2×80％エタノールで洗浄した。 ビーズを１ ０分間風乾し、次いで、１ ５μ ＬのＤＤＨ２Ｏ．ｄ ａ−テーリング中に溶出させた。 ＤＮＡを１ ０と混合した。６μ ｌのＤＡＴＰ（１ ０ｍ Ｍ Ｔｅｃｈ１ ０ ２ １ ６−０ １ ８）、０.３μ ｌのＫｌｅｎｏｗ３−５Ｅｘｏ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ Ｐ７ ０ １ ０−ＬＣ−Ｌ）を加え、３ ７℃で３ ０分間インキュベートした。10分間インキュベートした。 その後、ビーズのクリーンアップが行われました。 ビーズを１ ４μ ｌで溶出した。 Y字型アダプター結紮。 試料を、0.5μ lのBIOO barcode adapter(BIOO Scientific cat#514104)、15μ lのRapid Ligation Buffer(Enzymatics cat@L603-LC-L)、0.33μ lの1%Tween-20および0と混合した。5μ lのT4DNAリガーゼHC(Enzymatics L6030-HC-L)を室温で15分間インキュベートした。7μ lの20%PEG8000/2.5M NaClを加え、室温で10分間インキュベートした。ビーズのクリーンアップを行い、ビーズを21μ l中に溶出した。 次いで、１ ０μ ｌを、ＩＧＡおよびＩＧＢプライマー（ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ、ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ）を用いたＰＣＲ増幅（１ ４サイクル）のために使用した。

GRO-seq

初期の転写は、グローバル核ランオンシーケンシング（GRO-seq）によってキャプチャされました。 核を低張溶解（10mM Tris–HCl（pH7.5）、2mM Mgcl2、3mM Cacl2;0）を用いてTGEMsから単離した。１％ＩＧＥＰＡＬ Ｃ ａ−６ ３ ０）およびｇｒｏ−凍結緩衝液（５ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７． ランオン ランオンの長さを制限するために、3×nro緩衝液(15mM Tris-Cl(pH8.0)、7.5mM Mgcl2、1.5mM DTT、450mM KCl、0.3U/μ LのSUPERase In、1.5%Sarkosyl、366μ M ATP、GTP(Roche)、Br-UTP(Sigma40Aldrich)および1.2μ M CTP(Roche、Roche)を用いて、3–5×106個のBMDM核をBrUTP標識したNtpでランオンした。-40ヌクレオチド））。 ５ ０ ０μ ｌのＴｒｉｚｏｌ ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加により５分後に反応を停止させ、５分間ボルテックスし、ＲＮＡを抽出し、製造業者によって記載されたように沈殿させた。 ０ ５％Ｔｗｅｅｎ（Ｄ Ｈ２Ｏ＋Ｔ）および２μ ｌの断片化混合物（１ ０ ０ｍＭＺｎＣｌ２、１ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７． 断片化は、2.5μ lの100mM EDTAの添加によって停止した。 BrdUエンリッチメント… ＢｒｄＵ濃縮は、Ｂｒｄｕ抗体（ＩＩＢ５）およびＡ Ｃビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＳＣ−３ ２ ３ ２ ３Ａ Ｃ、ロット＃Ａ０ ２ １ ５および＃Ｃ１ ７ １ ６）を使用して行った。 ビーズを、ＧＲＯ結合緩衝液（０.２ ５×ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＥＤＴＡ緩衝液（ＳＳＰＥ）、０.０ ５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ、３ ７.５ｍ Ｍ Ｎａｃｌ、１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ）＋３ ０ ０ｍ Ｍ Ｎａｃｌで１回洗浄した後、ＧＲＯ結合緩衝液中で３回洗浄し、０.１Ｕ／μ Ｌ Ｓｕｐｅｒａｓｅ−ｉｎで２ ５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）スラ ＲＮＡを断片化するために、５ ０μ ｌの冷ＧＲＯ結合緩衝液および４ ０μ ｌの平衡化Ｂｒｄｕ抗体ビーズを添加し、試料を４℃で８ ０分間ゆっくり回転させた。 続いて、ビーズを１ ０ ０ ０×ｇで１ ５秒間紡糸し、上清を除去し、ビーズをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ ＭＣカラム（ＵＦＣ３ ０ＨＶＮＢ）に移した。; Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を２×２ ０ ０μ ｌのＧＲＯ結合緩衝液中に入れた。 ＩＰ反応物を４ ０ ０μ ｌのＧＲＯ結合緩衝液で２回洗浄した後、２ ０ ０μ ｌのＴｒｉｚｏｌ ＬＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）中で穏やかな撹拌下で３分間インキュベートすることによってＲＮＡを溶出させた。 溶出を２回繰り返し、１ ２ ０μ ｌのＤ Ｈ２Ｏ＋Ｔを添加して上清を増加させ、製造業者によって記載されたように抽出した。 末端修復および脱脂：末端修復および脱脂のために、ＲＮＡペレットを、８μ ｌのＴＥＴ（１ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７． 迅速なスピンの後、22μ l Repair master mix(3μ l10×PNK buffer,15.5μ l dh2o+T,0.5μ l SUPERase-In RNase Inhibitor(10U),2μ L PNK(20U),1μ l RppH(5U))を加え、混合し、37℃で1時間インキュベートした。5’endをリン酸化するために、0.5μ lの100mM ATPを加え、反応物を37℃でさらに45分間インキュベートした(高ATP濃度)。rpphの活動を癒やします）。 最後の修復の後、2.5μ lの50mM EDTAを添加し、反応物を混合し、次いで70℃に2分間加熱してから氷上に置いた。 上記で詳述したように、第２のＢｒｄｕ濃縮を行った。 RNAペレットを2.75μ L Tet+0.25μ L Illumina TruSeq3’Adapter(10μ M)に溶解し、70℃に2分間加熱し、氷上に置いた。 ２ ５μ ｌ Ｓｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ，１μ ｌ Ｔ４ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ２ｔｒｕｎｃａｔｅｄ（２ ０ ０Ｕ；ＮＥＢ））を添加し、よく混合し、反応物を２ ０℃で１時間インキュベートした。１ ０μ ｌ ＴＥＴ＋２μ ｌ５ ０ｍ Ｍ ＥＤＴＡの添加により希釈し、７ ０℃に２分間加熱し、氷上に置いて、第３ラウンドのＢｒｕｔｐ濃縮を行った。 ＲＮＡペレットを、７ ５％エタノール洗浄中にＰＣＲストリップに移し、乾燥させた。 試料を4μ lのTET(10mM Tris–HCl(pH7.5),0.1mM EDTA,0.05%Tween20)+1μ lの10μ M逆転写(RT)プライマーに溶解した。 RTprimerをアニールするために、混合物を75℃で5分間、37℃で15分間、および25℃で10分間インキュベートした。 5’Illumina TruSeq adapterを連結するために、10μ lの5’master mix(1.5μ l DH2O+0.2%Tween20、0.25μ lの脱飽和5’Truseq adapter(10μ m)、1.5μ lの10×T4RNA ligase buffer、0.25μ lのSUPERase-In、0.2μ lの10mM ATP、5.8μ lの50%PEG8000、0.5μ lのT4RNA ligase1(5U;NEB))を加え、反応物を調製した。25℃で1時間インキュベートした。 逆転写は、Ｐｒｏｔｏｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（ＮＥＢ）（４μ ｌの５×ＮＥＢ Ｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄ ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ；Ｅ７ ４ ２ １Ａ Ａ）、０．混合物を増幅した（９ ５℃で３分間、（９ ５℃で６ ０秒、６ ２℃で３ ０秒、７ ２℃で１ ５秒）ｘ１ ３、７ ２℃で３分間）。 ＰＣＲ反応は、2.5M NaCl/20%PEG8000中の1.5容量のSpeedBeads(GE Healthcare)を用いて洗浄した。 ライブラリは、160-225塩基対にPAGE/TBEゲル上で選択されたサイズであった。 ゲル切片を、1.5mL管の上に置かれた0.5mLの穿孔されたPCR管を通して紡糸することによって細断した。 150μ lのゲルEB(0.1%LDS、1M LiCl、10mM Tris–HCl(pH7.8))を加え、スラリーを撹拌下で一晩インキュベートした。 溶出されたＤＮＡを精製するために、７ ０ ０μ ｌのＺｙｍｏｇｅｎ Ｃｈｉｐ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを、細断されたゲルスライスおよびゲルＥ Ｂを含む１． 試料を最初に１ ０ ０ ０×ｇで３分間回転させ、次いで１ ０，０ ０ ０×ｇで３ ０秒間回転させた。 流れを除去し、試料を２ ０ ０μ ｌのＺｙｍｏ Ｗａｓｈｂｕｆｆｅｒ（Ｅｔｏｈを含む）で洗浄した。 ゲル残渣をフリックにより除去し、カラムを、別の２ ０ ０μ ｌのＺｙｍｏ Ｗａｓｈｂｕｆｆｅｒ（Ｅｔｏｈを含む）の添加により洗浄した。 流れを除去し、カラムを１ ４，０ ０ ０×ｇで１分間の遠心分離によって回転乾燥させ、２ ０μ ｌの予め加温された配列決定ＴＥＴ（１ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ８.０）、０.１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、０.０ ５％Ｔｗｅｅｎ２ ０）の添加によ 図書館は配列決定された。細胞をIgepal溶解緩衝液(50mM Tris pH8.0,150mM NaCl,0.0)で溶解した。

ウェスタンブロッティング

細胞をIgepal溶解緩衝液(50mM Tris pH8.0,150mM NaCl,0.0)で溶解した。5％Igepal）およびタンパク質濃度は、BSAを標準として使用するBioRad protein assay reagentを用いて決定した。 タンパク質は、NuPage4–12％ビスTris勾配ゲル（Invitrogen）上で分離され、ニトロセルロース膜（Amersham）上に転送されました。 膜は、0.1％Tween-20および5％BSAでTBSでブロックされた。 Ｅｃｌ ｐｌｕｓ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を検出した。

動物および細胞培養

tgemsを、雄8週間のC57Bl/6JまたはBALB/cJマウスから注射した3日後に採取し、DMEMプラス10％FBSおよび1×ペニシリン-ストレプトマイシン中の20×106細胞あたり15cmのペトリ皿でメッキした。 めっきの１日後、細胞に新鮮な培地を補充し、ＰＢＳ（Ｖｅｈ）または１ ０ ０ｎｇ／ｍｌ ＫＬＡで１時間処理した後、下流の分析に直接使用した。 iBMDMはmycおよびBraf V600E66を含んでいるレトロウイルスとのBMDMの伝染によって作り出されます。 その後、不死化された細胞を数週間にわたって増殖させる。 すべての動物実験を行い遵守し、倫理基準を定めるカリフォルニア大学サンディエゴ校機関の年次決算委員会(IUCAC).

レンチウイルス産生

pLentiguideは、U6-bsmbi-spgRNA足場とTAGBFP2を駆動するCMVプロモーターを含むように変更されました。 ２つのＣＲＩＳＰＲガイドを、ｈ１プロモーター（ｂｓｍｂｉ部位／ｇｕｉｄｅ１／足場／Ｈ１プロモーター／ｇｕｉｄｅ２／ｂｓｍｂ１部位）を用いたＰＣＲ増幅を介して各標的に挿入し、ウイルス（Ｕ６およびＨ１駆動）当たり ウイルスはpVSVg/ppax2システムで作られました。 細胞ペレットをＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で４℃で一晩再構成し、−８ ０℃で保存した。＜／ｐ＞＜ｈ３＞ＣＲＩＳＰＲ ＫＯ ＩＢＭＤＭＳの産生＜／ｈ３＞＜ｐ＞ｋｏ ＩＢＭＤＭＳは、レンチウイルス感染を使用して産生した。＜／ｈ３＞＜ｐ＞ＫＯ ＩＢＭＤＭＳ ＩＢＭＤＭ−ＣＡＳ９−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを、２ ９ ３ｔ細胞で測定したように、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中のレンズ芽細胞（ＯＺ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（各試薬５μ ｌ）を用いてＭＯＩ１ ０ ０に感染させた。 次いで、これを室温で１時間、１ ３ ０ ０ｇで遠心分離した。 次いで、培地を除去し、骨髄培地（３ ０％Ｌ細胞、２ ０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ中の１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中で細胞を２日間補充した。 次いで、ウイルス配列（ＴＡＧＢＦＰ２）上での導入遺伝子の発現によって、細胞を感染のために選別した。

報告概要

実験設計に関する詳細は、この記事にリンクされているNature Research Reporting Summaryを参照してください。

コードの可用性