結果
HlyA誘導溶血にはプリン作動性受容体の活性化が必要である。
α-溶血素（HlyA）産生大腸菌株ARD6からの上清は、ウマ、ヒト、およびマウスの赤血球を溶解する（図10）。
α–溶血素（HlyA）産生大腸菌株ARD6からの上清は、ウマ、ヒト、およ 1). 図1は、HlyA誘発溶血を時間の関数として示しています。 カバースリップに付着したマウスおよびヒト赤血球を用いたタイムラプス実験は、HlyA誘発溶血が連続的なプロセスであることを明らかにした。 最初の２ ０分以内に、Ｈｌｙａは、細胞収縮の結果として赤血球の収縮を誘発し、続いて、漸進的な体積増加、および最終的に細胞の溶解を誘導した（図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ）。 図1Aおよび図1B、映画S1）。 この連続的な収縮と膨潤は、単一セルレベルでも適用されます。 したがって、収縮または膨潤のいずれかの赤血球の異なる集団ではなく、むしろ、単一の赤血球が最初に収縮し、次にHlyA適用の結果として膨潤する。 赤血球懸濁液（1.25％）を希釈大腸菌上清（50μ l·ml−1）とインキュベートした。 試験した三つの種からの赤血球は、HlyAに対する応答性に顕著な差を示した（図。 1C）ヒト赤血球におけるHlyAに対する感受性が最も低い。 以下の実験の全てにおいて、添加されたＥ．ｃｏｌｉ上清の量を調整して、６ ０分間のインキュベーション後に≧５ ０％の溶血を生じさせた。
ウマ、マウスおよびヒト赤血球におけるα-溶血素誘発溶血。 （Ａ）大腸菌（ＡＲＤ６、血清型ＯＫ：Ｋ１ ３）を含有するα−溶血素の効果:Ｈ１）３ ７℃で１ ０、２ ０、および６ ０分間培養した後、カバースリップに付着したヒト赤血球上の上清（映画Ｓ１も参照のこと）。 (B)集計データ。 時間をかけてcrenated赤血球（オープンカラム）と溶解赤血球（点線のカラム）の総量は、60分にわたって収集された画像配列で分析し、0.1Hz（n=8ヒト）で。 （Ｃ）全体的な溶血は、溶液中のヘモグロビン濃度を反映した５ ４ ０ｎｍ（ＯＤ５ ４ ０）における光学密度の増加として示される。 赤血球をＥ．ｃｏｌｉ上清（５ ０μ ｌ・ｍ ｌ−１）と０〜６ ０分間インキュベートした。 馬、マウス、およびヒトについては、それぞれn=5、7、および6です。特に明記しない限り、溶血を誘導するために濾過された大腸菌（ARD6）上清を使用する。
通常、溶血を誘導するために濾過された大腸菌（ARD6）上清を使 このアプローチは、我々の結果はまた、HlyAが様々な他の成分と一緒に大腸菌から放出されるin vivoで適用されることを確実にするために選択されました。 しかし、このアプローチを選択する際には、HlyA産生大腸菌によって誘導される溶血が実際にHlyAに起因する可能性があることを確認する必要がありました。 従って、私達は私達のARD6文化からHlyAを精製しました。 精製後、精製したＨｌｙａの懸濁液を、５〜１ ５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル上で分離した。 単一の１ ０ ０−ｋＤａバンドは、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｒ染色後に現れ、質量分光法は、バンドをＨｌｙａとして同定した（図１ ０Ａ）。 S1AおよびB）。 追加の対照として、Ｈｌｙａを産生しない大腸菌の非病理学的実験室株である大腸菌株Ｄ２ １ ０ ３からの上清を使用した。 これらの細菌からの上清は、ヒト、マウス、またはウマの赤血球において溶血を誘導しなかった（図１）。 S1D）。 さらに、我々は親切に教授によって供給HlyAに私たちの調査結果を比較しました。 Ｓｕｃｈａｒｉｔ Ｂｈａｋｄｉ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏ ｆ Ｍａｉｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ（≧５ ０％の溶血に対して１ ０ｎｇ＊ｍｌ−１の活性を有する、図１ ０Ａ）。 S2）。 以下において、精製Ｈｌｙａが挙げられる場合には、この調製物を参考とする。 Ｈｌｙａの生物学的活性の我々の最初の試験中に，ＡＴＰスカベンジャーアピラーゼは完全にウマ赤血球のｈｌｙａ誘発溶血を阻害することを発見した。 この発見は、HlyA産生大腸菌によって与えられた溶血に必要な細胞外ATPを暗示していたので、本当に驚くべきことでした。 細胞外ATPはP2受容体を活性化するシグナル伝達分子であるため、我々の知見は、HlyA誘発溶血のための一般的な細孔モデルが簡素化される可能性が したがって、我々はより徹底的にATP掃気の効果をテストしました。 我々は、アピラーゼがウマだけでなく、マウスやヒトの赤血球の溶血を完全に阻害することを見出した（図1）。 2A）。 さらに、アデノシン三リン酸（ATP）をアデノシン二リン酸（ADP）に急速に分解するヘキソキナーゼは、同様に濃度依存的にマウスおよびヒト起源の赤血球中のHlyA誘導溶血を減少させた（図。 2B）。 この知見は、精製されたＨｌｙａによって検証された（図１）。 2B、インセット）。 ヒト赤血球では，アピラーゼとヘキソキナーゼの両方が低濃度でＨｌｙａ誘発溶血を増強したことに注目する価値がある。 この区別は、種間の赤血球上のP2受容体発現パターンの違いを示唆している可能性がある。
赤血球のHlyA誘発溶血は、エクトアトパーゼおよびプリン作動性アンタゴニストによって阻害される。 大腸菌上清（60分）は、ヒト（正方形）、マウス（満たされた円）、およびウマ（開いた円）赤血球の溶血を誘導する。 （Ａ）ＡＴＰ捕捉剤アピラーゼの濃度−応答曲線。 Insetは、0、1、2、5または10u ml−1アピラーゼの存在下でHlyAに供されたマウス赤血球からの上清の代表的な画像を示す。 (B)ヒト、マウス、およびウマ赤血球のHlyA誘発溶解に対するヘキソキナーゼの効果; insetは、マウスおよびヒト赤血球における精製HlyAによって誘導される溶血に対するヘキソキナーゼ（10U ml−1）の効果を示す）。 （Ｃ）３種全てからの赤血球のＨｌｙａ誘発溶解に対する非選択的Ｐ２受容体アンタゴニストＰＰＡＤＳの効果。 （Ｄ）ヒト赤血球中の種々の濃度の精製ＨｌｙａにおけるＰＰＡＤの濃度–応答関係。 溶血はＯＤ５ ４ ０として測定した。 値は平均±ＳＥＭであり；ｎ＝５〜１ ３である。この知見の関連性を検証するためには、P2受容体拮抗薬がHlyA誘発溶血に影響を与えたかどうかを知ることが重要であった。
この知見の関連性を検証するためには、P2受容体拮抗薬が 非選択的Ｐ２受容体アンタゴニストＰＰＡＤＳは、ウマ、マウスおよびヒト赤血球におけるＨｌｙａ産生Ｅ．ｃｏｌｉによって誘導される溶血を濃度依存的に減少させた（図１）。 2C）。 PPADSのEC50値は、それぞれ、ヒト、マウス、およびウマの赤血球のための520μ m、400μ m、および180μ mであった。 この知見は、Ｈｌｙａ濃度の全範囲について実証された（図１ ０Ａ）。 2D)精製されたHlyAにさらされたヒト赤血球で試験しました。 濃度-応答関係は競合的拮抗作用と互換性があり、最大毒素濃度の効果もP2受容体遮断薬によって減少したことに留意すべきである。 したがって、P2受容体活性化はHlyA誘発溶血に関与していると思われる。 非選択的P2受容体拮抗薬スラミンはまた、濃度依存的にすべての三つの種におけるHlyA誘発溶血を減少させた（データは示されていない）。 しかしより高い濃度でsuraminにより劇的な赤血球の収縮を引き起こし、こうして赤血球のP2受容器の含意を評価するために適しないかもしれません。
溶血に対するプリン作動性アンタゴニストの効果が単に浸透圧の増加の結果であるかどうかを評価するために、我々はHlyA誘発溶血に対する細胞外ショ糖の効果を試験した（データは示されていない）。 スクロース（1mM）はわずかに溶血（5.1％±1.7％）を減少させたが、10mMおよび75mMのスクロースは溶血を著しく減少させた(28.5% ± 5.0%, 82.8% ± 5.2%). この研究で使用された拮抗薬およびAtpaseの濃度が1mMを超えたことがないことを考えると、その効果は浸透圧の増加の結果ではありません。 アンタゴニストと毒素間の非選択的結合を反映した結果はなかった。 これをウマ赤血球中で試験し、これをHlyAで10-15分間37℃で、または30分間4℃で予備インキュベートし、十分に洗浄し、拮抗薬の有無にかかわらず再懸濁した。 Ｈｌｙａは予備穿刺中に膜に取り込まれるので，赤血球は遊離Ｈｌｙａの非存在下で溶解を進行した。 図1.1.1. S2は、hlyaが赤血球にpreboundされた後、様々な薬理学的介入が溶血を減少させたことを示しています。 しかし，溶解プロセスが既に開始されている洗浄赤血球に加えた場合，きっ抗薬はあまり効率的ではなかった。
Hlya誘発溶血にはどのP2受容体が関与していますか？
Hlya誘発溶血に関与していますか？赤血球は様々なタイプのP2受容体を発現する。
赤血球は様々なタイプのP2受容体を発現する。 成熟したヒト赤血球で発現されることが報告されているＰ２受容体には、ｐ２Ｙ１（１ ４）、Ｐ２Ｙ２（１ ５）、Ｐ２Ｙ１ ３（１ ５）、Ｐ２Ｘ１（１ ５）、およびＰ２Ｘ７（１ ６）が含まれるが、ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｘ１、Ｐ２Ｘ４、およびＰ２Ｘ７は、赤血球前駆細胞に存在するようである（１ ７）。 これらのプリン作動性受容体のどれがHlyA誘発溶血に関与するかを試験するために、我々は問題の受容体を個別に対処した。 P2Y1受容体は、マラリア原虫に感染したヒトおよびマウス赤血球（14）のソルビトール誘発溶血に関与しているように、我々はこの受容体がHlyA誘発溶血 P2Y1受容体拮抗薬MRS2179は、HlyA誘発溶血に影響を与えなかった（図。 Berghei感染赤血球（Plasmodium berghei感染赤血球）における溶血を阻害するために必要とされたものを超えた濃度（最大500μ M）でのS3A（14）。 P2Y2受容体に対する特異的な拮抗薬がないので、我々はトランスジェニックマウスにおけるHlyAの効果を調べた。 Ｈｌｙａ誘発溶血は、Ｐ２Ｙ２−／−およびＰ２Ｙ２＋／＋マウス由来の赤血球において類似していた（図１ ０Ａ）。 S3B）。 P2Y13の場合には、我々はp2Y13受容体（に向かっていくつかの選択性を表示することが報告されているアンタゴニストMRS2211を、テスト18）。 MRS2211は、ヒトおよびマウス赤血球においてHlyA誘発溶血を有意に減少させた（図。 S3C）。 この発見は、adp感受性P2Y13受容体を阻害するのではなく、刺激する必要がありますヘキソキナーゼ（ADPにATPを分解する）と我々の結果と矛盾します。 したがって、p2Y13受容体が関与している場合、ヘキソキナーゼとMRS2211は反対の結果を与える必要があります。 これは事実ではないので、P2Y13受容体は、HlyA誘発溶血に関与するP2受容体の可能性は低い候補である。 我々は、MRS2211によって産生される阻害が別のP2受容体を介して媒介される可能性を排除することはできません。
原則として、これはP2X受容体のみが考慮される。 図1.1.1. 図３Ａは、Ｐ２Ｘ受容体の非選択的遮断薬Ｅｖａｎｓ ｂｌｕｅがＨｌｙａ誘導溶血を強力に減少させたことを示し、Ｐ２Ｘ受容体がこの溶血に関与していることを示唆する。 赤血球で発現されるP2X受容体のうち、我々は以下の理由から、HlyA誘発溶血の最も可能性の高いメディエーターとしてP2X7を考えた。 Ｐ２Ｘ７受容体は、より大きな透過性状態への移行を経ることが知られており、これは最終的に特定の細胞において溶解をもたらす（１ ２）。 P2X7受容体は、チャネルタンパク質pannexin1（12）と相互作用することが報告されており、複合体は、臭化エチジウム（13）のようなより大きな分子に透過性 Pannexin1はヒト赤血球で発現し（19）、最近赤血球におけるATP放出チャネルとして示唆されている（20）。 ブリリアントブルー G（BBG）、ATP-2’、3′-ジアルデヒド（OxATP）、およびKN-62（21）：P2X7受容体はHlyA誘発溶血に参加するかどうかをテストするために、我々はP2X7の相対選択性 すべての拮抗薬は、ウマ、マウス、およびヒトの赤血球における溶血を濃度依存的に減少させた（図１）。 3). ウマおよびヒト赤血球は，マウス赤血球と比較して試験したすべての物質に対してより敏感であった。 これに関連して、マウスＰ２Ｘ７受容体は、ヒト受容体と比較してＫＮ−６ ２に対して感受性が低いことが知られていることに言及されるべきである（２ ２）。 P2X受容体拮抗作用による溶血に対する保護は、P2X7拮抗薬の例としてBBGを用いてヒト赤血球における精製HlyAの全濃度範囲について再び実証 3D）。 このアンタゴニストは，最大溶血を生じたＨｌｙａ濃度下でもＨｌｙａ誘発溶血に対して実質的な効果を示した。 Ｏｘａｔｐによる溶血の阻害を、マウス赤血球およびヒト赤血球における精製Ｈｌｙａを用いて検証した（図１）。 3E、インセット）。 新規の選択的、競合的なP2X7受容体拮抗薬A438079は、ヒト赤血球における溶血を減少させたが、マウス赤血球では効率が低かった（図10B）。 3階）。 P2X7受容体の原形質膜画分の免疫ブロットは、ヒトおよびマウス赤血球が関連するサイズのタンパク質を発現することを確認する（66kDa、図。 および図３ｇに完全に記載される。 S4B）。 HlyA誘発溶血におけるP2X受容体の相対的な寄与を完全に確立するためには、さらなる調査が必要である。 我々の現在のツールでは、我々は研究種のいずれかでHlyA誘発溶血における他のP2X受容体からの寄与の可能性を排除することはできません。
HlyA誘発溶血は、P2X7受容体拮抗薬によって阻害される。 ヒト（正方形）、マウス（満たされた円）、および馬（開いた円）におけるHlyA誘発溶血。 HlyA産生Eによって誘導される溶血。 大腸菌は、（A）エバンスブルー、（B）KN-62、および（C）ブリリアントブルー G（BBG）の濃度を増加させることによって減少した。 （Ｄ）種々の濃度の精製ＨｌｙａにおけるＢＢＧの濃度依存的効果。 ＡＴＰ−２’，３’−ジアルデヒド（Ｏｘａｔｐ）（Ｅ）も同様に、Ｈｌｙａ産生大腸菌および精製毒素（ｉｎｓｅｔ、Ｏｘａｔｐ、５ ０ ０μ Ｍ）によって誘導される溶血を減少させた。 (F)選択的P2X7アンタゴニストA438079は、主にヒト赤血球に効果を示した。 値は、平均±ＳＥＭであり、ｎ＝５〜１ ３である。 (G)P2X7受容体に対するC末端抗体を用いたイムノブロット(希釈1:200)。 左のパネルは、ペプチド前吸収と同様のブロットを示しています。
図10に示すように、
４Ａは、マウス（Ｐ２Ｘ７＋／＋およびＰ２Ｘ７−／−）赤血球におけるＨｌｙａ誘発溶血を示す。 マウス赤血球は，遺伝子型に関係なくＨｌｙａに応答して同様の程度の溶血を示した。 P2X7−/−マウスとP2X7+/+マウスは、もともとファイザーによって生成され、BALB/cの背景にバッククロスされました。 我々は、C57BL/6株は、P2X7受容体（23）のc末端に遺伝的変異を有することが知られているにもかかわらず、BALB/cとC57BL/6マウス（示されていないデータ）か これらのデータは、マウス赤血球に対するＡ４ ３ ８ ０ ７ ９の極めて小さな効果、およびマウス赤血球におけるＰ２Ｘ７受容体の低タンパク質発現と一致する（図 および３Ｇ）。
これらの結果は、マウス赤血球におけるHlyA誘発溶血に関与する少なくとも一つの追加のP2受容体があることを意味する。 Ｐ２Ｘ１およびＰ２Ｘ７は、ＢＢＧ、ＫＮ−６ ２およびＯｘａｔｐ（２ ４）について同様の阻害剤プロファイルを共有するので、本発明者らは、Ｐ２Ｘ１拮抗薬ＭＲＳ２ １ ５ ９およびＮＦ４ ４ ９を試験した。 MRS2159濃度依存的に馬(EC50:150μ m)とマウス(EC50:≤250μ m)から赤血球の溶血を阻害しました。 ヒト赤血球はアンタゴニストに対して相対的に鈍感であったが、250μ Mを超える濃度では、我々は小さく、統計的に有意な減少を見た（図10B）。 4A）。 この効果は、精製されたＨｌｙａを使用した場合にはるかに顕著であった（図１）。 4C）。 これは、それらが純粋な形態でＨｌｙａに供されるか、または他のｅ．ｃｏｌｉ成分と組み合わせて供されるかに関して、細胞応答に相違があり得ることを意味する。 NF449濃度依存的にヒトにおけるHlyA誘発溶血を阻害する（図。 4B）。 NF449は、この阻害剤（に対して相対的な耐性であるマウスP2X1受容体と一致してマウス赤血球ではるかに少ない効率的であった25）。 NF449がsuraminの派生物であるのにsuraminと赤血球の同じ容積の変更を引き起こさなかったことが強調されるべきです。 P2X1受容体の免疫ブロットは、様々な組織において最大4つのバンドを示すことが知られている;45kDaの非グリコシル化、60kDaのグリコシル化、および95/120kdaのバンドは、受容体の重合形態である可能性がある(26、27)。 我々の手の中で、P2X1受容体抗体は、マウスおよびヒト赤血球からの原形質膜のブロットにおいて、一貫して45KDバンドおよび非常に弱い60kDaバンド 4D）。 興味深いことに、本発明者らは、発現レベル６ ０ｋＤａバンドが、対照と比較して、Ｐ２Ｘ７−／−マウスにおいてはるかに高いことを見出した（３つの調製物において 4D）。 このimmunoblotで蛋白質のレベルはP2X7からのバンドの積み過ぎを避けるために調節されます−/−P2X7+/+マウスで60kDaバンドをほとんど検出できない残すマ P2X1受容体のこの見かけのアップレギュレーションは、潜在的にP2X7受容体欠損マウスにおける溶血表現型を隠す可能性があります。 まとめると、これらのデータは、P2X1およびP2X7受容体の両方がHlyA誘発溶血に関連するという仮説を支持する。 我々の結果は、P2X7受容体は、ヒト赤血球における溶血のためのより重要である重要な種間変異を指しています。
馬、マウス、およびヒト赤血球におけるHlyA誘発溶血に対するP2X1拮抗薬（MRS2159およびNF449）の効果。 （Ａ）赤血球を、Ｈｌｙａ含有ｅ．ｃｏｌｉ上清および増加濃度のｍｒｓ２ １ ５ ９（平均±ＳＥＭ、ｎ＝７〜８）と共にインキュベートした。 （Ｂ）赤血球を精製したＨｌｙａおよびｎｆ４ ４ ９の濃度の増加（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５〜６）とインキュベートした。 （Ｃ）精製Ｈｌｙａによって誘導される溶血における２ ５ ０μ Ｍ ＭＲＳ２ １ ５ ９の効果。 (D)P2X1受容体に対する抗体によるイムノブロッティング(希釈1:200); 右のパネルはペプチッドpreadsorptionが付いている平行しみを示す。 蛋白質単離と免疫ブロッティングを三回繰り返したが，同様の結果を得た。
Hlya誘導溶血は、パンネキシン1拮抗薬によって防止される。
カルベノキソロン（28）、メフロキンおよびプロベネシド（30）は、パンネキシン1の相対選択性を有する拮抗薬として使用されている。 カルベノキソロンは、同様の感受性を有する三つの種すべてにおいて溶血レベルを有意に低下させた（図。 5A）。 カルベノキソロンの効果は、HlyA濃度の全範囲について再び試験された（精製毒素、図10a）。 また、最大Ｈｌｙａ濃度の下でかなりの効果を示す。 メフロキンとプロベネシドはマウスと人道的な赤血球でのみ試験した。 メフロキンのEC50は、ヒトでは25μ m、マウス赤血球では18μ mであった。 プロベネシドは、2mMのEC50で、ヒト赤血球における溶血を阻害したが、マウス赤血球ではあまり効果的であった。 最近、既知のＣｌ−チャネル拮抗薬ＮＰＰＢおよびニフルミン酸は、同様にパンネキシンチャネルを阻害することが示されている（３ １）。 両方の物質は、ヒト赤血球に対する実質的により顕著な効果を伴って、HlyA誘発溶血を減少させた（図。 S5）。
ヒト、マウス、およびウマの赤血球のHlyA誘発溶血は、パンネキシン1拮抗薬によって阻害される。 溶血は大腸菌からのＨｌｙａ含有上清によって誘導された。 カルベノキソロン（Ａ）により溶血は濃度依存的に減少し，精製Ｈｌｙａによって誘発される溶血も広範囲の濃度（Ｂ）にわたって減少した。 HlyA産生Eによって誘導される溶血。 大腸菌もメフロキン（Ｃ）とプロベネシド（Ｄ）により減少した。 値は、平均±ＳＥＭとして与えられる；ｎ＝５〜１ ３である。p>