主任研究者:Zuben E.Sauna,PhD
Office/Division/Lab:OTAT/DPPT/HB
一般的な概要
タンパク質ベースの治療法の主な問題は、その免疫原性、すなわち、自分自身に対して不要な免疫応答を引き起こす傾向である。 免疫応答の一形態は、タンパク質に結合し、その治療効果を低減または排除する抗体を産生するＢ細胞の活性化である。 このような抗体はまた、生命を脅かす可能性のある合併症を引き起こす可能性がある。 従って、蛋白質ベースの治療上のプロダクトの臨床安全そして効力の決定の重大な部分は抗体の形成を誘発する傾向を測定しています。
タンパク質ベースの治療薬に対する免疫応答には、t細胞も含まれ、B細胞を活性化して抗体を産生するのに役立ち、タンパク質治療薬をブロックす これは、身体によって作られた天然タンパク質が何らかの形で欠陥がある場合に起こります。 その場合、T細胞は、欠陥のある天然タンパク質とは異なるため、外来であるかのように正常な人工タンパク質治療に応答する。 このようなT細胞応答の不一致は、出血を止めるために血栓を形成する身体の能力に重要なタンパク質であるタンパク質FVIIIの場合に時々起こる。 十分な量のFVIIIを持っていない、またはFVIIIが何らかの形で欠損している人々は、血液凝固が欠損し、過剰な出血を引き起こす疾患である血友病Aに罹患して 欠陥のあるFVIIIの問題は遺伝的に基づいています。 血友病Aの治療法はないが、FVIII治療タンパク質の注入は、慢性疾患の管理の最も成功した例の一つとなっている。 残念なことに、注入されたＦＶＩＩＩに対する抗薬物抗体の開発は、この戦略にとって重要な障害である。 免疫応答を発症する患者の治療は、より複雑で、効果が低く、非常に高価である。 現在、抗薬物抗体の発症傾向の個々の変動もまた、遺伝的差異に基づいている可能性があるように思われる。 これは、黒人アフリカ系の血友病Aを有する人は、補充療法として与えられた第VIII因子タンパク質に対する抗体を産生する可能性がヨーロッパのコーカサス系の患者の二倍であるという臨床観察に反映されている。天然のFVIIIと置換FVIIIとの間の不一致を防止するための1つの戦略は、免疫反応を誘発しないように遺伝子操作されたFVIIIタンパク質を設計することで しかし、人々の免疫系には非常に多くの違いがあり、研究者がすべての人にとって安全なFVIIIタンパク質を設計することはできない可能性があります。 したがって、我々は予測にパーソナライズされたアプローチを取ることを提案する-と回避-FVIIIタンパク質への免疫応答。 私たちの長期的な目標は、免疫系が遺伝子操作された治療タンパク質の特定のバージョンに反応する可能性が高い個人を特定するための遺伝子ベースのアプローチを開発することであり、これらの患者は免疫応答を引き起こす可能性が低いこれらのタンパク質のバージョンで治療することができます。
また、治療用タンパク質に対する抗体を産生するB細胞を誘発するタンパク質薬と天然タンパク質の三次元構造の違いの問題にも取り組んでい そのようなタンパク質の特定の部分が抗体形成を誘発するかどうかを予測するための現在の方法は、挑戦的で高価である。 したがって、我々はタンパク質をプローブし、その正確な形状を決定するためにアプタマーと呼ばれるDNAのような分子の小さな断片を使用しています。 アプタマーは、核酸が存在し、それらがアプタマーで発生する順序に依存する特定の形状に折り畳む核酸と呼ばれる分子の文字列で作られています。 したがって、どのアプタマーが分子の特定の部分にしっかりと結合しているかを特定することによって、分子のその部分の形状を予測することができ、それに適合する鍵の形状を知ることによってロックの形状を予測するようなものである。
我々は現在、FVIIIと保護抗原と呼ばれる炭疽菌毒素の部分の両方の形状を決定するために、この技術を使用しています。 例えば、アプタマーがFVIIIに結合する能力を失った場合、それはこの血液凝固タンパク質の一部が形を変えたことを示し、その治療活性を低下させる免疫反応を誘発する可能性を増加させるであろう。 我々は、治療タンパク質が抗体産生を誘発する形状を有するかどうかを決定するために、このアプローチを使用しています。 また、医薬品評価研究センターと協力して、既存の承認されたタンパク質医薬品（バイオシミラー）のコピーとして開発された新しいタンパク質製品を分析し、安全で効果的であることを保証するために、この技術を適応させるために協力しています。1)T細胞エピトープと特定のMHCクラスII抗原との相互作用を予測する。
科学的概要
1)T細胞エピトープと特定のMHCクラスII抗原との相互作用を予測する。
第VIII因子（FVIII）は、凝固カスケードの必須成分であり、凝固因子が欠損している個体は生涯の出血障害を示す。 ＦＶＩＩＩの治療（注入された）バージョンに対する免疫原性の発達は、血友病患者の成功した治療に対する重要な障害である。
血友病Aの症例の約50％は、F遺伝子のエクソン1-22の反転によって引き起こされ、その結果、それらのエクソンを表すポリペプチドが産生されるが、23-26は産生されない。 しかし、エクソン23-26を翻訳するF8プロモーター内のネストされた遺伝子があります。 それにもかかわらず、1-22の逆転はこの蛋白質から発生する重複のペプチッドが1-22と23-26間の接続点を含まないことを意味します。 したがって、この接合部を覆う注入された薬物−タンパク質ＦＶＩＩＩからのペプチドは、患者の免疫系に対して外来であるが、それらは一般に免疫原性ではな むしろ、内因性と注入されたFVIIIの違いによる免疫原性は、様々な事実、特に一塩基多型（Snp）による可能性が高いだけでなく、ミスセンス変異と欠失、ナンセンス変異、反転によるものであるため、注入されたFVIIIの免疫原性の問題に対する理想的な（しかしそうではない）解決策は、免疫応答を誘発することを避けるために、各患者のハプロタイプとHLA型に一致するFVIII置換を設計することである。 このような生物製剤をすべての患者に適合させるように設計することは実用的ではないが、特定の集団間（例えば、ヨーロッパの白人と黒人のアフリ そのような場合には、一方の集団が単一のバージョンのＦＶＩＩＩの利益の不釣り合いなシェアを得ず、他方の集団が同じ注入されたＦＶＩＩＩからのリスクの不釣り合いなシェアを負うことを確実にするために、内因性ＦＶＩＩＩのデザインを各グループに適応させることが望ましいであろう。
現在の技術は、fviiiのハプロタイプ背景の同定だけでなく、パーソナライズされた第VIII因子薬物製品の少なくとも限られた配列の開発を可能にします。 したがって、我々の短期的な目標は、1）ヨーロッパ-白人と黒人-アフリカ系の個人における異なるハプロタイプ（Snp）の定量的分布、2）これらの集団におけるMHCク 本発明者らは、異なる集団および／または個々の患者における個々のＦＶＩＩＩ産物の免疫原性を予測するために、このデータを使用する。
2）タンパク質-薬物立体配座エピトープの調査のためのツールとしてのアプタマーの開発。
アプタマー、複雑な立体配座を形成することができる核酸は、タンパク質立体配座、同定、および免疫原性部位の予測をマッピングし、免疫原性を回避するための潜在的なツールである。 私たちの研究室では、組換えヒト第VIII因子に対する一本鎖DNAアプタマーを開発しています。
我々は、ランダム化された60塩基領域に隣接するPCRのための定義された5’と3’領域を使用してアプタマーを生成するためのナイーブDNAライ NaÃve DNAライブラリーを変性させ、ssDNAセグメントをユニークな3次元形状に折り畳むことができました。 （60個のランダムな塩基は、理論的には460個のユニークな立体配座になります。）我々は、fviiiと折り畳まれたssDNAのプールをインキュベートし、反復SELEX（指数濃縮によるリガンドの体系的な進化）サイクルを介して、我々はタンパク質結合アプタマー
私たちの研究室では、サイクル3、5、8の個々のアプタマーのサンプリングを選択し、クローン化し、それらを配列決定しました。 我々は、予測された3-D構造、結合特性、およびFVIII活性への影響の分析を通じてアプタマーを特徴付けるために、これらのクローンを使用しています。 さらに、我々はアプタマーの進化に従うために、これらのクローンのin silico比較を行っています。
3）免疫原性と相関する可能性のあるタンパク質特性を評価するための多様な分析技術の使用。
Drsと共同で。 Mansoor Khan and Rakhi Shah(CDER製品品質部門)熱法(示差走査熱量測定、マイクロカロリメトリー、熱重量分析)、分光法(フーリエ変換赤外線、近赤外線、ラマン)、結晶学(X線回折)、核磁気共鳴を用いて薬物賦形剤の相互作用を解析します。
4）立体配座感受性抗体の特性評価。
治療上重要なタンパク質の立体配座エピトープを研究する別の方法は、立体配座の変化に敏感な抗体を開発し、特徴付けることです。 Chava Kimchi-Sarfaty博士（CBER）と共同で、フォンウィルブランド因子を切断し、血栓性血小板減少性紫斑病に関与するマルチドメインタンパク質である亜鉛メタロプロテアーゼADAMTS13の立体配座に敏感ないくつかの抗体を特徴とした。 我々の結果は、これらの抗体は、機能的および非機能的なADAMTS13を区別し、触媒サイクル中の立体配座遷移を分析するための有用な試薬である可能性がPublications
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fviiiをコードするF8遺伝子に変異がない場合の血友病Aの臨床症状：マイクロrnaの役割。
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樹状細胞における定量的HLAクラスII/第VIII因子（FVIII）ペプチド変異は、血友病Aにおける治療FVIIIタンパク質の免疫原性能と相関する。
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異なる治療用FVIIIタンパク質（tFVIIIs）のex vivo投与後の第VIII因子（FVIII）阻害剤の有無にかかわらず、健康なドナーおよび血友病-A（HA）患者からの樹状細胞（DCs）によ
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