DiabroticaカブトムシとGryllusコオロギの生殖不適合性とハイブリッドゾーンにおけるWolbachia細菌の役割

結果と議論

Diabroticaは、その分布において主に新方性であり、その起源は中央または熱帯南アメリカの地域である可能性が高いchrysomelidカブトムシの新世界属である(28)。 今日、その範囲は、ロッキー山脈の東と北緯35度線の北、デュランゴの北西（カリフォルニア州バハを除く）、カナダのオンタリオ州南部、および東ヨーロッパへの最近の導入（29）の米国のほとんどを包含する。 D.v.zeaeの分布は、メキシコ中央部のグアテマラからテキサス州のパンハンドルとオクラホマ州南部の一部までの地域を包含する（28）。 トウモロコシの生産の拡大は、メキシコから北へのD.v.zeaeの移動を容易にし、D.v.との二次接触の領域をもたらした可能性がある。 亜種が交雑するテキサス州北部のvirgifera(13)。

テキサス州南部のStephenvilleとUvaldeからサンプリングされたD.v.zeaeの成人はWolbachiaに感染していなかったが、D.v.virgiferaの米国およびカナダの分布内の15サイトからのd.v.virgiferaの成人はDuncanとWillcox、AZの二つのサイトを除いて、Wolbachiaに陽性であった。 ノーステキサスハイブリッドゾーン内の三つのサイトから二十から一大人もd.v.zeaeの変化の範囲内のインデックスパターンを持つ五つの標本を含む、正 クリサンパーソナルコミュニケーション）。 Ｕｒｂａｎａ，ＩＬ，Ｍｏｒｉａｒｔｙ，Ｎ ｍおよびＢＬＡＣＫＳＢＵＲＧ，ＶＡからの単一個体からのＷｏｌｂａｃｈｉａのｆｔｓｚ遺伝子の配列は同一であった。 さらに、（i）一般的なB特異的プライマー、（ii）ftszf1、および（iii）ftszr1で得られたftsZ断片のDraIによる消化は、すべてのサンプリングされた場所からD.v.virgiferaの集団がWolbachiaの同じ株 １ ６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を用いた系統発生分析は、この株を、他のＷｏｌｂａｃｈｉａ株との未解決の関係を有する基底位置に置いた（結果は示されていない）。 ＦＴＳＺ遺伝子（２ ３、３ ０）はまた、Ｄ．ｖ．ｖｉｒｇｉｆｅｒａ由来のＷｏｌｂａｃｈｉａを基底株として同定し、Ａ群の他のほとんどの株とは異なる（図１ ０Ａ）。 1). Ｄ．ｖ．ｖｉｒｇｉｆｅｒａの分布全体にわたる感染と株型の一貫性と，北米における本種の急速な広がりを考えると，ｄ．ｖ．ｖｉｒｇｉｆｅｒａの米国およびカナダにおける東進拡大の前に，米国南西部またはメキシコ北西部で感染が起こったことを示唆した。 感染していないD.v. アリゾナ州南部のvirgifera個体群は、元の感染していない個体群の残党であるか、または感染を失った孤立した個体群を表すことができる。

D.v.virgiferaとD.v.zeaeは形態学的に非常に似ています（13）が、d.v.virgiferaで特徴的で上腕骨に限定されているか、D.v.zeaeには存在しない黒いelytral maculationを除いて。 亜種は両方ともトウモロコシに見られるので生態学的に隔離されない;同じ休眠のメカニズムがあるのでそれらは一時的に隔離される。 行動研究は、両方の亜種が同性フェロモンに応答し、何の差別が交配選択実験（中に行われなかったため、生殖への任意のpremating障壁を示すものではありません13）。 交配すると、二つの亜種は一方向に肥沃であった、すなわち、中央メキシコからのD.v.zeae男性はサウスダコタからのD.v.virgifera女性と交配したが、相互クロスは非常に少数から実行可能な子孫を生産しなかった（14）。 一方向非互換性がD.v.で識別されるWolbachiaの伝染によって引き起こされるかどうかテストするため。 ｖｉｒｇｉｆｅｒａ，感染したテトラサイクリン処理Ｄ．ｖ．ｖｉｒｇｉｆｅｒａから相互交配を行った。 その結果、D.v.virgiferaに感染するWolbachiaの株は、感染したd.v.virgifera男性がテトラサイクリン処理された未感染のD.v.virgifera女性と交配したときに孵化する0.4％の5627卵のみで、重度の細胞質不適合性を誘導することができることを示している（表1、クロスd）。

また、テキサス州Stephenvilleの標本を用いてD.v.zeaeの実験室コロニーを確立し、テキサス州Stephenvilleの標本を用いて確認した。d.v.zeaeの雌がd.v.virgiferaの雄と交配したことは、逆交配が正常な卵の孵化をもたらすのに対し、非常に少数から全く子孫を産生しない（表1、fとHを交配）（14）。 テトラサイクリン処理したD.v.virgifera雄を用いて交配を繰り返すと、不適合性はもはや存在せず、卵の孵化率は対照と有意に異ならないことが観察された（表1、cross g）、これら二つの亜種間の一方向性交配の不適合性はD.v.virgiferaにおけるWolbachiaの存在によって引き起こされることが確認された。

北米のグリルス属のいくつかのメンバーの間でも同様の生殖不適合が報告されている。 属Gryllusは、東アジアと太平洋（を除いて、世界のほとんどに分布している31）。 種の数に基づいて、属はGryllusに似たいくつかの属が記録されている新世界またはアフリカに由来する可能性があります（32）。 北米では、Gryllus属にはいくつかの密接に関連した種があり、そのうちのいくつかは形態学的特性のみに基づいて区別することが困難である。 世紀の初めに、このグループは、変動度の高い単一の種とみなされました（33）。 その後の作品では、主にいくつかの種の間で差別化された呼び出し歌を使用しています（34）。

Gryllus属のいくつかの種は、一方向または双方向に互換性がないことが示されています。 米国東部におけるG.pennsylvanicus男性とG.firmus女性の間の単方向の非互換性（19）は、D.v.virgiferaとD.v.zeaeのそれを反映しています。 我々は、G.firmusを除いて、我々が研究したすべてのGryllus種からの標本は、通常、Wolbachiaに感染しており、時には複数の株で感染していることを発見しました（図12A、12B、12C、12C、12C、12C、12C、12C、 2および3）。 この属の様々な種の間で報告された不適合性は、この細菌の感染によって説明される可能性がある。 私たちの研究では、以下の感染パターンが示されています。 HUMBOLDT County、NV、およびWAYNE County、UTからサンプリングされたG.integerの個体群は、「整数型」と呼ばれるWolbachia細菌の同じ株に感染しています。”カリフォルニア州デイビスでサンプリングされた集団は、G.rubensで見つかったのと同じWolbachia株を保有していた個体を除いて、integer型に感染していました。「NMのLas Crucesでサンプリングされた集団には、rubens型のWolbachia株に感染した2人の個体と、rubens型およびinteger型の株に二重に感染した3人の個体がいました。 テキサス州オースティンおよびダラスのG.integer集団も同じ細菌株を保有しており、16S rRNA遺伝子およびftsZ遺伝子に基づいて、LAKE PlacidおよびGAINESVILLE、FLからのG.rubensに見 このルーベンス型株は，ゲインズビルから採取したＧ．ｏｖｉｓｏｐｉｓの標本でも発生する。 Gの標本しか入手できませんでした。 ｔ．ＷａｌｋｅｒとＴ．Ｚｅｒａの実験室培養物からの同化であり，後者の培養物はＴ．Ｗａｌｋｅｒのコロニーから得られた。 両培養からの個体は，ｆｔｓｚ遺伝子の配列がｒｕｂｅｎｓ型Ｗｏｌｂａｃｈｉａ株と同一であった同じ株に感染した。 16S rRNA遺伝子断片配列は、この種の株は、大腸菌でテトラループGCAAの最初の位置に対応するグアニンからチミンへの大腸菌の位置380でtransversionを有することを示 “Assimilis型”株では、ループはTAAAで構成されています。 この転化は、これまでに知られている他のWolbachia16S rRNA配列には見出されない。

G.pennsylvanicusの集団は、より複雑な感染パターンを示す。 我々がサンプリングした分布のほとんどを通して、G.pennsylvanicusは感染型の多型である。 カナダのアルバータ州レスブリッジでサンプリングされた個体群は，Ｇ．ｒｕｂｅｎｓ，ｇ．ａｓｉｍｉｌｉｓ，Ｇ．ｉｎｔｅｇｅｒ，Ｇ．ｏｖｉｓｏｐｉｓで見られるものとは異なるＷｏｌｂａｃｈｉａ株の存在を示した。 本発明者らは、この株を「pennsylvanicus-type」株と呼ぶ。 イリノイ州中部からサンプリングされた39の感染標本のうち、38はpennsylvanicus型株を保有していたのに対し、一つの標本はrubens型株を保有していた。 南に150kmの地域、FARINA、ILは、pennsylvanicus型またはrubens型株またはその両方に感染した個体の混合物を示した。 Ａｎｎａｒｂｏｒ，ＭＩから採取した二つの標本のうち，一つはｒｕｂｅｎｓ型株を持ち，もう一つはｐｅｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓ型とｒｕｂｅｎｓ型株に二重に感染した。 アナーバーの北東215kmに位置するカナダのオンタリオ州ロンドンでサンプリングされた人口では、19人の感染者のうち10人がペンシルベニア型、1人がルーベンス型、8人がペンシルベニア型とルーベンス型の二重感染者であった（図1）。 3a）。 この多型パターンは、バーモント州とペンシルベニア州から収集されたG.pennsylvanicusの標本で継続しています。 バージニア州とノースカロライナ州では、我々はpennsylvanicusまたはルーベンス型株のいずれかに感染した個人のみを検出しました。 Gの人口。 北米のpennsylvanicusは、rubens型またはpennsylvanicus型に感染している個体と、両方の株に二重に感染している個体と感染していない個体の混合物である（図2）。 3). これまでの結果は、北アメリカ東部のg.pennsylvanicusの集団では、ルーベンス型感染症は南よりも北で高い頻度であることを示しています（図。 3a）。 さらに、本発明者らは、両方の株が発生するほとんどの地域において、二重感染個体もまた存在することを見出した（図１および図２）。 および３ａ）。

Wolbachia感染（35）の広がりに関連する”ドライブ”の結果として、我々は、レスブリッジ、カナダを除いて、サンプリングしたG.pennsylvanicus集団の遺伝的構造は、rubens-とpennsylvanicus型Wolbachia株の存在に影響されていることを提案する。 したがって、これらの地域で収集されたG.pennsylvanicusサンプルをGryllus near(nr.)pennsylvanicusと呼び、これらの集団で見つかった感染タイプによって課される分類学的状態の曖昧さGをサンプリングしました。

フロリダ州レークプラシッドのゲインズビルとアーチボルド生物学的ステーションから、フォートフィッシャー、ノースカロライナ州からfirmus。 これらの地域からサンプリングされた35の標本の三十から二は感染していませんでした。 3人の感染者はフロリダ州ゲインズビルから来た。 二つはrubens型を、三つはpennsylvanicus型Wolbachia株を保有していることが判明した（図。 および３ａ）。 この知見は，特にＧ．ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓがフロリダ州ゲインズビルから知られていないという事実に照らして，これら二つの菌株の感染がＧ．ｆｉｒｍｕｓの集団に移動していることを示唆している。

ftsZ遺伝子を用いてGryllus種におけるWolbachiaの異なる株間の関係を解析したところ、integer型およびrubens型株は単系統群を形成し、これまでに知られている他のすべてのB群Wolbachia株に基礎となるpennsylvanicus型株とは密接に関連していないことが示された。 Ｗｅｒｒｅｎらによって報告されたＷｏｌｂａｃｈｉａの株。 (23)G.pennsylvanicusではrubens型である(Fig. 2).

我々は、gryllus属の上記のメンバーの感染は、SmithとCade（17）、CadeとTyshenko（18）、およびHarrison（19）によって得られた観察された交配の非互換性の説明を提供し、この属のいくつかのメンバーの種 G.rubensとG.integerの間で観察された双方向の不適合性は、これら二つの種で見つかったWolbachiaの二つの異なる株の感染の結果である可能性が高い。 フロリダ州のg.ルーベンスとG. これらの集団はルーベンス型細菌を運ぶので、テキサス州からの整数（17、18）を説明することができます。 我々のデータは、通常種を区別するために使用される程度の曲の違いにもかかわらず、テキサス州のG.rubensとG.integerが同じ種である可能性があるというSmith and Cade(17)

G.pennsylvanicusがWolbachiaに感染しており、G.firmusは通常は感染していないことを考えると、G.pennsylvanicus男性がG.firmus女性と互換性がないことを示す交配（19）は、Wolbachiaによって引き起こされる細胞質の不適合性に起因するものと解釈することができる。 我々の解釈は、さらにこれら二つの集団で観察されたミトコンドリアパターンによって実証されている、すなわちG.firmusとG.pennsylvanicusは、これら二つの集団が同定されていることにより、異なるミトコンドリアのタイプを持っている;しかし、G.pennsylvanicus mtDNAは容易にG.firmusの集団にintrogressesが、逆は発生しません(36)。 このパターンは、g.pennsylvanicusがWolbachiaに感染した場合、ハイブリッドゾーンの個体の大部分が感染した女性の子孫の結果であり、この場合はGを運ぶために観察される。 pennsylvanicusのmitochondrialタイプはmaternalally受継がれたWolbachiaの伝染と一緒に。

ルーベンス型細菌を運ぶG.ovisopis男性とG.firmus女性（T.Walker、personal communication）との間の一方向性の非互換性も、この感染に照らして解釈することができます。 Ｇ．ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓの雄とｇ．ｏｖｉｓｏｐｉｓとｇ．ｆｉｒｍｕｓの雌との交配による子孫の欠如は，これら二つの株が不適合を引き起こす可能性があることを示した。 私たちは、G.ovisopisとG.ことを知っています。 rubensは同じWolbachia株を持っているので、G.rubensとG.pennsylvanicusの間で観察された双方向の不適合性の可能性が高い原因は、彼らが抱くことができる異なるWolbachia株です。

ftsZ遺伝子を用いて、pennsylvanicus型とrubens型の株の間に39bpの違い、pennsylvanicus型とinteger型の株の間に41の違い、rubens型とinteger型の株の間に22の違いを観察しました。 比較のために、同じ遺伝子セグメントでは、Drosophila simulans HawaiiとD.simulans Riverside（23）で見つかった双方向に互換性のないWolbachia株の間に唯一の塩基の変化があります。 この証拠とそれぞれのＧｒｙｌｌｕｓ種間の交配で観察された不適合性に基づいて，ｒｕｂｅｎｓ-，ｉｎｔｅｇｅｒ-，およびｐｅｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓ型株は双方向的に不適合であると予測した。

ハリソンとアーノルド（20）によって指定されたG.pennsylvanicusとG.firmusの間のハイブリッドゾーンは、種–種の相互作用よりも複雑です。 ブルーリッジ山脈とアパラチア山脈に沿ってサンプリングしたサイトのいくつかは、G.pennsylvanicus集団内の感染タイプの斑状の分布を示しています（図。 3a）。 したがって、この領域では、rubens-またはpennsylvanicus型Wolbachiaに感染した未感染のG.firmus、G.nr.pennsylvanicusと、rubens-およびpennsylvanicus型Wolbachia株の両方に感染したG.nr pennsylvanicusの集団間で相互作用が起こり得る。 Ｇｒｙｌｌｕｓ種におけるＷｏｌｂａｃｈｉａ感染，特にＧ．ｎｒに見られる複数の感染タイプが挙げられた。 pennsylvanicusの人口は遺伝子の流れへの制限が伝染タイプの相違のために人口内で起こることができることを示します。 これらの集団における個体の生殖の成功は、それらの感染プロファイルならびにそれらが交尾する個体の感染プロファイルに依存する。 Ｇｒｙｌｌｕｓ属の種を構成するものの概念は，それらが保有するＷｏｌｂａｃｈｉａ感染症に照らして再評価されなければならない。Wolbachiaの感染症は、感染した女性が感染していない女性（上に持っているという利点の結果として、人口を掃引することができます35）。 Gということを考えると、 pennsylvanicusとG.firmusは実験室（19）でハイブリダイズすることが示されており、フィールド（21）でハイブリダイズの証拠があることが示されており、G.firmusの現在の分布は、感染した集団のスイープが移動した広い領域からの残留物と解釈することができる。 別の説明は、同じWolbachia株を持つ複数の感染部位である可能性がありますが、Wolbachia細菌が種間で水平にどのように伝達されるか、またはそれらが獲得される頻度 したがって、我々は、感染が一つの場所で発生し、その後広がっていることを、最も倹約的な説明を選択します。 実際、我々のデータは、Wolbachia感染症が地理的要素を有し、rubens型はそれが優勢である南部に起源を有することを示唆している（図2）。 3a）。 しかし，北アメリカ東部のｇ．ｎｒ．ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓ個体群では，北部でサンプリングされた個体群でｒｕｂｅｎｓ型感染が流行している。 これらの地域は、rubens型株に均一に感染したGryllusの集団から最も遠い点であり、報告されたGから遠い点である。 ルーベンスの人口（図）。 3aおよびb)。 Ｒｕｂｅｎｓ型感染は，ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓ型株の東進前に北アメリカ東部に存在したＧｒｙｌｌｕｓの集団を通って移動したことを提案した。グリルス集団において、二重感染個体は、二方向に相容れない二つの細菌株が存在する集団における選択圧力の結果である可能性がある（図１および図１）。

および３ａ）。 このような状況では、両方の感染が一つのクリケットで生き残ることができれば、女性はどちらかの細菌株を運ぶ男性と互換性があるため、二重に感染している個体が選択されるであろう。 二重に感染した女性は、同じウォルバキア株に感染した男性とのみ正常に再現することができ、単独で感染した女性よりも利点を持っているので、二重に感染した個人の第三の感染スイープは、人口を介して続くことができます。 複数の感染は、昆虫の分類群（37-39）の様々なから報告されており、二重に感染した男性は、他の昆虫（37-41）で単独で感染した女性と部分的にまたは完全に相容れないことが示されている。 我々は、二重感染は、同じまたは非常に密接に関連する分類群で発生するウォルバチアの二つの双方向に互換性のない株との単一の感染症が発生する地

特定の16S rRNAプライマーを用いたPCRを用いた温帯昆虫分類群のスクリーンでは、多種多様な家族や注文からの16％の615昆虫分類群がWolbachia（R.G.およびH.M.R.、未公開データ）に感染しており、熱帯昆虫についても同様の感染率が得られていることがわかった（42）。 この感染の頻度を考えると、我々は、他の昆虫ハイブリッドゾーンは、少なくとも部分的にウルバチア感染と細胞質の不適合性によって定義されることが 昆虫のいくつかの属は、その自然史の結果として、ウルバチアに感染しやすくなる可能性があります。 これらのグループ内の種分化は、Wolbachiaが果たした役割に関して検討する必要があります。