Abstract
Microsporidiaは、幅広い脊椎動物および無脊椎動物の宿主に見られる偏性の細胞内真核生物である。 Encephalitozoon cuniculiは国内ウサギおよびげっ歯類に一般にあり、また人間を含む犬、他のcanidsおよび霊長類に、起こります。 リボソームRNA遺伝子のDNA配列決定は、種レベルにこれらの寄生虫を同定し、E.cuniculi株I、II、およびIIIを定義するために使用されています。 この株は、免疫不全のヒトからの分離株でも同定されており、この寄生虫種の人獣共通感染の可能性を示唆している。 無症候性イヌからの延長された微小胞子性胞子脱落も報告されている。
Encephalitozoon cuniculiは、小胞子門の偏性細胞内原虫であり、国内のウサギおよびげっ歯類の一般的な寄生虫である。 時折、これらの寄生虫は、犬、青いキツネ（Alopex lagopus）、および少数の他の野生の肉食動物を含む他の宿主で報告されている。 報告数の増加はまた、E.cuniculiによって引き起こされるヒトの臨床疾患を記述するが、ヒト感染の原因は不明である。
歴史的に、寄生虫の同一性は形態学的および時には超微細構造的特性に基づいていた。 最近、Encephalitozoon属の形態学的に類似したメンバーは、免疫学的特徴とリボソームRNA遺伝子の分子特性を使用して種分化されています。 E.cuniculiの分離株は、リボソームRNA遺伝子の内部転写スペーサー（ITS）領域における4塩基配列（5′-GTTT-3’）の繰り返し数に基づいて、さらに株I、II、またはIIIとして分割されて 二つの犬E.cuniculi分離株は、4つのシーケンス繰り返しの存在に基づいて株IIIと命名されました。 続いて、欧州からの２つの報告において、４種以上のヒト単離株が、系統ＩＩＩ（単離株「Ｄｏｎｏｖａｎ」Ｇｅｎｂａｎｋ Ｘ９ ８ ４ ６ ６、ＣＤＣ：Ｖ２ ８ ２、およびＩＰＺ：Ｍ Ｘ−Ｈ５）および系統ｉとして同定されている。 疫学的データは直接犬からヒトへの伝達を確認していないが、分子データは犬が寄生虫の潜在的な貯水池として役立つ可能性があることを示唆している。 さらに、無症候性犬による胞子の長期的な放出が記録されており、寄生虫の人獣共通感染の可能性がさらに強化されている。
材料と方法
寄生虫分離株
7匹の子犬と3匹の犬の遺体は、死後の評価のためにテキサス獣医診断研究所に18ヶ月にわたって提出された。 動物はテキサス州の異なる地域からの4つの無関係な情報源からのものでした。 各症例の組織学的所見から脳萎縮症と診断した。 5つの分離株は、神経疾患で死亡した5-7週齢のボストンテリア子犬同腹仔（男性2人、女性3人）の脳または腎臓組織から得られた（分離株1-5、リター1）。 分離6は、10週齢のオスのマルタ-テリアの脳に由来し、神経疾患で死亡した1匹の同腹子（リター2匹）のうちの4匹であった。 7匹目は、10週齢のメスのミニチュアプードルの子犬（3匹目）の脳に由来し、神経学的疾患で死亡した。 単離物8は、腎不全で死亡した18ヶ月の女性のミニチュアダックスフンドの腎臓から得られた（表1）。
分子分析によりEncephalitozoon cuniculi株IIIとして特徴付けられたイヌ分離株の概要。
分子分析によりEncephalitozoon cuniculi株IIIとして特徴付けられたイヌ分離株の概要。死後、組織を無菌的に収集し、ＰＢＳ、ｐＨ７を用いて均質化した（Ｔｅｎ Ｂｒｏｅｃｋ ｔｉｓｓｕｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ；Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）。２、プラス２×抗生物質−抗真菌溶液（Ｇｉｂｃｏ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍ Ｄ）。 微小胞子は、遠心速度を６ ０ ０ｇに変更することによって修飾された前述のＰｅｒｃｏｌｌ密度勾配法を使用して宿主組織ホモジネートから精製した。 前に記載したように、５％ウシ胎児血清および２×抗生物質−抗真菌溶液（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ１ ６ ４ ０培地を使用して、微小胞子をＲＫ−１ ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３ ７）中で増殖させた。 寄生虫培養とＤＮＡ分析は，様々な症例サンプルの受領に基づいて数ヶ月にわたって行われたため，偶発的な交差汚染の可能性は無視できた。
DNA単離
単離株1-6および8については、寄生虫は、分子特性評価のための適切な胞子を生成するために短期培養で成長させた。 単離体７については、寄生虫を、ＤＮＡ単離のために新鮮な子犬の脳組織から直接精製した。 分離株の大部分について、細菌培養のための製造業者のプロトコールに従って、Instagene Matrix（BioRad、Hercules、CA）を使用して精製胞子からDNAを抽出した。 分離株６および８を用いた分子作業のいくつかのために、胞子を前述のように処理し、ｄｎａ回収を最適化するために、ｐａｒｔｉｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｇｅｌ ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ ｔｕｂｅ ｓｙｓｔｅｍ（ｌｉｇｈｔ ｐｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌ ｓｙｓｔｅｍ；５Ｐｒｉｍｅ→３Ｐｒｉｍｅ Ｍａｎｕｆｅｒ，Ｗｅｓｔｃｈｅｓｔｅｒ，Ｐ Ａ）を使用して、標準的なｐｈｅｎｏｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ抽出法によって胞子からＤＮＡを抽出した。 ＤＮＡをエタノール沈殿させ、ペレットをＴＥ（１ ０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ、１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７． Encephalitozoon hellemの組織培養由来胞子から抽出されたDNAを陽性対照として使用し、試薬のみ陰性対照をすべての抽出および配列決定反応に含めた。
dna small subunit ribosomal DNA(SSU rRNA)遺伝子の部分配列決定と解析
8つの分離株のそれぞれからSSU rRNA遺伝子の5’末端の一部を、前述のようにプライマー対PMP1とPMP2を用いて増幅した。 各単離物についてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応を、製造業者の説明書（Ｇｅｎｅａｍｐ ＰＣＲ ｃｏｒｅ ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｎ８ ０ ８−０ ０ ０ ９；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ／Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ）に従って行った。 増幅は、サーマルサイクラー（ＰＴＣ−２ ０ ０Ｐｅｌｔｉｅｒ；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，Ｍ Ａ）で行った。 95℃で5分間の最初の変性の後、Taqポリメラーゼ（0.5U）を各25μ l反応物に添加した。 次いで、試料は、３ ５サイクルの変性（９ ４℃、３ ０秒）、アニーリング（６ ０℃、３ ０秒）、および伸長（７ ２℃、１分）を経て、最終的な伸長のために７ ２℃で１ ０分間実施した。 未結合ヌクレオチドをクロマトグラフィーカラム（Micro Bio-Spin30;BioRad）を用いて除去した。 試料は、自動配列決定のために処理されるまで、４℃で保持した。
ITS領域のDNA分析
各単離体のリボソームRNA遺伝子のITS領域の一部を、上記の増幅方法を用いて、int530fおよびint580rプライマー対を用いてPCR 得られたＰＣＲ産物を、自動化ＤＮＡシーケンサ（モデル３ ７ ７；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ）中で配列決定した。市販のキット（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｂｉｇｈ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ−Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて、各単離物のＰＣＲ増幅ＤＮＡを自動配列用に増幅した。＜／ｐ＞＜ｈ３＞ＤＮＡ自動配列＜／ｈ３＞＜ｐ＞各単離物のＰＣＲ増幅ＤＮＡを; Promega,Madison,WI)製造業者の指示に従ってください。 全ての反応は、サーモサイクル（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｉｎｉｃｙｃｌｅｒ）中で実行した。 次いで、試料は、３ ５サイクルの変性（９ ４℃、３ ０秒）、アニーリング（６ ０℃、３ ０秒）、および伸長（７ ２℃、１分）を経て、最終的な伸長のために７ ２℃で１ ０分間実施した。 伸長産物をクロマトグラフィーカラム（Ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ；Ｂｉｏｒａｄ）を使用して精製し、真空遠心分離機（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，ＮＹ）中で乾燥し、自動シーケンサ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ３ ７ ７ＡＢＩ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で配列決定されるまで−２ ０℃アライメントソフトウェア（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ；Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｍ Ｉ）を使用して、各寄生虫単離物のＳＳＵ ｒＲＮＡ遺伝子の一部について、≧２ ６ ５塩基のコンセンサス配列を得た。＜／ｐ＞＜ｐ＞＜ｐ＞＜ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜Ｐ＞＜ｐ＞＜ｐ＞＜ｐ＞＜ｐ＞＜ｐ＞ これらの配列は、単純なBLASTN検索を使用してNCBI GenBankデータベース内の以前に報告されたEncephalitozoon配列に対する相同性を評価した。
二本鎖DNAヘテロ二重移動度アッセイ
単離物6からのDNAは、前述のようにプライマー対int530fおよびint580rを用いたPCRによって増幅された。 ＰＣＲ増幅産物は，種々の宿主からのＥ．ｃｕｎｉｃｕｌｉの以前に特徴付けられた分離株を用いてヘテロ二重およびホモ二重の生成のためにアッセイした。
結果
組織培養において、8つの別々の臨床発生からの寄生虫分離株の合計4つが確立された。 寄生虫の光学顕微鏡的特徴とｉｎｖｉｔｒｏ成長特性は，イヌおよび他の宿主で以前に報告されたマイクロスポリディアンであるＥ．ｃｕｎｉｃｕｌｉであることを示唆した。 全ての標本が、以前に公表された配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｌ３ ９ １ ０ ７Ｄｅｚｏｒｇｏａ、Ｌ１ ７ ０ ７ ２／ＥＺＯＲＧＳＭＡＬＬ；Ｘ９ ８ ４ ７ ０／ＥＣＤＳＲＲ２）と１ ０ ０％の相同性を示したので、各単離体のＳＳＵ ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端の部分配列決定（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａ Ｆ１ ４ ４ ２ ４ ６−ＡＦ１ ４ ４ ２ ５ ３）は、寄生虫のｅ．ｃｕｎｉｃｕｌｉとしての同一性を確認した。
ヘテロデュプレックス分析とリボソームRNA遺伝子のITS領域の配列決定は、さらに、様々なげっ歯類、ウサギ、およびヒト宿主からのE.cuniculi分離株の間で微妙 図1は、イヌ分離株6と以前に特徴付けられた株III分離株との間のDNAホモ二重形成、ならびに分離株6と他のE.cuniculi株との間のヘテロ二重形成を示す。レーン：1、塩基対マーカー;2および3、子犬の脳（BR）および腎臓（KID）組織からの寄生虫のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アンプリコンからのホモデュプレックス;4-6、各E.cuniculi株のホモデュプレックス; 図7および図8は、子犬の腎臓からの寄生虫のPCRアンプリコンとE.cuniculi株IおよびIIとの間に形成されるヘテロ二重鎖（矢印）、9および図10は、子犬の腎臓と脳からの寄生虫のPCRアンプリコンとE.cuniculi株IIIとの間のホモ二重鎖であり、DNA配列が同一であることを示している。レーン：1、塩基対マーカー;2および3、子犬の脳（BR）および腎臓（KID）組織からの寄生虫のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アンプリコンからのホモデュプレックス; 図4-6、各E.cuniculi株のホモ二重；7および8、子犬の腎臓からの寄生虫のPCRアンプリコンとE.cuniculi株IおよびII（矢印）からの寄生虫のPCRアンプリコンとE.cuniculi株IIIとの間に形成されたヘテロ二重；9および10、子犬の腎臓および脳からの寄生虫のPCRアンプリコンとE.cuniculi株IIIとの間のホモ二重であり、DNA配列が同一であることを示す。
ディスカッション
E.cuniculiの複数の株の生物学的意義はまだ明らかにされていませんが、寄生虫株を区別する能力は、疫学研究における感染源を追跡するためのツールを提供する可能性があります。 E.cuniculi株IIIとして犬から8microsporidian分離株を識別する我々の分子データは、2犬分離株IIIとして分類された以前の研究と一致します。 ウサギ、マウス、およびキツネの分離株は、株ｉまたはＩＩとして報告されている。 これらのデータは、III株が主に犬と関連している可能性があることを示唆している。 ヒト分離株は、西半球では株IIIとして、ヨーロッパでは株Iとして同定されている。 Eへの人間の暴露のソース（複数可）が。 cuniculiは不明であり、動物が感染の貯水池として役立つ可能性があるという証拠が増えており、動物と人との間の生物の人獣共通感染の可能性がある。 米国では犬は一般的なペットであり、スイスや他のヨーロッパ諸国ではウサギはペットや食べ物として頻繁に飼われているため、ペットの所有権の地理的および文化的な違いが人間の暴露に役割を果たす可能性があるという興味深い可能性がある。
臨床的に正常なボストンテリアの両親とリター1からの1匹の子犬からの糞便および尿サンプルの検査は、同腹仔の死亡後⩾4ヶ月間胞子脱落の低レベ この観察はさらに、犬の尿および糞便排泄による局所的な環境の汚染を通じて、犬からヒトへの寄生虫の直接または間接的な伝達の可能性のある機 疫学的研究では、ペットの所有権/曝露とヒト微小胞子性感染との関係を評価していないが、子供が明白な脳脊髄症を有する子犬に曝された単一のケースでは、1人の3人の子供が血清変換された。 様々な宿主からの追加のE.cuniculi分離株は、微小胞子感染のリスクが高い免疫不全者の世帯で潜在的に感染したペットを維持するリスクをさらに評価す私たちは、この研究のために犬の組織を提供するためのテキサス獣医医療診断研究所の病理学者ジェイ*ホフマン、ジョアン*マンセル、およびブルース*アビットに感謝します。
謝辞
私たちは、この研究のために犬の組織を提供するために。
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この研究は、国立衛生研究所からの助成金AI-40232によって資金を供給されました。p>