Frontiers In Pharmacology

Introduction

微生物形質転換は、様々なクラスの有機化合物の構造変換のための最も重要なアプローチの一つである。 この技術は、グリーン化学、すなわちで首尾よく採用されています。 創薬開発プログラムは、コア構造の周りの化合物の優れた供給源を提供し、その後、様々な生物学的活性のためのスクリーニングを提供します。 いくつかの例では、微生物形質転換は、従来の方法によって達成することが困難な有機化合物の位置選択的、化学的、および立体選択的変換のための重 ら、２ ０ ０ ３；Ｍｉｈｏｖｉｌｏｖｉｃ ｅ ｔ ａ ｌ． 2003年;Yildirim et al. ら、２ ０ ０ ３；Ｂａｒｔｍａｎｓｋａ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ５；Ｂｏｒｇｅｓ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ９；Ｃｈｏｕｄｈａｒｙ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ １；Ｒａｖｉｎｄｒａｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2012). ステロイドの炭化水素骨格の不活性な性質のために、それらはしばしば従来の合成方法によって誘導体化されることが困難である。 従って、微生物変形はステロイドの構造変化のために頻繁に使用されます。 真菌におけるP450シトクロム酵素系の存在は、全細胞生体触媒を立体特異的および位置特異的なヒドロキシル化のための効率的なツールにする（Choudhary et al. ら、2005a;Tong and Dong,2009;Kristan and Riëner,2012;Baydoun et al., 2014).Drostanoloneのプロピオン酸塩、drostanolone pentanoateおよびdrostanolone enanthateのようなdrostanoloneおよびエステルの派生物は、（1）脂肪を得ないで彼らの筋肉を増強するのに運動選手が使用する同化androgenicステロ さらに、drostanoloneおよびエステルの派生物にエストロゲンの生産を禁じる機能があります。 Drostanoloneのプロピオン酸塩のエステルはまたmasteron（Chowdhury等の銘柄の下で乳癌の処置のために、使用されます。 ら、１ ９ ７ ６；Ｃｌａｖｅｌ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ８ ２；Ｍａｒｉｎｏｖ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ８ ６；Ｖａｒｄａｒ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，２ ０ ０ ２；ＢａｈｒｋｅおよびＹｅｓａｌｉｓ，２ ０ ０ ４）。

がんは現在、主要な公衆衛生上の課題として認識されています。 癌は、米国および世界中の第二の主要な死因です。 世界保健機関（WHO）によると、がんの罹患率は年間600万人を超えています。 癌細胞は高い増殖率を有する。 それらは生きているシステムで急速に広がり、強いchemotherapeuticsおよびDNAの損傷の代理店に対して存続できます。 同様に、細胞傷害性薬物は、正常細胞に多くの悪影響を及ぼし、したがって、癌化学療法におけるそれらの使用は治療上の課題である。 このため、様々な癌に対して安全で効果的で選択的な化学療法剤の開発が緊急に必要とされている（Ｍｕｎｏｚ−Ｐｉｎｅｄｏ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，２ ０ １ ２；Ｓｕら，２ ０ １ ２；Ｓｕら， ら、２ ０ １ ５；Ｓｗａｄｏｇｏ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ５；Ｒｅｂｅｃｃａ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2016).乳がんは、世界140カ国で最も一般的ながんの一つです。

乳がんは、世界の140カ国で最も一般的ながんの一つです。

これは、世界中の女性における癌関連死の主要な原因であり、高い増殖率を有する乳房小葉または管における細胞の異常な成長を特徴とする（Ｈａｎａｈａｎ ａｎｄ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，２ ０ ０ ０；Ｆｅｒｌａｙ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2015).

子宮頸がんは、乳がんに次いで、世界中の女性で二番目に優勢ながんです。 子宮頸がんの主な原因は、子宮頸部の組織における悪性細胞の形成である（Wang et al. ら，２ ０ １ ３；Ｈａｆｉｚａ ａｎｄ Ｌａｔｉｆａｈ，２ ０ １ ４；Ｐａｒｉｅｎｔｅ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2016). ヒト子宮頸癌細胞から得られたＨｅｌａ癌細胞株は、試験化合物の細胞傷害性の可能性を評価するための一般的な細胞モデルである。

前立腺癌は、気管支癌に次いで世界的に男性の第二の主要な癌であり、癌死の第三の最も一般的な原因です。 それは男性の悪性腫瘍の最も一般的な理由です。 その発生率は年齢とともに増加し、50歳以上でより一般的である（Henry and Omahony,1999;De-Bono et al. ら、２ ０ １ ０；Ｗｅｎｂｉｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2015). 男性前立腺癌細胞から得られたPC-3癌細胞株は、試験化合物の毒性を調査するために広く使用されているモデルである。

肺がんは、1950年代半ばから米国の男性と1980年代後半から女性の間で非常に流行しているがんであり、がん関連死の主要な原因です。 肺癌は、主に喫煙に起因する（Ｔａｖｉｓ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ２；Ｖｉｌｌａｎｔｉ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ３；Ｍｉｓｈｒａ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2016). ヒト肺癌細胞（ヒト大細胞肺癌のリンパ性転移サブライン）から得られたＨ４ ６ ０癌細胞株は、試験化合物の細胞毒性を評価するためにしばしば使用される。乳がん、肺がん、前立腺がんの後、結腸がんは世界中で4番目に多いがんです。 それは男性および女性のおよそ等しい頻度で見つけられる癌です。 これは、西洋諸国における癌関連死亡の二番目に一般的な原因である（Levin et al. ら、２ ０ ０ ８；Ａｎｄｒｅ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，２ ０ ０ ９；Ａｈｅａｒｎら，２ ０ ０ ９；Ａｈｅａｒｎら，, 2012). ヒト結腸癌細胞から得られたＨＣＴ１ １ ６癌細胞株は、試験化合物の細胞毒性を評価するために一般的に使用される。

生物活性ステロイドの真菌形質転換に関する我々の研究の継続で（Choudhary et al. ら，２ ０ ０ ５ｂ，ｃ，２ ０ ０ ７，２ ０ １ ０；Ａｈｍａｄ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ４；Ｓｉｄｄｉｑｕｉ ｅ ｔ ａ ｌ． 2017)では、ドロスタノロンエナント酸(1)の類似体をCephalosporium aphidicolaおよびFusarium liniとの変換によって合成した。 代謝産物2-9だけでなく、基質1は、HeLa（子宮頸癌）、PC-3（前立腺癌）、H460（肺癌）、HCT116（結腸癌）、および3T3（マウス線維芽細胞正常）細胞株に対して評価され、ハイスループットセルベースのアッセイ、最も効率的で便利な実験室法、MTTアッセイを用いて、癌細胞に対する特異性を示した悪性腫瘍における試験化合物の応答を予測した。 この調査は従ってそれ以上の調査のためのdrostanolone enanthate（1）の反癌性の代謝物質を識別しました。

材料および方法

器械分析

薄層クロマトグラフィー（TLC）（シリカゲル、20×20、厚さ0.25mm、PF254、メルク、ドイツ）は、形質転換および純度の シリカゲルカラムクロマトグラフィー（70-230mesh、E.Merck、Germany）を代謝産物の初期精製に使用した。 さらに、代謝産物の最終精製には、ＹＭＣ Ｌ−８ ０（４〜５μ ｍ、２ ０〜５ ０ｍｍ内径）を装備した分取逆相リサイクル（ＪＡＩ ＬＣ−９ ０ ８Ｗ、Ｊａｐａｎ）を使用した。 代謝産物の構造は、1H-（400、500、および600MHz）、および13C-NMR（100、125、および150MHz）スペクトルの助けを借りて解明され、Cd3OD、CD3COCD3またはDMSO-d6のBruker Avance-NMR分光計（フランス）に記録された。 HREI-MSおよびIRスペクトルは、それぞれJEOL JMS-600H（日本）（二重焦点磁気セクター質量分析装置）質量分析計（EI、電子衝撃イオン化）、およびBrukerベクトル22FT-IR分光光度計 代謝産物の光学回転はJASCO P-2000偏光計（日本）に記録された。 Evolution300UV可視分光光度計は、UVスペクトルを記録するために使用されました。 形質転換生成物の融点は、Ｂｕｃｈｉ Ｍ−５ ６ ０（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）機器を使用して測定した。 単結晶Ｘ線回折データを、光子１ ０ ０検出器（ＣＭＯＳ技術）およびＸ線源を有する微細焦点封止管（Ｃｕ Ｋ ａ放射α＝１． 反射強度は、ＳＡＮＴソフトウェアを使用して統合した。 吸収補正はマルチスキャンで行われ、構造はSHELXTLプログラムによって解決された（Gerlier and Thomasset、1986; Sheldrick,2008;Spek,2009)。

微生物培養

C.aphidicola ATCC28300およびF.lini NRRL2204の微生物培養は、それぞれAmerican Type Culture Collection（ATCC）およびNorthern Regional Research Laboratories（NRRL）から得られた。 C.aphidicola ATCC-28300の成長のための培地の四リットルは、200gのグルコース、4gのKH2PO4、8gのグリシン、4gのKCl、8gのMgso4.7H2O、および8mLの微量元素を4Lの蒸留水に混合することによって調製した。 同様に、4リットルの培地を、40gのグルコース、20gの酵母抽出物、20gのペプトン、20gのKH2PO4、20gのNaCl、および40mLのグリセロールを4Lの蒸留水に混合することによって、F.lini NRRL2204のために調製した。

ドロスタノロンエナント酸（1）をC.aphidicola ATCC28300、およびF.lini NRRL2204

C.aphidicolaおよびF.liniの成長のための培地で発酵させ、各真菌の蒸留水4Lに上記の成分を混合し、40Erlenmeyerフラスコ250mL（各フラスコ100mL）に均等に分配した。 すべてのこれらのフラスコを121℃でオートクレーブし、滅菌条件下でC.aphidicola ATCC28300およびF.lini NRRL2204のSDA傾斜を接種した。 フラスコを含むこれらの真菌培養物を回転シェーカー（121rpm）上に26±2℃で3-4日間放置して、C.aphidicolaおよびF.liniの最大増殖を得た。 化合物1(1g)を各真菌のアセトン20mLに溶解し、各フラスコに0.5mL分注し、再び回転シェーカー上に12日間置いた。 陰性対照（培地＋真菌培養物）、ならびに陽性対照（培地＋基質）も同様に調製して、真菌代謝産物および化合物１の分解をそれぞれ評価した。 12日間のインキュベーション後、すべてのフラスコを濾過し、20Lのジクロロメタン（DCM）で抽出し、有機相を分離し、ロータリーエバポレータ上で減圧下で蒸発させた。 これにより、1.5gの淡黄色の固体粗製物が得られた。 この粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで勾配ヘキサンおよびアセトン溶媒系で溶出して分画した。 カラムクロマトグラフィーは、その後、リサイクルHPLCによって精製された四つの主要な画分（1-4）を得た。 代謝産物2（tR=16分、8mg、0.8％）、3（tR=19分、11mg、1.1％）、4（tR=17分、35mg、3.5％）、5（tR=23分、42mg、4.2％）、6（tR=20分、9mg、0.9％）、7（tR=21分、12mg、1.2％）、および9（tR=18分、5mg、0.5％）を精製した。溶媒系としてメタノール-水を用いた逆相リサイクルhplc（meoh：h2o;70：30）を介して、それぞれ画分1-7から。 一方、代謝産物８は、通常相リサイクルＨ ＰＬＣによって画分８から得られた（Ｔｒ＝３ ２分、Ｃｈｃｌ３：Ｍｅｏｈ；９ ５：５、７）。5mg、0.75％）。

2α-メチル-3α,14α,17β-トリヒドロキシ-5α-アンドロスタン(2)

表1. 化合物１−３（δ ｐｐｍ）の１ ３Ｃ−および１Ｈ−ＮＭＲ化学シフトデータ（ＪおよびＷ１／２（Ｈ Ｚ））。2α-メチル-7α-ヒドロキシ-5α-アンドロスタン-3,17-ジオン(3)

2α-メチル-3α,17β-ジヒドロキシ-5α-アンドロスタン(4)

化合物４〜６（δ ｐｐｍ）の１ ３Ｃ−および１Ｈ−ＮＭＲ化学シフトデータ（ＪおよびＷ１／２（Ｈ Ｚ））。1,4-ジエン-3,17-ジオン(5)

2-メチルアンドロスタ-11α-ヒドロキシ-1,4-ジエン-3,17-ジオン(6)

2-メチルアンドロスタ-14α-ヒドロキシ-1,4-ジエン-3,17-ジオン(5)

2-メチルアンドロスタ-14α-ヒドロキシ-1,4-ジエン-3,17-ジオン(6)

2-メチルアンドロスタ-14α-ヒドロキシ-1,4-ジエン-3,17-ジオン(6)

2-メチルアンドロスタ-14α-ヒドロキシ-1,4-ジエン-3,17-ジオン(6)

2-メチルアンドロスタ-14α-ヒドロキシ-1,4-ジエン-3,17-テーブル3

テーブル3。 化合物７〜９（δ ｐｐｍ）の１ ３Ｃ−および１Ｈ−ＮＭＲ化学シフトデータ（ＪおよびＷ１／２（Ｈ Ｚ））。

2-Methylandrosta-7α-hydroxy-1-ene-3,17-dione (8)

2α -Methyl-5α-androstane-17β-hydroxy-3-one (9)

Experimental Protocol for Cytotoxicity

The cytotoxicity of samples was measured against HeLa (human cervical carcinoma ATCC CCl-2), PC-3 (human prostate cancer ATCC CRL-1435), NCl-H460 (human lung carcinoma ATCC HTB-177), HCT116 (human colon cancer ATCC CCl-247), and 3T3 (control fibroblast normal ATCC CRL-1658) cell lines by using standard MTT assay. 細胞株を、１ ０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ Ｆ１ ２培地中で、インキュベーター中で３ ７℃の５％ＣＯ２雰囲気下で増殖させた。

比色アッセイMTTは、細胞代謝活性の評価のために使用されました。 このアッセイでは、生きている細胞のミトコンドリアにおいて、黄色のＭＴＴは紫色のホルマゾンに還元される（ＧｅｒｌｉｅｒおよびＴｈｏｍａｓｓｅｔ、１ ９ ８ ６）。 生細胞が多ければ多いほど、より多くの色、したがってより多くの吸光度が測色計によって観察される（Fesahat et al., 2015). この方法を用いて、癌細胞に対する細胞傷害性に対する形質転換産物の効果を分析した。 各細胞株の約10,000細胞（HeLa、PC3、H460、HCT116癌、および3T3正常）を96ウェルプレートに播種した。 ８ ０〜９ ０％のコンフルエンスに達した後、それらを種々の濃度の化合物（２ ５、５ ０、７ ５、１ ０ ０、および２ ０ ０μ Ｍ）で２ ４時間処理した。 溶液を濾過し、連続希釈を成長培地中で行った。 600μ lの各希釈液を使用して、3つのウェル（それぞれの3倍）の96ウェル板、すなわちそれぞれ200μ lを処理した。 各実験は、３つの生物学的複製物で実施した。 MTTを除去した後、紫色のホルマゾン結晶をDMSOに溶解し、正常細胞および癌細胞についてそれぞれ540および570nmで読み取りが観察された。 Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ読者は、ＤＭＳＯ処理された３Ｔ３線維芽細胞において５ ４ ０ｎｍでβ ｍａｘを与える（形態的にはより合流性である）が、癌細胞の場合、５ ７ ０ｎｍでβ ｍａｘを与える（Ｂｏｎｍａｔｉ−Ｃａｒｒｉｏｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ３；Ｄａｎｉｈｅｌｏｖａ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2013). シスプラチンが選択の一般的な薬剤であったこの実験では、上皮癌細胞株の広い範囲が使用された。 それはDNAを標的とし、有糸分裂の間に細胞分裂を妨害し、アポトーシスを誘導する（Eastman、1999）。 ＩＣ５ ０値を計算して、細胞の５ ０％を死滅させるのに必要な最小濃度を決定した。

一方、

At=試験化合物の吸光度値

Ab=ブランクの吸光度値

Ac=コントロールの吸光度値

結果と議論

構造説明

構造活性の関係

代謝産物の構造の変化は、それらの抗癌活性に影響を与えた。 代謝産物2エステル部分の不在、およびc-3、およびC-14で二つのaO-Hグループ、およびc-17でa β o-Hグループは、HeLa、H460、およびHCT116癌細胞株に対して低い細胞毒性を示したが、その抗癌活性は、化合物1と比較して、PC-3癌細胞株に対して高かった。 代謝産物3エステル基と二つのケト基の損失とC-3、およびC-17、およびc-7でaO-Hグループはまた、HeLa、H460、およびHCT116癌細胞株に対して低い活性を示したが、pc-3癌細胞株に対して基質1と比較して活性が増加した。 C-3カルボニルのO-Hへの還元および化合物4におけるエステル部分の加水分解開裂は、HeLaおよびPC-3癌細胞株に対する活性をある程度増加させたが、h460およびHCT116癌細胞株に対する抗癌活性は基質1と比較して減少した。 C-1/C-2とC-4/C-5の間のC=Cの存在は、c-3でC=Oと一緒に、C-17代謝産物5基質1と標準薬（シスプラチン）と比較して、HeLa癌細胞株に対して強力な抗癌剤を作 さらに、PC-3癌細胞株に対するその抗癌活性も基質1と比較して増加した。 興味深いことに、H460およびHCT116癌細胞株に対するその抗癌活性は、化合物1と比較して低かった。 C=Cの存在C-1/C-2とC-4/C-5、c=O C-3、およびc-17、c-11代謝産物6のaO-Hグループと一緒にHeLaに対する抗癌活性を増加させ、pc-3癌細胞株基質1と比較して、標準薬（シスプラチン）としてHeLa癌細胞株に対して同様の抗癌可能性を示した。 しかし、H460、およびHCT116癌細胞株に対するその抗癌活性は、化合物1と比較して減少した。 C=Cの存在C-1/C-2とC-4/C-5、c=O C-3、およびc-17、c-14代謝産物7のaO-Hグループと一緒に再びHeLa、およびPC-3癌細胞株に対する抗癌活性を増加させ、h460、およびHCT116細胞株に対する抗癌活性を基質1と比較して減少させた。 C=C c-1/C-2、C=O C-3、およびC-17、およびc-7でaOH代謝産物8基質1および標準的な薬剤（シスプラチン）と比較してHeLa癌細胞株に対して最も強力な抗癌 また、PC-3癌細胞株に対して良好な活性を示したが、基質1と比較してH460およびHCT116癌細胞株に対する抗癌活性を低下させた。 代謝産物9c-17で唯一の加水分解とHeLa、PC-3、およびHCT116癌細胞株に対する増加した抗癌活性を示したが、h460癌細胞株に対する細胞毒性を減少させた基質1と標準的な薬物（シスプラチン）と比較して。 上記の議論に基づいて、化合物5-8HeLa、およびPC-3癌細胞株に対する抗癌活性の増加は、おそらくc-1/C-2におけるC=C、およびc-3、およびC-17におけるカルボニルケトンの存在によるものであると結論付けることができる1基質と比較して。

結論

著者の貢献

提示された研究の概念は、MICによって開発され、設計されました。 MICはプロジェクトのスーパーバイザーでもありました。 すべてのデータを分析し、MIC、A-t-W、およびHCによって解釈した。 ＭＳ、ＳＹ、Ｍ Ａ、およびＮＦが実験を行った。 MIC、a-t-W、MSが原稿を書いた。 すべての著者が原稿を改訂しました。 原稿の最終版は、提出前に総務省によって承認されました。

利益相反に関する声明

著者らは、この研究は、利益相反の可能性と解釈される可能性のある商業的または財政的関係がない場合に行われたと宣言している。

謝辞

A-t-W、およびMICは、”食餌療法剤による乳腺発癌の化学予防に関する研究（20-3790/NRPU/R&D/HEC/13/793）の下での財政支援を通じて、パキスタンのイスラマバード高等教育委員会の有効な役割を認めている。”SYは、OPCW（化学兵器の禁止のための組織）と題された研究プロジェクトを通じて、”生体内変換によって得られた新しい同化ステロイドの構造的および生物学的研究”の財政的支援を認めている。”HCは、科学研究のDeanship（DSR）、キングアブドゥルアズィーズ大学、教育省、サウジアラビアの財政支援を認めています。”

補足資料

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