Discussion
この研究で提案されているimage cytometry法は、神経変性に関連するミスフォールドタンパク質のクリアランスを促進したり、癌に関連する薬剤耐性を阻害したりするなど、オートファジー活性を誘導または阻害する可能性のある薬物をスクリーニングするために、生きた細胞におけるオートファジーを迅速かつ効率的に分析する能力を実証している。 現在の方法の限界はオートファジー検出のための新しい方法を開発するためにイメージのcytometryおよび独特な試薬によって克服することができます。 細胞計ビジョンは、以前に蛍光細胞ベースのアッセイのために使用されている（Ｃｈａｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，２ ０ １ １，２ ０ １ ２ｂ；Ｒｏｂｅｙら，２ ０ １ ３，２ ０ １ ４，２ ０ １ ５． Ｃｙｔｏ−ＩＤオートファジー色素は、生細胞中のオートファゴソームを特異的に染色することが示されている。 この研究では、Ｃｙｔｏ−ＩＤ色素は、飢えたＨｅｌａ細胞においてＲＦＰ−ＬＣ３と共局在することが示され、これは色素の特異性をさらに検証する。 開発した画像ベースのオートファジー検出法は、栄養不足のJurkat細胞におけるオートファジー活性の結果を比較することにより、標準的なフローサイトメトリーに対 その結果，栄養欠乏細胞では蛍光強度が増加し，回収されたＪｕｒｋａｔ細胞では減少した。 しかし，画像サイトメトリーの測定されたＡＡＦ値はフローサイトメトリーよりもかなり高く，これは計装と方法の違いによるものである可能性がある。 Cellometerの視野のイメージのcytometerは蛍光性の測定のためにFACSのCaliburの流れのcytometerは光乗数の管(PMT)を使用するが、充満つながれた装置を使用する。 さらに，蛍光強度を解析する方法も両システム間で異なっていた。 フローサイトメーターは、各細胞からの総蛍光信号を測定し、画像ベースのシステムは、画像を取得し、オートファジー活性のより正確な測定を提供することができ、細胞内の蛍光染色オートファゴソームを分析しながら、。 Cellometerソフトウェアは各細胞の総蛍光ピクセルを合計するか、または各細胞内のautophagosomesからの高い蛍光強度ピクセルだけを測定することによって細胞の蛍光 別の違いは、標的細胞の生存率に影響するフローサイトメトリーの剪断応力によって引き起こされ得る（Robey et al., 2011).
オートファジー流束は、新しい検出方法を開発するための重要なアッセイでもあります。 CQは、オートファゴソームのリソソーム分解を阻害するために使用され、オートファゴソーム活性は、治療間の相乗的相互作用のためにCQの存在下で栄養飢餓Jurkat細胞 次に高いのは、CQのない飢餓状態のJurkat細胞であろう。 基底オートファゴリソソームの蓄積による対照と比較して、ＣＱを有するＪｕｒｋａｔ細胞によっては、オートファゴリソソームのわずかな増加のみが示されるであろう。 両装置から得られたオートファジー流束の結果は同様の傾向を示したが，画像サイトメトリーで測定されたＡＡＦ値は有意に高かった。 これらの結果は，ＡＡＦ値の潜在的な機器特異的定量的差にもかかわらず，画像細胞測定検出法が容易にオートファジー活性を調べるために実装できることを示した。
画像サイトメトリーが創薬スクリーニング技術の可能性を実証するためには、複数の条件でサンプルを分析する能力をテストする必要があります。 イメージのcytometryが時間経過の調査上の線量応答の効果を測定するイメージのcytometryのための機能を示すためにさまざまな集中でrapamycinと扱われるJurkatの細胞の自食作用 その結果、画像ベースのサイトメトリーは、様々な実験条件にわたってオートファジー活性の違いを検出することができます。 である。 図8.6に示すように、自食作用活性（AAF値によって測定される）は、インキュベーションの18時間後に最も高い。 AAF値のわずかな減少は、最初の薬物治療後に細胞が完全に回復することを可能にしないことに起因し得るインキュベーションの8と4時間の間に示 また、ヒト前立腺癌細胞株（ＰＣ−３）などの付着細胞も、画像細胞測定法を用いて測定することができる。 セルロメータビジョンイメージング分解能は、蛍光画像と蛍光強度ヒストグラムの両方で観察される蛍光標識オートファゴソーム（puncta）を分析することができます。
創薬キャンペーンのためのオートファジー用量応答効果を比較することにより、異なる薬物化合物を特徴付ける能力を実証することも重要です。 タモキシフェンとラパマイシンの用量応答効果を画像サイトメトリーを用いて直接比較した。 18hインキュベーションでの結果は、ラパマイシンはタモキシフェンよりもオートファジー活性の高いレベルを誘導することを示した。 100μ mのタモキシフェンは非常に細胞傷害性であり、18時間のインキュベーション後にJurkat細胞死および崩壊につながることに注意することが重要である。 高濃度のタモキシフェンにおける細胞毒性効果の画像ベースの検証は、散布図とヒストグラムの結果のみから不確実性を排除するのに非常に有用で
画像サイトメトリーは、蛍光細胞ベースの分析のための標準的なフローサイトメトリーと同等の結果を実証している（Chan et al. ら，２ ０ １ １；Ｒｏｂｅｙら，２ ０ １ １；Ｒｏｂｅｙら，, 2011). イメージベースのcytometry方法は流れのcytometry上の複数の利点を提供できます。 例えば、各サンプル（10-20μ l）に必要な細胞の数は、従来のフローサイトメーター（300-500μ l）よりも有意に少ない。 流れcytometerの最初の組み立てはターゲット細胞のサンプルのいくつかがPMTの電圧および補償の調節に使用されるように要求する。 一方では、多くのイメージのcytometersは多数の時を再スキャンすることができるカウントの部屋に細胞をピペットで移す。 したがって、標的細胞試料は、露光時間調整および集束の初期最適化の間に無駄にされない。 さらに重要なのは、BRと蛍光画像をキャプチャすることの利点は、研究者が取得した蛍光データを視覚的に検証することを可能にすることである。 これはautophagyを引き起こす薬剤の処置の試金の複雑な副作用として細胞毒性の識別を援助できます。
自己蛍光は、プラスチック製の計数チャンバのためにCyto-ID Green autophagy色素を使用して発生する可能性がありますが、ソフトウェアは自動的にAAF計算を変 さらに、細胞ベースの試金の蛍光調査のphotobleachingはCellometerの視野が他の器械で使用される高い発電のレーザーと比較して低い電力LEDsを使用するので最小になる。 セルロメータイメージサイトメーターの今後の改善は、より多くの細胞を分析して統計分析を改善することができるより高いスループットの自動化システムを開発することであり、複数のサンプルを同時に分析することができ、オートファジー、アポトーシス、壊死などの生理学的現象の阻害剤および活性化剤のより高いスループットの細胞ベースの薬物スクリーニングを容易にすることである。