シングルドメイン抗体で操作された4.3BBB交差bsAbs
sdAbsは、bsabsの”ビルディングブロック”として他の抗体断片よりも様々な利点を提供する抗体の小さな（15kDa）、単量体抗原結合断片である。 それらは、天然において、ラクダ種（Ｖ Ｈ Ｈと呼ばれる）および軟骨魚（ＶＮＡＲと呼ばれる）中の重鎖抗体の抗原結合部分として生じるか、単量体、安定なＶ ｈまたはＶＬドメ, 1993; Hussackら。 ら、２ ０ １ ２；Ｋｉｍ ｅ ｔ ａ ｌ． 2014;Nuttall,2012;Ward,Güssow,Griffiths,Jones,&Winter,1989)。 ＳＤＡｂは非常に安定でコンパクトであり、通常のＩｇｇからしばしば「隠されている」酵素の活性部位のような、タンパク質中の凹んだエピトープにアクセスすることができ、従来の抗体のものと同等の標的結合親和性を達成することができる(Lauwereys et al. ら、１ ９ ９ ８；Ｓｔａｕｓ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2014). これらの単量体抗原結合単位は、軽鎖と対にならず、それらは、不適切な軽鎖対形成の困難を回避するので、ヘテロ二量化されたＢＳＡｂのための優れた構 1993;Saerens,Ghassabeh,&Muyldermans,2008)。 ヘテロ二量体ＢＳＡｂは、一方または両方の「腕」がＳＤＡｂであり、後者がラクダの重鎖抗体と構造が類似している状態で作製することができる（図１ ０Ａ）。 3E）。 ＳＤＡｂはまた、従来の治療用抗体またはＦａｂとの種々の一価、二価、または四価の融合物においても使用することができる（図１）。 成されたものと比較して、より小さく、より複雑ではない分子をもたらす（Holliger&Hudson,2005）。 Ｖ Ｈ Ｈのヒト化ならびにＳＤＡｂの工学は、十分に説明されており、最適な標的親和性および例外的な生物物理学的特性を有するヒト（ｉｚｅｄ）ＳＤＡｂを容易に生成するこ, 2009).＜／ｐ＞＜ｐ＞二重特異性ＣＮＳ標的抗体内でのｂｂｂ担体としてのラクダのＶ Ｈ Ｈ ＦＣ５の潜在的な使用を評価するために、ＦＣ５とヒトＦｃとの一価および二価の融合（, 2014). 一価Fc5Fc結合はマイクロモル範囲であったのに対し、二価Fc5Fc融合のラットBECに対する見かけの結合親和性（Kdapp）は75nMであった。 HARGREAVES painモデルで化学的に共役BBB不透過性神経活性ペプチドによって誘発される薬理学的応答は、FC5によって媒介されるこれらの大きな（75kDa）抗体分子の強化されたBBB輸送の証拠を提供した：（1）in vitro Papp値は-200cm/分モノと二価のN末端Fc融合分子（Fc5Fc）の両方に対して4-8と比較していた。制御vhh A20のためのcm/min。1fcまたはEg2Fc融合;(2)Fc5Fc融合の見かけのCNS暴露は、コントロールドメイン抗体-Fc融合に比べて30倍高かった;(3)Hargreaves炎症性疼痛モデルにおけるニューロペプチドダラルギンまたはガラニンとFc5Fcコンジュゲートの全身薬理学的効力は、単量体FC5–ニューロペプチドコンジュゲートに比べて60倍まで高かった。 この結果は、FC5-ニューロペプチド複合体と比較してFc5Fcの長い循環半減期（–96h）に起因していた;（4）様々なコントロールVHH-Fcニューロペプチド複合体は、全身; （５）ＦｃのＣ末端へのＦＣ５の融合は、ＢＢＢ交差能力の減衰をもたらした。 Ｔｆｒ標的化ＢＢＢ担体抗体とは対照的に、単結合および二価のＦｃ５Ｆｃ融合タンパク質の両方は、見かけの結合親和性および価数の違いにもかかわらず、ｉｎ ｖｉｔｒｏで, 2014). これらの研究は、ＢＢＢ交差単一ドメイン抗体ＦＣ５が、ヘテロ二量化された「半抗体」の両方におけるプラットフォームＢＢＢ担体として、および従来のＩｇｇへのより容易, 2014).BBBキャリアとしてのVHHsのもう1つの潜在的な利点は、温度やpHなどの極端な生物物理学的課題やプロテアーゼ分解に対する自然な耐性である（Kim et al.,2014),多くの場合、transcytosis中に様々なendocyticコンパートメントで発生しました. FC5とFc5Fc融合の両方がクラスリン被覆された小胞を介してBECに内在化され、初期のエンドソームにソートされています。 興味深いことに、ＦＣ５はまた、ＢＥＣからの細胞外微小胞（エキソソーム）の脱落を刺激することが見出された（Ｈａｑｑａｎｉ，Ｃａｒａｍ−Ｓａｌａｓ，ｅｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ３；Ｈａｑｑａｎｉ，Ｄｅｌａｎｅｙ，ｅｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ３）において、ＦＣ５およびその推定受容体Ｃｄｃ５ ０Ａの増加したレベルの両方が、ウェスタンブロットおよび標的質量分析によって検出された。 この研究は、放出されたエキソソームが、受容体−抗体複合体を担持する無管表面から放出されたＲＭＴ経路の最終小胞であり得ることを示唆した（図１に模式的に示されている）。 4). RMT経路とエキソソーム形成は、いくつかの注目すべき類似点を共有しています。 エキソソームの最初の発見で概説されているように、抗TfR抗体は、細胞の表面から網状赤血球（Théry、2011）において、細胞の表面から、初期のエンドソームの内部、多胞エンドソームの内部小胞の表面上のクラスリン被覆ピットに、そして最終的に多胞エンドソームと原形質膜との融合後に放出されたエキソソーム上に電子顕微鏡によって追跡された（Fig. 4). ＲＭＴは、同様の様式で展開するようであり、ＢＥＣ細胞外微小胞は、Ｔｆｒ、Ｌｒｐｓ、ＬＤＬＲ、およびＩＲを含む、ＲＭＴを介してＢＢＢを横断して高分子を運ぶことが知られているいくつかの, 2013).
記載された研究から、CNS標的化bsAbのBBBキャリアアームは、各RMT受容体に対して慎重な最適化を必要とすることは明らかであるはずである。 ＣＮＳ標的化ＢＳＡｂを設計する上での重要な考慮事項は、Ｔｆｒ−ＢＡＣＥ１ＢＳＡｂ開発からの「教訓」およびＢＢＢ担体抗体としてのＦＣ５を用いた我々自身の研究からの「教訓」を考慮し