9スプライセオソーム触媒コアにおけるタンパク質の役割
snrnaのサイズをはるかに大きなグループIIイントロンと比較すると、いくつかのグループIIイントロンドメインが進化中にスプライセオソーム内のタンパク質に置き換えられ、現代のリボヌクレオタンパク質(RNP)真核生物スプライシングマシンが生まれた可能性がある。 一対一の対応はまだ存在しないが、グループIIイントロン内のRNA要素によって媒介される機能を果たすスプライセソームタンパク質を容易に同定することが可能である。 例えば、多数のＵ２関連タンパク質は、Ｕ２ｓｎＲＮＡ−分岐部位相互作用を開始および安定化させる際に機能する（図１ ０Ａ）。 6.3).5,85グループIIイントロンでは、U2当量（ドメインVIの一部）は、それらの相互作用の形成および安定性を保証する配置で超安定ヘアピンループを介して 6.2). この進化的観点からは、スプライソソームタンパク質の大部分がsnRNAと直接関連し、しばしばその機能を支援することは驚くべきことではない。5,85しかし、多くのスプライセソームタンパク質は、自己スプライシングイントロンの文脈で必要とされない調節機能を実行することに関与しており、スプライセソームタンパク質補体へのより最近の追加である可能性が高い。
上記のように、真核生物の最後の共通の祖先は、現代の真核生物に見られるものに似た高度に進化した完全に機能するスプライソソームを持っていたと考えられている。1,2このスプライスオソームは、おそらく現代のスプライスオソームの最小に比べて大幅に少ないコンポーネントを含んでいましたが、データは、主要なコンポーネ1-4確かに、触媒コアに関連するタンパク質を含むスプライセソームプロテオームのサブセットは、最も保存された細胞タンパク質の中であるスプライセソームタンパク質の数で、異なる真核生物種の間で保全の有意なレベルを示しています。85,86
上記のように、多くのよく特徴付けられたリボザイムは、いくつかの既知のメカニズムによってそれらの触媒活性を改善するin vivoタンパク質これらには、Ｒｎａの機能的構造の安定化、基質の結合および位置決めの支援、および機能的に重要な金属イオンの結合の支援が含まれる。 しかし、触媒作用への直接の関与は、これまでのところ研究されたリボザイム関連タンパク質のいずれかについて観察されていない。83,87スプライセオソームがRNA酵素であると仮定すると、スプライセオソームsnrnaは多くの点で珍しいリボザイムである。 おそらく最も重要なのは、それらは非隣接求核剤の活性化を介してホスホジエステル結合切断を触媒するリボザイムにとって異常に小さいことである。 このような反応を触媒する他の天然リボザイム、すなわちグループIおよびIIイントロンおよびRNase Pは、ヒトU6およびU2snrnaの組み合わせた長さよりも少 これらのリボザイムは、ホスホジエステル結合開裂のために隣接する2′-ヒドロキシル求核剤を活性化する核分解リボザイムよりもはるかに大きい。24,88,89大きいサイズは、これらのリボザイムは、順番に正確に切断部位、活性部位の金属イオン、およびインライン求核攻撃のためのリモート求核剤を配置することができる洗練された活性部位を作成することを可能にする、複数の三次相互作用によって安定化された複雑な構造に折り畳むことを可能にすると考えられている。 U6とU2snrnaは、その短い長さのために、最高の状態で活性部位要素と反応基の安定した位置決めのための他のスプライソソーム因子を必要とする非効率
Prp8は、最も保存されているスプライセソームタンパク質であり、スプライセソーム活性部位においてこのような役割を果たすと考えられている。 それは異常に酵母とヒトの間で61％の同一性で保存されているようprp8は、間違いなくスプライセソームタンパク質の中で最も興味深いです。86しかし、それはその-2300アミノ酸長でいくつかの明確に区別可能な機能モチーフを持っており、これまでに識別されている機能ドメインは縮退しており、86一方、Prp8は明らかにスプライソソーム活性部位に非常に重要な役割を果たしています。 これは、それがスプライスソーム触媒コアに存在し、直接スプライシング反応における重要なプレーヤーに接触することを示すU5とU6snrnaに加えて、5’と3’スプライスサイトとプレメッセンジャー Rnaの分岐サイトに架橋されています。さらに、Ｐｒｐ８は、Ｓｎｕ１ １ ４およびＢｒｒ２（下記参照）を含むいくつかの主要なスプライソームタンパク質と相互作用することが示されている。86,91,92
Prp8の変異は、最適でないスプライス部位を拒絶するスプライスソームの能力の変化や、Prp28、Brr2、U4、U6snrnaなどの他のスプライスソーム因子86,93,94Prp8変異体のサブセットは、選択的に特に最適以下の基板で、スプライシングの第一または第二のステップのいずれかの効率を調節します。58,86,95-97これらの観察は、Prp8がスプライシングの第一または第二段階の触媒作用の態勢を整えている代替、相互に排他的な活性部位コンフォメーションの安定化に関与していること、および特定のPrp8変異体は、これらの状態のいずれかの選択的な高安定化につながる可能性があることを示す仮説によって最もよく説明されている。58,96,98Prp8が基板の位置決めと活性部位の安定化に関与している可能性が高いことを示唆している重要な証拠は、現在、金属イオン配位またはスプライセオソーム触媒への直接の関与における追加の関与を示唆または反論する直接的な証拠は存在しない。
この不確実性は、Prp8がその機能を実行する方法についてほとんど知られていないという事実に由来しています。 革新的なトランスポゾンを介したスクリーニングアッセイは、Prp8の大きな領域は、トランスポゾンの挿入に非常に敏感であり、可能性が高い単一の構造単位として機能することが示されたが、トランスポゾンを挿入したり、生存率を失うことなく、他の位置の数で二つの断片にPrp8を分割することが可能であった。90,92離れて、そのN末端に近い縮退核局在シグナルとタンパク質の中央に縮退RRM（RNA認識モチーフ）モチーフから、唯一の他の二つの機能ドメインは、この-2300アミノ酸長86
deubiquitinating酵素に関連付けられているMPN/Jab1ドメインの縮重変異体は、Prp8のc末端付近に発見されました.86このドメインを含むPrp8の断片の高解像構造の分析は、イソペプチダーゼ中心の金属イオン結合部位が損なわれていることを示しており、したがって、deubiquitinating酵素として機能しない可能性が高い。99,100in vitroでは、このドメインを含むPrp8の断片は、他の既知のユビキチン結合タンパク質に匹敵する親和性でユビキチンに直接結合することができ101スプライシングを破壊したいくつかの既知のPrp8変異はまた、このようにスプライシング調節におけるユビキチン化のための機能的役割の可能性を高め、in vitroのユビキチン結合を破壊しました。 重要なのは、プロテオーム解析は、Sad1、Snu114、Rse1、およびPrp8自体を含むいくつかのスプライセオソーム因子は、in vivoでユビキチン化され、さらにスプライセオソームコ101-105さらに、ユビキチンは、おそらくBrr2.102の機能のPrp8媒介調節を調節することにより、tri-snRNPの形成および維持に役割を果たしている代わりに、MPN/Jab1ドメ 遺伝性失明網膜色素変性症、86でこのドメインの結果に落ちるPrp8の変異の数とこれらの変異は、Brr2とSnu114とPrp8の相互作用を弱めました。99
Prp8の別の断片の高分解能構造は、そのC末端ドメインの近くに位置する高度に保存された領域（酵母とヒトの間の69％のアミノ酸同一性）を包含 構造の解析により，リボソーム蛋白質に類似したβ-ヘアピン指と縮退したＲｎａｓｅｈ様ドメインの存在が明らかになった。106-108二次および三次構造のレベルでRNase H様モチーフの全体的な幾何学はよく保存されたが、一次配列は保存のはるかに低いレベルを示し、三つの触媒残基 保存された残基であるアスパラギン酸は，カノニカルＲｎａｓｅｈドメインの活性部位における二つの触媒金属イオンの配位に関与している。 ある研究では、酵母におけるPrp8におけるこの残基の変異は、冗長性または重要な機能の欠如を示すことができる検出可能な成長欠陥をもたらさな108別の研究では、突然変異がタンパク質断片のミスフォールディングを誘発したため、その効果を調べることができなかった。107結晶が縮退活性部位が金属イオン結合能力を欠いていることを示す限り200ミリメートルMgcl2で成長したときにRNase Hドメインの活性部位に対応す さらに、このドメインを含むPrp8の断片は、試験されたRNA種に応じて20μ mから200μ m以上のKdで、非常に弱いRNA結合能力を示した。この断片は、結合Ｒｎａに対して非常に低い親和性を示したが、四方接合を含む結合二重鎖Ｒｎａに対して好ましいことを示した。活性化されたヒトスプライセオソームにおいて、Ｕ２およびＵ６ｓｎＲＮＡは、このような構造を形成すると予測される。53,69このRNase h様ドメインを特に興味深いものにしたのは、その活性部位に対応するアミノ酸がPrp8の残基に隣接して配置されていることであり、前触媒スプライスソームの5’スプライス部位に架橋することが以前に示されていた。109しかし、この架橋の形成の効率は、前触媒スプライセオソームが触媒活性スプライセオソーム複合体になるために進行するにつれて減少した。109観測された架橋効率の低下は、この相互作用が活性化されたスプライソソームで破壊されていることを示すと解釈することができる。 あるいは、相互作用は持続し得るが、架橋残基の環境のわずかな変化のために架橋自体の形成は廃止される。 この縮退したRNase H様ドメインが実際に触媒活性スプライスソームにおける5’スプライス部位に近接して配置されている場合、それはsnrnaの活性配座の安定化、活性部位における基質の位置決め、および/または触媒金属イオンの配位に関与している可能性がある。 ドメイン自体ではＲＮＡまたは金属イオンに結合することはできないが、他の活性部位要素の存在下では、それが基質または金属イオン結合ポケットの一部を形成し得る可能性がある。 これらの興味深い可能性にもかかわらず、スプライソソーム触媒におけるPrp8の役割は不確実なままです。