α-hemolysine van Escherichia coli maakt gebruik van endogene amplificatie via P2X-receptoractivering om hemolyse

resultaten

Hlya-geïnduceerde hemolyse te induceren, vereist activering van Purinerge receptoren.

Supernatant van de α-hemolysine (HlyA)–producerende E. coli-stam ARD6 lyses equine, human, and muriene erythrocyten (Fig. 1). Figuur 1 toont de HlyA-geïnduceerde hemolyse als functie van de tijd. Time-lapse experimenten met muriene en menselijke erytrocyten bevestigd aan coverslips bleek dat HlyA-geïnduceerde hemolyse is een sequentieel proces. Binnen de eerste 20 minuten induceerde HlyA crenatie van de rode bloedcellen als gevolg van celkrimp, gevolgd door een geleidelijke volumetoename en uiteindelijk lysis van de cellen (Fig. 1A en 1B, film S1). Deze sequentiële krimp en zwelling is ook van toepassing op het eencellige niveau. Het zijn dus niet verschillende populaties rode bloedcellen die krimpen of zwellen, maar eerder dat een enkele erytrocyt eerst krimpt en vervolgens opzwelt als gevolg van HlyA-toepassing. De erytrocytensuspensie (1,25%) werd geïncubeerd met verdund E. coli supernatant (50 µl · ml−1). Erytrocyten van de drie geteste soorten vertoonden een duidelijk verschil in respons op HlyA (Fig. 1C) met de laagste gevoeligheid voor HlyA in menselijke erytrocyten. In alle volgende experimenten werd de hoeveelheid toegevoegd E. coli supernatant aangepast om ≈50% hemolyse te produceren na 60 minuten incubatie.

we gebruiken over het algemeen gefilterd E. coli (ARD6) supernatant om hemolyse te induceren, tenzij anders vermeld. Deze aanpak werd gekozen om ervoor te zorgen dat onze resultaten ook van toepassing zouden zijn in vivo waar HlyA wordt vrijgegeven uit E. coli samen met diverse andere componenten. Bij het kiezen van deze aanpak moesten we echter controleren of de hemolyse die veroorzaakt wordt door HlyA-producerende E. coli in feite toegeschreven kon worden aan HlyA. Daarom hebben we HlyA gezuiverd uit onze ARD6-cultuur. Na zuivering werd een suspensie van de gezuiverde HlyA gescheiden op een 5-15% natriumdodecylsulfaat (SDS) gel. Een enkele 100-kDa band verscheen na coomassie R kleuring, en massaspectroscopie identificeerde de band als HlyA (Fig. S1 A en B). Als extra controle gebruikten we het supernatant van de E. coli stam D2103, een niet-pathologische laboratorium stam van E. coli die geen HlyA produceert. Het supernatant van deze bacteriën induceerde geen hemolyse in menselijke, muriene of equine erytrocyten (Fig. S1D). Verder hebben we onze bevindingen vergeleken met HlyA vriendelijk geleverd door Prof. Sucharit Bhakdi, Universiteit van Mainz, Duitsland (met de activiteit van 10 ng * ml – 1 voor ≈50% hemolyse, Fig. S2). In het volgende, wanneer gezuiverd HlyA wordt genoemd, is het met verwijzing naar dit preparaat. Tijdens onze eerste testen van de biologische activiteit van HlyA, ontdekten we dat de ATP-aaseter apyrase volledig hlya-geïnduceerde hemolyse van paardachtige erytrocyten remde. Deze bevinding was echt verrassend, aangezien het extracellulaire ATP noodzakelijk impliceerde voor de hemolyse toegebracht door HlyA-producerende E. coli. Aangezien extracellulaire ATP een signalerende molecule is die P2-receptoren activeert, konden onze bevindingen suggereren dat het heersende porie model voor HlyA-veroorzaakte hemolyse een vereenvoudiging zou kunnen zijn. Daarom hebben we het effect van ATP-opruiming grondiger getest. We vonden dat apyrase hemolyse van niet alleen paarden, maar ook muizen en menselijke erytrocyten volledig remde (Fig. 2 bis). Bovendien verminderde hexokinase, dat adenosinetrifosfaat (ATP) snel afbreekt tot adenosinedifosfaat (ADP), op vergelijkbare wijze de HlyA-geïnduceerde hemolyse in rode bloedcellen van muriene en menselijke oorsprong op een concentratieafhankelijke manier (Fig. 2B). Deze bevinding werd bevestigd door gezuiverde HlyA (Fig. 2B, inzet). Het is de moeite waard op te merken dat zowel apyrase als hexokinase in menselijke erytrocyten de HlyA-geïnduceerde hemolyse in lagere concentraties versterkten. Het onderscheid kan wijzen op een verschil in P2 receptor expressie patroon op de rode bloedcellen tussen de species.

om de relevantie van deze bevinding te bevestigen, was het belangrijk om te leren of P2-receptorantagonisten de HlyA-geïnduceerde hemolyse beïnvloedden. De niet-selectieve P2-receptorantagonist ppads-concentratieafhankelijke verlaagde hemolyse geïnduceerd door HlyA-producerende E. coli bij paarden, muizen en menselijke erytrocyten (Fig. 2C). De EC50-waarde voor ppads was respectievelijk 520 µM, 400 µM en 180 µM voor menselijke, muriene en equine erytrocyten. Deze bevinding werd onderbouwd voor het gehele bereik van HlyA-concentraties (Fig. 2D) getest in menselijke erytrocyten blootgesteld aan gezuiverde HlyA. De concentratie–respons relatie was compatibel met competitief antagonisme, en opgemerkt moet worden dat het effect van zelfs maximale toxineconcentraties werd verminderd door de P2-receptorblokker. Zo lijkt de activering van de P2-receptor betrokken te zijn bij HlyA-geïnduceerde hemolyse. De niet-selectieve P2-receptorantagonist suramine verminderde ook concentratieafhankelijk de hlya-geïnduceerde hemolyse bij alle drie de species (gegevens niet getoond). In hogere concentraties veroorzaakt suramine echter een dramatische krimp van de erytrocyten, en kan daarom niet geschikt zijn voor het evalueren van P2 receptorimplicatie in erytrocyten.

om te beoordelen of het effect van de purinerge antagonist op hemolyse slechts het resultaat was van verhoogde osmolaliteit, hebben we het effect van extracellulaire sucrose op de HlyA-geïnduceerde hemolyse getest (gegevens niet getoond). Sucrose (1 mM) verminderde de hemolyse slechts licht (5,1% ± 1,7%), terwijl sucrose bij 10 mM en 75 mM de hemolyse aanzienlijk verminderde (28.5% ± 5.0%, 82.8% ± 5.2%). Aangezien de concentraties van de antagonisten en Atpasen die in dit onderzoek worden gebruikt nooit meer dan 1 mM bedragen, kan het effect niet het gevolg zijn van een verhoogde osmolariteit. Onze resultaten wijzen ook niet op een niet-selectieve binding tussen de antagonisten en het GIF. Dit werd getest in erytrocyten bij paarden, die met HlyA werden voorgeïncubeerd gedurende 10-15 minuten bij 37 °C of gedurende 30 minuten bij 4 °C, grondig werden gewassen en opnieuw werden gesuspendeerd met of zonder de antagonisten. Omdat HlyA tijdens de pre-incubatie in het membraan is opgenomen, gingen de erytrocyten over tot lysis in afwezigheid van vrije HlyA. Fig. S2 toont aan dat verschillende farmacologische interventies hemolyse verminderden nadat HlyA aan de erytrocyten vooraf ging. De antagonisten waren echter minder efficiënt wanneer ze werden toegevoegd aan gewassen erytrocyten waarin het lytische proces al was gestart.

welke P2-Receptor (s) Is betrokken bij HlyA-geïnduceerde hemolyse?

erytrocyten drukken verschillende soorten P2-receptoren uit. De P2-receptoren waarvan is gemeld dat ze tot expressie komen in volwassen humane erytrocyten zijn P2Y1 (14), P2Y2 (15), P2Y13 (15), P2X1 (15) en P2X7 (16), terwijl P2Y1, P2X1, P2X4 en P2X7 aanwezig lijken te zijn in erytroïde voorlopercellen (17). Om te testen welke van deze purinerge receptoren deelneemt aan de HlyA-geïnduceerde hemolyse, hebben we de betreffende receptoren individueel benaderd. Aangezien de p2y1 receptor betrokken is bij sorbitol-geïnduceerde hemolyse van Plasmodium-geïnfecteerde humane en muriene erytrocyten (14), hebben we getest of deze receptor verantwoordelijk was voor de hlya-geïnduceerde hemolyse. De P2Y1-receptorantagonist MRS2179 had geen invloed op de HlyA-geïnduceerde hemolyse (Fig. S3A) bij concentraties (tot 500 µM) die verder gaan dan wat nodig was om hemolyse in met Plasmodium berghei geïnfecteerde erytrocyten te remmen (14). Aangezien er geen specifieke antagonisten voor p2y2 receptoren zijn, onderzochten we het effect van HlyA bij transgene muizen. De HlyA-geïnduceerde hemolyse was vergelijkbaar in erytrocyten van p2y2−/ – en p2y2+/+ muizen (Fig. S3B). In het geval van de P2Y13 hebben we de antagonist MRS2211 getest, waarvan is gemeld dat deze enige selectiviteit vertoont ten opzichte van de p2y13-receptor (18). MRS2211 verminderde hlya-geïnduceerde hemolyse significant in humane en muriene erytrocyten (Fig. S3C). Deze bevinding is in tegenspraak met onze resultaten met hexokinase (degraderende ATP tot ADP), die eerder de ADP-gevoelige p2y13-receptor zou moeten stimuleren dan remmen. Daarom moeten hexokinase en MRS2211 tegengestelde resultaten opleveren als de p2y13-receptor betrokken is. Aangezien dit niet het geval is, is de p2y13-receptor een onwaarschijnlijke kandidaat voor de P2-receptor die betrokken is bij HlyA-geïnduceerde hemolyse. We kunnen niet uitsluiten dat de remming geproduceerd door MRS2211 wordt gemedieerd via een andere P2 receptor.

in principe laat dit alleen de P2X-receptoren over. Fig. 3A toont aan dat de niet-selectieve blokker van P2X-receptoren Evans blue de HlyA-geïnduceerde hemolyse sterk verminderde, wat suggereert dat een P2X-receptor betrokken is bij deze hemolyse. Van de P2X-receptoren uitgedrukt in erytrocyten, beschouwden we de P2X7 als de meest waarschijnlijke mediator van HlyA-geïnduceerde hemolyse om de volgende redenen. Van de p2x7 receptoren is bekend dat ze een overgang ondergaan naar een grotere permeabiliteitstoestand, die uiteindelijk leidt tot lysis in bepaalde cellen (12). De p2x7 receptor is gemeld om met het kanaalproteã ne pannexin1 (12) in wisselwerking te staan, en het complex creëert een aanzienlijke poriedoorlatend aan Grotere molecules zoals ethidiumbromide (13). Pannexin1 wordt uitgedrukt in menselijke rode bloedcellen (19) en is onlangs voorgesteld als het ATP-afgiftekanaal in erytrocyten (20). Om te testen of P2X7-receptoren deelnemen aan HlyA-geïnduceerde hemolyse, gebruikten we antagonisten met relatieve selectiviteit voor P2X7: Brilliant Blue G (BBG), ATP-2′,3′-dialdehyde (OxATP) en KN-62 (21). Alle antagonisten verminderde de concentratie-afhankelijk hemolyse bij paarden, muizen en menselijke erytrocyten (Fig. 3). Erytrocyten bij paarden en bij mensen waren gevoeliger voor alle geteste stoffen in vergelijking met erytrocyten bij muizen. In dit verband dient te worden vermeld dat bekend is dat de muriene p2x7 receptor minder gevoelig is voor KN-62 in vergelijking met de menselijke receptor (22). De bescherming tegen hemolyse door P2X receptor antagonisme werd opnieuw onderbouwd voor het hele concentratiebereik van gezuiverde HlyA in menselijke erytrocyten met BBG als voorbeeld van een p2x7 antagonist (Fig. 3D). Opnieuw toont de antagonist een substantieel effect op HlyA-geïnduceerde hemolyse zelfs onder hlya concentraties die maximale hemolyse veroorzaakten. De remming van hemolyse door OxATP werd geverifieerd met gezuiverde HlyA in muriene en humane erytrocyten (Fig. 3E, inzet). De nieuwe selectieve, competitieve p2x7 receptor antagonist A438079 verminderde de hemolyse in menselijke erytrocyten, maar was minder efficiënt in muriene erytrocyten (Fig. 3F). Immunobloten van plasmamembraan-fracties voor de p2x7-receptor bevestigen dat humane en muriene erytrocyten een eiwit van relevante grootte tot expressie brengen (66 kDa, Fig. 3G, en volledig in Fig. S4B). Het zal verder onderzoek vereisen om de relatieve bijdrage van P2X-receptoren in de HlyA-geïnduceerde hemolyse volledig vast te stellen. Met onze huidige instrumenten, kunnen we de mogelijkheid van bijdragen van andere P2X receptoren in de HlyA-geïnduceerde hemolyse in een van de bestudeerde species niet uitsluiten.

Fig. S4A toont de HlyA-geïnduceerde hemolyse in muriene (p2x7+/+ en P2X7−/−) erytrocyten. De muriene erytrocyten vertonen een vergelijkbare mate van hemolyse als reactie op HlyA, ongeacht hun genotype. De p2x7 – / – muizen en p2x7+/+ muizen werden oorspronkelijk gegenereerd door Pfizer en werden terug gekruist naar BALB / C achtergrond. We hebben geen discrepanties gevonden tussen de gevoeligheid voor HlyA-geïnduceerde hemolyse in erytrocyten geïsoleerd uit BALB/C en c57bl/6 muizen (gegevens niet getoond), hoewel bekend is dat de c57bl/6-stam een genetische variatie heeft in de C-terminus van de p2x7-receptor (23). Deze gegevens zijn consistent met het minuscule effect van A438079 op muriene erytrocyten en de lage eiwitexpressie van de p2x7 receptor in muriene erytrocyten (Fig. 3F en 3G).

Deze resultaten impliceren dat er ten minste één extra P2-receptor betrokken is bij de HlyA-geïnduceerde hemolyse in muriene erytrocyten. Aangezien de p2x1 en P2X7 vergelijkbare inhibitor-profielen delen voor BBG, KN-62 en OxATP (24), hebben we de P2X1-antagonisten MRS2159 en NF449 getest. MRS2159 concentratieafhankelijke remming van hemolyse in erytrocyten van paard (EC50:150 µM) en muis (EC50: ≈250 µM). Menselijke erytrocyten waren relatief ongevoelig voor de antagonist, maar bij een concentratie boven 250 µM zagen we een kleine en statistisch significante reductie (Fig. 4A). Dit effect was veel meer uitgesproken als gezuiverd HlyA werd gebruikt (Fig. 4C). Dit houdt in dat er verschillen kunnen zijn in de cellulaire respons met betrekking tot de vraag of zij HlyA in zuivere vorm of in combinatie met andere E. coli-bestanddelen ondergaan. Nf449 concentratie-afhankelijk remt de HlyA-geïnduceerde hemolyse bij de mens (Fig. 4B). NF449 was veel minder efficiënt in muriene erytrocyten in overeenstemming met de muriene p2x1 receptor die relatief resistent tegen deze inhibitor zijn (25). Er moet worden benadrukt dat, hoewel NF449 een suraminerivaat is, het niet dezelfde volumeveranderingen in erytrocyten veroorzaakte als suraminerivaat. Het is bekend dat immunobloten van de p2x1-receptor tot 4 banden in verschillende weefsels vertonen; een 45 kDa niet-geglycosyleerd, een 60 kDa geglycosyleerd en een 95/120 kDa-band die de gepolymeriseerde vorm van de receptor zou kunnen zijn (26, 27). In onze handen herkende het p2x1 receptor antilichaam consequent een 45 KD band en een zeer zwakke 60 kDa band in vlekken van plasmamembranen van muriene en menselijke erytrocyten (Fig. 4D). Interessant, we vonden dat de expressie niveau 60 kDa band was veel hoger in de p2x7 – / – muizen in vergelijking met controles (vergelijkbaar in drie preparaten, Fig. 4D). In dit immunoblot worden de eiwitniveaus aangepast om overbelasting van de banden van de p2x7−/− muizen te vermijden, die de band van 60 kDa bijna undetectable in de p2x7+/+ muizen verlaat. Deze schijnbare up-regulatie van de p2x1 receptor kan mogelijk een hemolytisch fenotype verbergen in de p2x7 receptor–deficiënte muizen. Samen ondersteunen deze gegevens de hypothese dat zowel de p2x1-als de p2x7-receptor relevant zijn voor de HlyA-geïnduceerde hemolyse. Onze resultaten wijzen op significante interspecies variaties, waarbij de p2x7 receptor belangrijker is voor hemolyse in menselijke erytrocyten.

HlyA-geïnduceerde hemolyse wordt voorkomen door Pannexin1-antagonisten.

Carbenoxolon (28), mefloquine en probenecide (30) zijn gebruikt als antagonisten met een relatieve selectiviteit voor pannexin1. Carbenoxolon verminderde significant het niveau van hemolyse bij alle drie de soorten met vergelijkbare gevoeligheid (Fig. 5A). Het effect van carbenoxolon werd opnieuw getest op de hele reeks HlyA-concentraties (gezuiverd toxine, Fig. 5B), die ook aanzienlijke effecten vertonen bij maximale HlyA-concentraties. Mefloquine en probenecide werden alleen getest in muriene en humane erytrocyten. De EC50 voor mefloquine was 25 µM bij de mens en 18 µM bij muriene erytrocyten. Probenecide remde hemolyse in menselijke erytrocyten, met een EC50 van 2 mM, maar was minder effectief in muriene erytrocyten. Onlangs is aangetoond dat de bekende Cl-kanaalantagonisten NPPB en niflumaatzuur ook pannexinekanalen remmen (31). Beide stoffen verminderden de HlyA-geïnduceerde hemolyse, met een aanzienlijk meer uitgesproken effect op menselijke erytrocyten (Fig. S5).