Actomyosin contractiliteit schalen met myoblast elongatie en verbetert differentiatie door Yap nucleaire export

myoblasten nemen een verlengde vorm aan om hun actinenetwerk te differentiëren en te reguleren naar het verspreidingsgebied

om de relatie tussen celvorm, actinenetwerk en focale adhesie te beoordelen, hebben we C2C12 myoblasten gekweekt op een homogene laag fibronectine Fn). Na 24 uur in cultuur, werden myoblasten gefixeerd en gekleurd voor actin om hun morfologische parameters te bepalen (Fig. 1 bis). Fn-gecoate substraten maakten het mogelijk specifieke cel-substraat interacties tot stand te brengen door specifieke transmembraanintegrines te werven. Verschillende α-integrine-subeenheden die met β1-subeenheden worden gecombineerd, komen tot expressie tijdens skeletmyogenese, die belangrijk zijn voor de migratie van myogene cellen, myoblastfusie,rijping van spiervezels of voor het behoud van spierintegriteit32, 33. Aanvullende experimenten uitgevoerd op laminine (LAM)-gecoate substraten aangegeven dat zowel morfologische parameters (cel vorm index, cel omtrek en cel gebied, aanvullende Fig. 1A) en cel-substraat interactie (aantal en gebied van brandpuntsadhesie, aanvullende Fig. 1B) waren statistisch vergelijkbaar Op FN en LAM, waardoor de Fn-coating werd gevalideerd voor het in vitro bestuderen van de morfologieën van C2C12 myoblasten tijdens het fusie/differentiatieproces.

figuur 1

myoblasten nemen een langgerekte vorm aan om hun actinenetwerk te differentiëren en te reguleren naar het verspreidingsgebied. (A) kleurgecodeerde epifluorescentiebeelden van typische C2C12 individuele myoblasten die in vitro verschillende Cell Shape Indexes (CSI) vertonen. Cellen waren bevlekt met phalloidine voor actine. Schaal bars zijn 20 µm. De morfologische analyse van (B) de CSI (R2 = 0,80), (C) de celperimeter (R2 = 0,97) en (D) het celoppervlak (R2 = 0.82) geven aan dat in vitro gekweekte C2C12-cellen een gemiddelde oppervlakte van 2057 ± 618 µm2 en een gemiddelde CSI van 0,37 ± 0,15 vertonen (n = 101 voor B, C en D). Rode rondingen zijn Gaussiaanse pasvormen. (E) Lineaire evolutie van de fluorescentieintensiteit van actine als functie van het celgebied (R2 = 0,748, n = 28). Evolutie van het totale vinculineoppervlak als functie van (F) het celoppervlak (R2 = 0,783, n = 28) en (G) en de intensiteit van F-actine (n = 28). (H) tijdlijn van proliferatie (in geel) en differentiatie (in rood) van C2C12 myoblasten in vitro. De zwarte pijl geeft de vervanging aan van proliferatiemedia door differentiatiemedia. (I, J) beeldverhouding van myoblasten bij P0, P2 (proliferatiestadia, gemiddelde = 0,40 ± 0,16 bij P0, n = 150 voor beide) en D2 (differentiatiestadia, gemiddelde = 0,24 ± 0,07, n = 100).

we kwantificeerden de cell shape index (CSI) die de morfologie van myoblasten karakteriseerde door informatie te geven over de cellulaire elongatie. Afgeronde cellen hebben een CSI dicht bij 1, terwijl langwerpige cellen een CSI dicht bij 0 hebben. We vonden CSI variërend van 0,1 tot 0,8 met een gemiddelde waarde van 0.37 ± 0,15( n = 101), wat wijst op een grote variabiliteit in celmorfologieën (Fig. 1 ter). Myoblasten vertoonden een gemiddelde omtrek van 259 ± 82 µm (Fig. 1C, n = 101) en een groot aantal verspreidingsgebieden (van ~ 1000 tot ~ 4000 µm2), met een gemiddelde waarde van 2057 ± 618 µm2 (Fig. 1D, n = 101). Deze bevindingen verkregen op C2C12 myoblasten werden versterkt door het uitvoeren van extra morfologische metingen (CSI, cel perimeter en cel gebied) op primaire menselijke myoblasten (16ubic, aanvullende Fig. 2A) die uit de biceps van een patiënt komen onaangetast door FSHD (d.w.z. waarvan is bevestigd dat het ontbreekt aan een 4QA-deletie). Zoals aangegeven in aanvullende Fig. 2B-D, Onze resultaten tonen aan dat de CSI van 16ubische myoblasten varieerde van 0,14 tot 0,86 met een gemiddelde waarde van 0,44 ± 0,17 (n = 90), wat wijst op een grote variabiliteit in celmorfologieën voor menselijke myoblasten, zoals waargenomen voor C2C12 cellen. Samen tonen onze resultaten aan dat de variabiliteit van celmorfologieën niet afhankelijk is van het celtype of enig artefact van de celcultuur.

we bestudeerden vervolgens de distributie van actine filamenten in een populatie van C2C12 myoblasten om te begrijpen of de variabiliteit verspreidende gebieden het actine cytoskelet kunnen moduleren. Onze bevindingen toonden aan dat de totale fluorescentieintensiteit van het F-actin-netwerk lineair gerelateerd was aan het cellulaire gebied (Fig. 1E, n = 31, R2 = 0,748), wat suggereert dat hoe groter de verspreiding van myoblast, hoe meer actine filamenten worden gevormd. Zoals aangegeven in aanvullende Fig. 3, kenmerkten wij vervolgens de distributie van vinculin-bevatte adhesie om te bepalen hoe variaties van celvorm cel-substraat interactie in C2C12 myoblasten beïnvloeden. Wij vonden dat het totale gebied van cel-substraatadhesie per cel met celgebied toenam (Fig. 1F, n = 31, R2 = 0,783) en met de fluorescentieintensiteit van F-actin (Fig. 1G). Onze resultaten wijzen erop dat C2C12 myoblasts een verscheidenheid van celformulieren en het verspreiden van gebieden aannemen, maar op zijn beurt zowel de hoeveelheid actin filamenten en vinculin adhesie aan hun het verspreiden aanpassen. Om meer inzicht te krijgen in de rol van celvorm voor myoblastdifferentiatie, bekijken we vervolgens de evolutie van de cel-beeldverhouding tijdens proliferatie (P0 bij 6 uur en P2 bij 48 uur) en differentiatie (D2 bij 96 uur) stadia (Fig. 1H). Zoals in Fig. 1I, J, onze bevindingen tonen aan dat myoblasten verhoogde hun aspect ratio van 0,40 ± 0,16 (P0) tot 0,36 ± 0,09 (P2) en 0,24 ± 0,07 (D2), wat suggereert dat myoblasten verlengen aanzienlijk en nemen een aspect ratio van 1:4 om te differentiëren. Bovendien gaven onze resultaten aan dat de actin stress vezels sterk gericht waren op D2 (aanvullende Fig. 4A, B), ook overeenkomend met significante nucleaire rek (aanvullende Fig. 4C). Samen laten onze bevindingen zien dat het F-actin netwerk gemoduleerd wordt door modificaties van de myoblast morfologie en geven aan dat de differentiatie van myoblasten cellulaire elongatie vereiste tot een beeldverhouding van 1:4.

de ruimtelijke organisatie van het actin-netwerk en de kern wordt geleid door de myoblastmorfologie

we controleerden de intrinsieke variabiliteit in myoblastmorfologieën door gebruik te maken van zelfklevende micropatronen om hun verspreidingsgebieden te standaardiseren en hun vormen te controleren. Met behulp van een microcontactdruktechniek20 creëerden we zelfklevende micropatronen van fibronectine (FN) met een constant oppervlak van 1600 µm2 en verschillende geometrieën. We gebruikten afgerond (CSI = 1), kwadraat (CSI = 0,79), driehoekig (CSI = 0,60) en verschillende aspectratio ‘ s van rechthoekig (CSI = 0,50 en 0,34 voor 1:4 en 1:7 beeldverhoudingen, respectievelijk) Fn micropatronen tot kweek individuele myoblasten (Fig. 2 bis). Deze verschillende geometrieën van micropatronen maakten het mogelijk om in vitro de myoblastvorm over een breed bereik te standaardiseren en hun verspreidingsgebied te controleren.

Figuur 2

de ruimtelijke organisatie van het actin-netwerk en de kern wordt geleid door de myoblastmorfologie. (A) Epifluorescentie beelden van C2C12 cellen gekweekt op fibronectine (FN) micropatronen van 1600 µm2 en immunostained voor F-actine (groen), kernen (blauw) en vinculine (rood). Cirkelvormige, kwadratische, driehoekige en rechthoekige (1:4 en 1:7 beeldverhoudingen) micropatronen komen overeen met CSI = 1, respectievelijk 0,79, 0,60, 0,50 en 0,34. Schaal bars zijn 20 µm. (B) typische voorbeelden van de ruimtelijke organisatie van actine filamenten in micropatroon C2C12 cellen die kleurgecodeerd zijn volgens hun oriëntaties. Schaal bars zijn 20 µm. (C) oriëntatie van het actinenetwerk in afgerond (n = 12 in zwart), kwadraat (n = 11 in rood), driehoekig (n = 19 in blauw) en 1:4 (N = 18 in groen) of 1:7 (N = 11 in roze) rechthoekige micropatroon myoblasten. Evolutie van (D) de nucleaire aspect ratio en (E) de nucleaire oriëntatie voor verschillende geometrieën van myoblasten (10 ≤ n ≤ 15 voor elke CSI).

om de rol van de celgeometrie op de ruimtelijke organisatie van het actine-cytoskelet kwantitatief te bepalen, bepaalden we de oriëntatie van de actine-filamenten voor elke celvorm34,35. Actine filamenten gekleurd met phalloidin waren kleur-gecodeerd als functie van hun oriëntatie met een kleurgradiënt variërend van lichtblauw wanneer actine filamenten werden georganiseerd parallel (0°) aan de horizontale as en rood (+90°) of oranje (-90°) voor die loodrecht op de horizontale as georganiseerd (Fig. 2B). Wij merkten op dat actin filamenten in afgeronde cellen willekeurig werden verdeeld, met oriëntaties die zich van -90° tot +90°uitstrekken. Vierkante cellen tentoongesteld actin filamenten georganiseerd in drie belangrijkste hoekige domeinen: 0° aan 25°, 50° aan 90° en -50° aan -90°, terwijl de driehoekige cellen actin filamenten toonden hoofdzakelijk georganiseerd volgens de drie kanten van het patroon bij 0°, 60° en -60°. Interessant is dat we vonden dat actine filamenten sterk parallel aan de lange cel as (0°) georiënteerd waren voor rechthoekige cellen van 1:4 (CSI = 0,50) en 1:7 (CSI = 0,34) aspect ratio ‘ s. De kwantificering van vinculine-bevattende adhesie wees niet op statistische verschillen van adhesiegebieden tussen celmorfologieën (aanvullende Fig. 5A-C), terwijl de oriëntatie van brandpuntsadhesie door celvorm werd gemoduleerd (aanvullende Fig. 5D, E), zoals waargenomen voor actine filamenten. Onze bevindingen tonen aan dat zowel 1:4 als 1: 7 rechthoekige myoblasten een sterkere organisatie van actin cytoskelet (Fig. 2C) en brandpuntsadhesie, die voorstelt dat de verlenging van myoblast tot de vorming van contractiele dipolen leidt.

rekening houdend met de rol van de celkern in de differentiatie van myoblasten in myotubes, onderzochten we vervolgens of veranderingen in celvorm en cytoskeletarchitectuur de vorm en oriëntatie van de nucleus kunnen moduleren 36. Wij stelden vast dat de verhouding van het nucleaire aspect aanzienlijk toenam met de verlaging van de CSI (Fig. 2D). Afgeronde cellen (CSI = 1) op cirkelvormige micropatronen vertoonden inderdaad een afgeronde kern die gekenmerkt werd door een gemiddelde beeldverhouding van 1,11 ± 0,06, terwijl rechthoekige cellen met een beeldverhouding van 1:4 (CSI = 0,50) en 1:7 (CSI = 0,34) grote nucleaire vervormingen vertoonden met beeldverhoudingen van respectievelijk 1,39 ± 0,21 en 2,19 ± 0,23. We merkten ook dat de oriëntatie van de kern werd gemoduleerd door de celmorfologie (Fig. 2E). We vonden dat de oriëntatie van de kern in afgeronde, kwadraat en driehoekige cellen overspande een breed scala van hoeken (van ~15° tot ~60°), met een gemiddelde oriëntatie van ~40° (cirkelvormig, n = 11), ~33° (vierkant, n = 14) en ~43° (driehoek, n = 10) ten opzichte van de horizontale as. Voor rechthoekige cellen gaven onze resultaten aan dat de kern parallel aan de Celas was georiënteerd met een gemiddelde hoek van ~14° (1:4, n = 15) en ~2° (1:7, n = 10).

celelongatie verbetert de contractiliteit van myoblast

de volgende vraag die we beantwoordden was hoe veranderingen in de vorm van de cel de contractiliteit van myoblast beïnvloeden. Om deze vraag te beantwoorden, gebruikten we de tractiekrachtmicroscopie (TFM) om de tractiespanningen te bepalen die door micropatterned myoblasten worden uitgeoefend. Zoals in Fig. 3A we merkten op dat de maximale spanningen werden uitgeoefend aan de uiteinden van de micropatroon myoblasten, ongeacht de vorm van de cel. Zoals eerder waargenomen bij andere celtypes37, verzamelde de contractiele spanning zich bij voorkeur in de hoeken (vierkanten en driehoeken) of aan beide uiteinden (1:4 en 1:7 rechthoeken) van micropatroon myoblasten. We gekwantificeerd de totale stress uitgeoefend door individuele micropatroon myoblasten om te bepalen of de cel morfologie moduleert de cel contractiliteit. Zoals in Fig. 3B, afgeronde cellen (CSI = 1) oefenden een totale spanning uit van 170,7 ± 46,4 N/m2, terwijl rechthoekige cellen (CSI = 0,34, beeldverhouding 1:7) een grotere totale hoeveelheid spanning uitoefenden (295,9 ± 156.8 N / m2), wat suggereert dat langwerpige celvormen leiden tot verhoogde tractiespanningen. Verder vonden we dat rechthoekige cellen (CSI = 0,34, beeldverhouding 1:7) de grotere maximale spanningswaarde (684,3 ± 257,8 Pa, Fig. 3C), terwijl afgeronde myoblasten de laagste maximale spanningswaarde vertoonden (351,5 ± 123,6 Pa). Gezien het feit dat de contractiele spanningen werden uitgeoefend aan de celrand en dat het verlagen van de CSI leidt tot verhoogde tractiespanningen, hebben we de maximale spanningswaarde uitgezet als functie van de afstand van het centrum van de massa tot het uiteinde van de cel (Fig. 3D), die 22,6 µm (CSI = 1), 28.28 µm (CSI = 0,79), 33,98 µm (CSI = 0,60), 41,23 µm (CSI = 0,50) en 53,45 µm (CSI = 0,34) vertegenwoordigt. Zoals in Fig. 3D, vonden we dat de maximale contractiele stress lineair toenam met de afstand van het centroïde tot het uiteinde van de cel (R2 = 0,958, n = 65), wat suggereert dat langwerpige morfologieën van myoblasten meer tractiekrachten uitoefenen.

om de bijdrage van het actomyosine-netwerk in de vorming van contractiele krachten in myoblasten te bepalen, werden C2C12-cellen behandeld met het G-actine-sequesterend geneesmiddel Latrunculine B (LatB) en met de myosin II-remmer Blebbistatine (Bleb). Immunostained myoblasten met phalloidin wees erop dat LatB en Bleb-behandelde cellen een diffuus actinenetwerk vertoonden (Fig. 3E), die aantonen dat beide drugs beduidend de organisatie van F-actin beà nvloed. We gebruikten TFM op micropatroon myoblasten behandeld met beide geneesmiddelen om de rol van het actomyosin netwerk te bepalen in de vorming van contractiele krachten in myoblasten van verschillende geometrieën. Onze bevindingen geven aan dat LatB behandeling veroorzaakte een significant verlies van contractiliteit, die nam toe met de cel verlenging. Afgeronde cellen vertoonden inderdaad een verlies van contractiele stress van ~ 62%, terwijl 1:4 en 1: 7 rechthoekige cellen behandeld met LatB werden gekenmerkt door een verlies van contractiele stress van ~ 88% en ~ 86%, respectievelijk (Fig. 3F). Bovendien vonden we dat de contractiele stress van 1:4 rechthoekige cellen behandeld met Bleb werden gekenmerkt door een verlies van ~80% van de contractiele kracht, waaruit blijkt dat myosine II moleculaire motoren zijn belangrijke spelers van de myoblast contractiele krachten.

samen geven deze resultaten aan dat de contractiliteit van het actomyosine-netwerk wordt versterkt in langwerpige myoblasten door de oprichting van een dicht netwerk van parallelle actomyosine-vezels.

de contractiliteit van celparen nam toe na hun fusie en raise op langwerpige micropatronen

om te begrijpen hoe myoblastmorfologie de contractiele eigenschappen van myotubes kan beïnvloeden, beschouwen we een minimaal model van twee myoblasten. We hebben eerst de trekkrachten bepaald die worden uitgeoefend door cel doublets bij P1 (24 uur in proliferatiemedia) die op micropatronen van verschillende vormen worden geplaatst (aanvullende Fig. 6 bis). Er waren geen statistische verschillen in contractiele stress tussen het brede scala van CSI (aanvullende Fig. 6B), ondanks een welomschreven oriëntatie van het actin-netwerk (aanvullende Fig. 6C) en de kernen (aanvullende Fig. 6D, E) op 1:4 en 1: 7 rechthoekige micropatronen. Op basis van deze observatie kwantificeerden we vervolgens de contractiele spanning die wordt uitgeoefend door cel doublets gekweekt op cirkelvormige (Csi = 1) en rechthoekige (CSI = 0,50, 1:7 beeldverhouding) Fn micropatronen gedurende vijf extra dagen (D5, Fig. 1H) in differentiatiemedium. We gebruikten MitoTracker Red CMXRos (Thermofisher Scientific), een levende mitochondriale kleuring, om ervoor te zorgen dat myoblast doublets werden gesmolten (Fig. 4A) 38. Zoals in Fig. 4B, C, vonden we dat de totale contractiele spanning iets verhoogd was in gefuseerde cel doublets gekweekt op cirkelvormige micropatronen (267 ± 64 Pa) in vergelijking met cirkelvormige niet-gefuseerde cel doublets (157 ± 37 Pa), terwijl gefuseerde langwerpige doublets meer dan twee keer meer contractiel waren (543 ± 193 Pa) dan niet-gefuseerde langwerpige doublets (211 ± 73 Pa). Deze resultaten wijzen erop dat de cellulaire contractiliteit na celfusie toenam en significant verbeterd was voor langwerpige morfologieën.

Figure 4

de contractiliteit van celparen nam toe na hun fusie en raise op langwerpige micropatronen. (A) Epifluorescentiebeelden van C2C12-celparen, niet-gefuseerd (D) en gefuseerd (FD) op cirkelvormige en rechthoekige (1:7 beeldverhouding) Fn-micropatronen en gekleurd voor mitochondriën met Mito Tracker. Schaal bars zijn 20 µm. B) representatieve kaarten van de contractiele spanning die wordt uitgeoefend door C2C12-celparen gefuseerd op cirkelvormige en rechthoekige Fn-micropatronen. C) ontwikkeling van de totale spanning voor niet-geanelleerde (d), (gewone staven) en gesmolten (FD, gehashte staven) C2C12-celparen op cirkelvormige (in grijs) en rechthoekige (in paars) Fn-micropatronen. Cirkel D: n = 8; cirkel FD: n = 5; rechthoek D: n = 6 en rechthoek FD: n = 8. ** p < 0,01.

Actomyosinecontractiliteit bevordert myotube-differentiatie

toen werd gevraagd of de actomyosinecontractiliteit van myoblasten de myotube-differentiatie kon beïnvloeden. C2C12 myoblasten werden gekweekt op Fn-gecoate substraten in proliferatiemedia gedurende 2 dagen (P2, Fig. 1H) om de cellulaire samenvloeiing te bereiken. Vervolgens werden ofwel LatB of Bleb gedurende 30 minuten toegevoegd en werd het proliferatiemedium vervangen door een differentiatiekweekmedium. Na 4 dagen in differentiatiemedium (D4, vijg. 1H), C2C12 cellen werden bevestigd en gekleurd voor DNA en TroponinT, een marker van differentiatie (Fig. 5). We beoordeelden het effect van LatB en Bleb behandelingen door Alfa actinine te kleuren op controle myotubes (CTRL) en myotubes behandeld met Latrunculine B (+LatB) en blebbistatin (+Bleb). Zoals waargenomen in aanvullende Fig. 7, Controle myotubes aanwezig typische gestreepte Z-band patronen, terwijl LatB en Bleb behandelingen striatie patronen in myotubes verstoren. Controle myotubes (CTRL) werden gekenmerkt door een gemiddelde beeldverhouding van 7,99 ± 3,38 (Fig. 5A) en een positieve troponine T oppervlakte van 51,7 ± 5,6% (Fig. 5B). Onze bevindingen wijzen erop dat LatB en Bleb behandelingen de fractie van troponine T gebied verminderde tot respectievelijk 44,9 ± 5,2% en 44,4 ± 5,1%. Bovendien vonden we dat de fusieindex statistisch lager was voor LatB (27 ± 3%) en Blebb-behandelde (29 ± 3%) cellen dan voor controlecellen (38 ± 5%), waardoor de rol van de actomyosine-contractiliteit in myoblastdifferentiatie werd versterkt (Fig. 5C). Samen genomen, gaven deze resultaten aan dat de actomyosin contractiliteit van myoblasten myotube differentiatie bevordert.

Figuur 5

actomyosine contractiliteit bevordert myotube differentiatie. (A) verdeling van de myotube-beeldverhouding na 4 dagen in differentiatiemedia (n = 114, R2 = 0,915). Evolutie van (B) het percentage positieve oppervlakte voor troponine T en (C) de fusieindex in controlecellen (CTRL), LatB en Bleb-behandelde cellen (n = 20 voor elk). (D) typische epifluorescentiebeelden van controle myotubes (Ctrl), LatB en Bleb-behandelde myotubes gevormd na 4 dagen in differentiatiemedia. Myotubes werden immunostined voor DNA (blauw) en troponine T (rood). Schaal bars zijn 100 µm. *p < 0,05,* * p < 0,01 en n. s. niet significant.

Myoblast elongation triggers Yap nuclear export, which is essential to the differentiation of myoblasten into myotubes

om meer inzicht te krijgen in de intracellulaire mechanismen die de myotube differentiatie controleren, beschouwen we de rol van YAP door de lokalisatie ervan te bepalen in het cytoplasma of de kern van myoblasten, waar het bindt naar en activeert tead transcriptie factors39. Hiertoe kwantificeerden we de cytoplasmische/nucleaire Yap-verhouding in micropatroon myoblasten (Fig. 6A en aanvullende Fig. 8). Cel verlenging op 1:4 en 1: 7 rechthoekige micropatronen verhoogden de cytosolic / nucleaire Yap verhouding (Fig. 6B), wat suggereert dat celelongatie Yap nucleaire export veroorzaakt door nucleaire drukkrachten die worden uitgeoefend door het actomyosin-netwerk40. Om te controleren of de lokalisatie van YAP in het cytoplasma of de kern gerelateerd is aan specifieke stadia van het differentiatieproces, hebben we YAP gekleurd in C2C12 cellen na 24 uur (P1) en 48 uur (P2) van de proliferatiestap en bij 96 uur (D2) en 264 uur (D9) van de differentiatiestap (Fig. 6C en aanvullende Fig. 9). Interessant is dat onze resultaten erop wezen dat de cytoplasmische/nucleaire Yap-verhouding steeg van 0,37 ± 0,07 bij P1 tot 0,68 ± 0,06 bij P2 en 0,67 ± 0,06 bij D2 en toen daalde tot 0,42 ± 0,10 bij D9 (Fig. 6D). Interessant is dat de cytoplasmatische/nucleaire Yap-verhouding bij D9 statistisch niet verschilde van P1-waarden, wat suggereert dat de cytoplasmische/nucleaire Yap-verhouding in gedifferentieerde myotubes vergelijkbaar is met die van myoblasten. Om deze resultaten te verifiëren, hebben we myoblasten geoogst in de proliferatiefase P1 (24 uur) en de differentiatiefase D2 (96 uur) en hebben we hun cytoplasmatische en nucleaire materialen geïsoleerd. We voerden een bicinchoninezuur (BCA) eiwit assay en de eiwitten in cytoplasmische en nucleaire extracties werden geanalyseerd door elektroforese (Fig. 6E). Onze bevindingen van de Westelijke vlek wezen erop dat de cytoplasmatische / nucleaire Yap-Verhouding van 0,62 ± 0,08 bij P1 tot 0,87 ± 0,24 bij D2 steeg (Fig. 6F). Deze biochemische kwantificering van YAP toonde een significante Yap nucleaire export aan in het differentiëren van C2C12 cellen en versterken onze bevindingen.

Figure 6

myoblast elongation triggers Yap nuclear export, die essentieel is voor de differentiatie van myoblasten in myotubes. (A) Epifluorescentiebeelden van C2C12 cellen gekweekt op FN micropatronen van 1600 µm2 en immunobehandeld voor YAP. Schaal bars zijn 20 µm. (B) cytoplasmatische tot nucleaire Yap-verhouding voor de verschillende myoblastmorfologieën (n = 10 voor elk). (C) Epifluorescentiebeelden van samenvloeiende C2C12-cellen die voor YAP worden immunobehandeld op dag 1 (P1, 24 uur) van het proliferatiestadium en op dag 2 (D2, 96 uur) en dag 9 (D9, 264 uur) van het differentiatiestadium. Schaal bars zijn 100 µm. D) cytoplasmatische tot nucleaire Yap-verhouding bij P1 (n = 50), P2 (n = 30), D2 (n = 30) en D9 (n = 30). (E) Western blot analyse van Yap (65 kDa) expressie in C2C12 proliferatie en differentiatie. F) cytoplasmatisch tot nucleair YAP-rantsoen ( gemiddelde ± S. D.) tijdens proliferatie en differentiatie (3 DUPLO ‘ s voor elke voorwaarde met 20.106 cellen / duplo). G) cytoplasmatische tot nucleaire YAP-verhouding bij D2 en H) fusion index for control (CTRL) en leptomycine (LMB) – behandelde cellen bij D4. **p < 0,01, * * * * p < 0,0001 en n. s niet significant.

Op basis van deze resultaten hebben we de rol van YAP beoordeeld door leptomycine B te gebruiken om actieve export vanuit de kern te blokkeren door direct te binden aan exportin141. Alberto Elosegui-Artola en collega ‘ s hebben onlangs aangetoond dat leptomycine B (LMB) efficiënt kan worden gebruikt om te bestuderen hoe de contractiele krachten van het cytoskelet de nucleaire translocatie van YAP aandrijven.39 Door het behandelen van C2C12 myoblasten bij p2 (48 h) met LMB, vonden we dat de cytoplasmische tot nucleaire Yap ratio significant lager was in met LMB behandelde cellen bij D2 (96 h, Fig. 6G), wat suggereert dat YAP voornamelijk geconcentreerd is in de kern wanneer de nucleaire export wordt geremd. Bovendien gaven onze bevindingen aan dat de fusieindex op D4 van met LMB behandelde cellen (Fig. 6U) was zeer laag (3,8 ± 1.5%) vergeleken met controlecellen (42,4 ± 9,1%), waaruit blijkt dat actieve nucleaire export vereist is voor C2C12-differentiatie.

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.