de geschikte Marker voor astrocyten: vergelijking van de verdeling en expressie van drie Astrocytische Markers in verschillende cerebrale gebieden van muizen

Abstract

astrocyten hebben verschillende morfologische kenmerken, afhankelijk van het cerebrale gebied waarin ze worden gevonden. Echter, geen van de huidige astrocytische markers kunnen alle subpopulaties met succes labelen. Het identificeren van de juiste marker voor een specifiek wetenschappelijk onderzoek is dus van cruciaal belang. Hier vergeleken we de distributie en eiwitexpressie van drie astrocytenmarkers: NDRG2, GFAP, en S100ß, in de cortex, hippocampus, en thalamus. NDRG2-en S100ß-positieve astrocyten werden uniformer verdeeld dan GFAP-positieve astrocyten over het hele cerebrum. De immunoreactiviteit van ndrg2 en S100ß was het sterkst in de dorsale cortex en thalamus, terwijl de immunoreactiviteit van GFAP het sterkst in de hippocampus was. Bovendien waren de eiwituitdrukkingsniveaus van NDRG2, GFAP, en s100ß in volwassen muizen het hoogst in de cortex, hippocampus, en thalamus, respectievelijk. We ontdekten ook astrocytenmorfologie en vonden dat in het corpus callosum en de cerebrale Steel, GFAP-positieve astrocyten werden gevonden met talrijkere en langere processen dan ndrg2 – en S100ß-positieve astrocyten. Deze resultaten tonen aan dat NDRG2 en S100ß meer geschikt worden gebruikt om de totale verdeling en veranderingen in het aantal astrocyten, evenals label astrocyten in de cortex en thalamus visualiseren. GFAP, echter, wordt geschikter gebruikt om astrocyten in het corpus callosum, cerebrale steel, en de hippocampus te etiketteren. Deze resultaten helpen om onderzoekers in de keuze van aangewezen astrocytmarker te leiden en stellen verschillen in immunologische kwaliteiten van astrocyten voor die op het weefsel worden gebaseerd waarin zij worden gevonden.

1.

astrocyten worden lang beschouwd als hulpcellen die alleen trofische, metabole en structurele ondersteuning bieden aan neuronen . In de afgelopen jaren heeft uitgebreid onderzoek echter aangetoond dat ze een cruciale rol spelen in cerebrale fysiologische en pathologische functies. Astrocyten helpen in het onderhoud van ion homeostase en bloed-cerebrale barriã res, synaps vorming, en verwijdering, evenals het controleren van cerebrale bloedstroom en het reguleren van neurotransmitter recycling, glutamaat excitotoxiciteit, en antioxidant stress . Belangrijk, astrocyten bezitten morfologische, populatie, en functionele diversiteit in verschillende cerebrale gebieden . Daarom is het identificeren van de meest geschikte marker voor de polymorfe en meerdere subgroepen van astrocyten cruciaal voor onderzoek naar astrocytische Multifunctie.

Glial fibrillary acid protein (GFAP) is de meest gebruikte astrocytische marker, maar als het belangrijkste intermediaire filament waaruit cytoskelet bestaat, labelde GFAP slechts ongeveer 15% van het totale astrocytenvolume en meer dan 40% van de astrocyten bleken GFAP-negatief te zijn bij de volwassen rattenhipocampus . Bovendien labelde GFAP slecht protoplasmatische menselijke astrocyten en werd laat in de ontwikkeling van vezelige astrocyten tot expressie gebracht .

een andere veelgebruikte astrocytaire marker is S100ß, een Ca2 + bindingspeptide dat overvloedig aanwezig is in het cytoplasma, en een kern van astrocyten die betrokken is bij de regulering van de celcyclus en de modificatie van het cytoskelet . Echter, S100ß wordt ook uitgedrukt in een subpopulatie van rijpe oligodendrocyten, in de choroïde plexus epitheliale cellen, en in een paar neuronen . De tekortkomingen van GFAP en S100ß in het etiketteren astrocyten kunnen leiden tot onnauwkeurigheden of zelfs fouten in het verkennen van de functies van astrocyten.

n-Myc downstream-gereguleerd Gen 2 (ndrg2) werd voor het eerst ontdekt in een normale menselijke cerebrale cDNA-bibliotheek met een op PCR gebaseerde subtractieve hybridisatiemethode . Het is een tumorontstoringsapparaat en cel stress-gerelateerd gen geassocieerd met celproliferatie en differentiatie . NDRG2 komt veel voor in de hersenschors, olfactorische bol, midcerebraal, hippocampus en thalamus . Het belangrijkste is dat NDRG2 specifiek wordt uitgedrukt in astrocyten van de hersenen . Daarom wordt NDRG2 beschouwd als een nieuwe astrocytische marker, vooral voor volwassen, niet-reactieve en niet-prolifererende astrocyten . Echter, of NDRG2 betrouwbaarder is dan GFAP en S100ß als astrocytische marker, evenals de verschillen in hun distributie en expressie in verschillende cerebrale regio ‘ s, is niet gemeld.

in de huidige studie hebben we de distributie, eiwitexpressie en wederzijdse colokalisatie van astrocytische markers NDRG2, GFAP en S100ß in het hele cerebrum van muizen vergeleken. We wilden de meest geschikte marker voor astrocyten in verschillende cerebrale gebieden identificeren.

2. Materialen en methoden

2.1. Dieren

jonge, volwassen en oude c57bl/6 mannelijke muizen in de leeftijd van 1 maand, 3 maanden, 6 maanden, 9 maanden en 12 maanden werden verkregen van het proefdiercentrum van de Central South University. De dieren waren vrij om te eten en te drinken, op een temperatuur van 25 ± 1°C gehouden en gehuisvest met een 12:12-h licht-donker cirkel om het circadiaanse ritme van het dier te simuleren. Alles werd in het werk gesteld om het lijden van dieren tot een minimum te beperken en het aantal gebruikte dieren te verminderen. Alle dierproefprocedures volgden een protocol dat werd goedgekeurd door de ethische commissie voor dierproeven van de Central South University Animal Care and Use Committee, China.

2.2. Celculturen

De HT22-cellen (een neuronale cellijn) en MA1800-57-cellen (een astrocytencellijn) werden gekweekt in Dulbecco ’s Modified Eagle’ s Medium (DMEM, HyClone) met 10% foetaal runderserum (FBS, Gibco), 50 U/mL penicilline en 50 µg/mL streptomycine. De OLN-93 cellen (een oligodendrogliale cellijn) werden bewaard in DMEM aangevuld met 10% FBS, 2 mM Glutamine, 50 U/mL penicilline en 50 µg/mL streptomycine. De cellen werden allemaal op 37°C gehouden in een mengsel van 95% atmosferische lucht en 5% CO2. De HT22-cellen, OLN-93-cellen en MA1800-57-cellen werden op objectglaasjes gezaaid en waren gekleurd met antilichamen tegen respectievelijk microtubule-associated protein 2 (MAP2), α-tubuline en GFAP.

2.3. Immunofluorescentie kleuring Assay

nadat de muizen werden verdoofd met natriumpentobarbital (50 mg/kg), werden hun cerebrums geëxtraheerd en gefixeerd met 0,9% koude hepariniseerde zoutoplossing en 4% paraformaldehyde. Na postfixatie werden de cerebrums achtereenvolgens gedehydrateerd in 20% sucrose-en 30% sucrose-oplossingen. Secties met een dikte van 10 µm werden bereid met een Leica CM1900 diepvriessnijmachine. De cerebrale secties werden geïncubeerd in 1% H2O2 gedurende 15 min en 0,3% Triton X-100 gedurende 15 min, met 3 x wasbeurten in PBS postincubatie tussen elke behandeling. De secties werden vervolgens geblokkeerd in 5% normale geit serum gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en overnacht geïncubeerd bij 4°C in een bevochtigen doos met primaire antilichamen als volgt: muis anti-GFAP-antilichaam (#3670, 1:500, Cell Signaling Technology); konijn anti-NDRG2 antilichaam (#5667, 1:200, Cell Signaling Technology); muis anti-NDRG2 antilichaam (#DA281-6A5, 1:100, Sigma); konijn anti-S100ß antilichaam (#2017-1, 1:500, Epitomics); muis anti-Glutamine Synthetase (GS) antilichaam (#MAB302, 1:200, Millipore); konijn anti-MAP2 antilichaam (#ab32454, 1:500, Abcam); en muis anti-α-tubuline antilichaam (#T6199, 1:500, Sigma). Vervolgens werden de secties geïncubeerd met mengsels van Alexa-488 (groen, Invitrogen) en Alexa-647 (rood, Invitrogen)-geconjugeerde ezel anti-konijn of ezel anti-muis secundaire antilichamen voor 2 uur in het donker bij kamertemperatuur. 4,6-Diamidino-2-fenylindol (DAPI) (ZLI-9557, Zsbio) werd gebruikt om kernen te kleuren. De secties werden gemonteerd met 50% glycerol. Tenslotte werden de secties bekeken en gefotografeerd met behulp van een Olympus bx51 (Japan) fluorescentiemicroscoop. De antilichamen die in onze studie worden gebruikt werden wijd gebruikt in onze vorige studies en door andere onderzoekers , en de gevoeligheid en specificiteit van deze antilichamen zijn bevestigd.

2.4. Western Blot

de cortex, hippocampus en thalamus werden verzameld bij c57bl/6 muizen van 1 maand, 3 maanden, 6 maanden, 9 maanden en 12 maanden oud. De monsters werden gehomogeniseerd in RIPA buffer, en de concentratie van de eiwitmonsters werd gemeten door BCA eiwit Assay Kit (Pierce Biotechnologie, VS). De eiwitmonsters werden gescheiden door 10% SDS-PAGE (SDS-PAGE Gel kit, CW0022S, China) en elektrisch overgebracht naar polyvinylideendifluoride (PVDF) membranen. De componenten van de SDS-PAGE Gelkit omvatten een 30% Acr-Bis, SDS-PAGE Scheidingsgelbuffer, SDS-PAGE Stapelgelbuffer, APS (ammoniumpersulfaat) en TEMED (N, N, N’, N’-tetramethylethyleendiamine). Vervolgens werden de membranen geblokkeerd in 5% magere droge melk verdund in tbst (TBS met 0,05% Tween 20) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en vervolgens geïncubeerd met specifieke primaire antilichamen: muis anti-GFAP antilichaam (#3670, 1:1000, Cell Signaling Technology); konijn anti-NDRG2 antilichaam (#5667, 1:1000, Cell Signaling Technology); konijn anti-S100ß antilichaam (#2017-1, 1:1000, Epitomics); en konijn anti-GAPDH-antilichaam (#5174, 1:1000, Cell Signaling Technology) en overnachting in het 4°C. De membranen werden vervolgens geïncubeerd met een HRP-geconjugeerd secundaire anti-konijn anti-muis-antilichaam (Thermo Scientific, USA) voor 2 uur. Chemoluminescente signalen werden ontwikkeld met behulp van Western Lightning-Chemiluminescentie-Reagens Plus (PerkinElmer Life Sciences; Wellesley, MA) en gedetecteerd door een image analyzer LI-COR Odyssey systeem (LI-Cor Biotechnologie, USA). De immunoreactiviteit van eiwitbanden werd kwantitatief geanalyseerd door Bio-Rad® Image Lab™ software. Banddichtheidswaarden werden genormaliseerd naar GAPDH.

2.5. Kwantitatieve (Real-Time) polymerasekettingreactie (Real-Time PCR)

de cortex, hippocampus en thalamus werden verzameld bij c57bl/6 muizen in de leeftijd van 1 maand, 3 maanden, 6 maanden, 9 maanden en 12 maanden. Totaal RNA werd geïsoleerd met behulp van een TransZol Up Plus RNA Kit (Code nr. ER501-01, Transgen, China) en gekwantificeerd met behulp van een NanoDrop 2000. Vervolgens werd 1000 ng totaal RNA omgekeerd getranscribeerd in een reactie van 20 µL bij 42°C gedurende 15 min, gevolgd door 85°C gedurende 5 sec met behulp van een TransScript® All-in-One First-Strand cDNA synthese SuperMix voor qPCR (Code nr. AT341, Transgen, China). De componenten van de kit omvatten een 5×TransScript® All-in-One SuperMix voor qPCR (TransScript® RT, Rnaseremmer, Anchored Oligo(DT)18 Primer, Random Primer(N9), dNTPs, buffer), een 5×TransScript® All-In-One No-RT Control SuperMix voor qPCR, een gDNA Remover en een RNase-vrij water. De 5 × TransScript ® All-In-One No-RT Control SuperMix voor qPCR werd gebruikt als een negatieve controle. Realtime PCR werd uitgevoerd in een reactie van 20 µL volgens de manual for TransStart Tip Green qRNA SuperMix (Code nr. AQ141, Transgen, China). De gebruikte mRNA-inleidingssequenties zijn te vinden in Tabel 1. De reactie werd uitgevoerd bij 94°C gedurende 30 sec, gevolgd door 40 cycli van 94°C gedurende 5 sec, 60°C gedurende 15 sec en 72°C gedurende 19 sec op het ViiA7 Real-Time PCR-detectiesysteem (2720 Thermal Cycler, Applied Biosystems). De inleidingen en opeenvolgingen die van de relatieve mRNA uitdrukking worden afgeleid werden geanalyseerd gebruikend de formule .

2.6. Statistische analyse

statistische tests werden uitgevoerd met behulp van PRISM v7. 0 software (GraphPad). Vergelijkingen tussen twee groepen werden uitgevoerd met behulp van Student T-tests. Vergelijkingen tussen verschillende groepen werden uitgevoerd met behulp van one-way ANOVA met Tukey ‘ s posttest. Alle waarden werden gepresenteerd als het gemiddelde ± SD. Waarden van p<0,05 werden statistisch significant geacht.

3. Resultaten

3.1. De verdeling van astrocyten gelabeld door NDRG2, GFAP en S100ß in verschillende cerebrale gebieden

de gebieden van de muizen cerebra werden geïdentificeerd door het labelen van de celkernen. Daarnaast werd een overeenkomstige muis hersenen atlas gebruikt om de specifieke gebieden geanalyseerd te controleren (figuur 1). We gebruikten vervolgens immunofluorescentie kleuring om de distributie van astrocyten geëtiketteerd door NDRG2, GFAP, en S100ß in verschillende cerebrale regio ‘ s van volwassen mannelijke muizen leeftijd 6 maanden te detecteren. NDRG2-en S100ß-positieve astrocyten waren overvloediger en gelijkmatiger verdeeld dan GFAP-positieve astrocyten over het hele cerebrum (Figuur 2). NDRG2-positieve astrocyten waren geconcentreerd in de dorsale cortex (Regio 1) en thalamus (Regio 5), maar minder in de hippocampus (Regio 4), corpus callosum (Regio 3), en ventrale cortex (Regio 2) en de minste in de cerebrale Steel (Regio 6) (figuur 2(A) en 2(b)). GFAP-positieve astrocyten waren het meest geconcentreerd in hippocampus; minder werden gedetecteerd in het corpus callosum en de cerebrale steel en bijna niet detecteerbaar in de dorsale cortex, ventrale cortex en thalamus (Figuur 2(a) en 2(c)). S100ß – positieve astrocyten waren het meest geconcentreerd in de dorsale cortex en thalamus, minder in de hippocampus en ventrale cortex, en het minst in de cerebrale steel en corpus callosum (figuren 2(b) en 2(c)). De verdeling van de ndrg2-positieve astrocyten was vergelijkbaar met die van de S100ß-positieve astrocyten.

(a)

b)

(a)
b)

Figuur 1

De anatomische regio ‘ s van de muizen hersenen. (a) representatieve immunofluorescentiebeelden van de door DAPI geëtiketteerde cellen in het cerebrum van de mannelijke muizen. Schaalbalken = 500 µm. b) De anatomische atlas van de muis cerebrum. Regio 1: dorsale cortex; Regio 2: ventrale cortex; Regio 3: corpus callosum; Regio 4: hippocampus; Regio 5: thalamus; Region 6: cerebral peduncle.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figure 2

The distribution of astrocytes labeled by NDRG2, GFAP and S100β throughout the cerebrum. Representatieve immunofluorescentie beelden van astrocyten geëtiketteerd door GFAP en NDRG2 (a), S100ß, en NDRG2 (b), GFAP en S100ß (c) in de hersenen van de volwassen mannelijke muizen (6 maanden) bij lage vergroting. Regio 1: dorsale cortex; Regio 2: ventrale cortex; Regio 3: corpus callosum; Regio 4: hippocampus; Regio 5: thalamus; Regio 6: cerebrale Steel. n = 6. Schaalbalken = 500 µm.

astrocyten in verschillende cerebrale regio ‘ s vertoonden ongrijpbare immunoreactiviteitenvoor NDRG2, GFAP en S100ß (Figuur 2). Astrocyten in de dorsale cortex en thalamus reageerden sterk op NDRG2, en S100ß, maar zwak op GFAP. Astrocyten in de hippocampus reageerden sterk op GFAP en matig op NDRG2 en S100ß. Astrocyten in de ventrale cortex, corpus callosum en cerebrale Steel reageerden zwak tot matig op NDRG2, GFAP en S100ß (Tabel 2).

de verdeling van astrocyten gelabeld door NDRG2, GFAP en S100ß in verschillende cerebrale gebieden van mannelijke muizen was vergelijkbaar met die van oude mannelijke muizen (12 maanden) (Figuur 3).

Figuur 3

de verdeling van astrocyten gelabeld door NDRG2, GFAP en S100ß in het cerebrum. Representatieve immunofluorescentie beelden van astrocyten geëtiketteerd door NDRG2, GFAP, en S100ß in de cerebrum van de oude mannelijke muizen (12 maanden) en de negatieve controle. Schaalbalken = 500 µm.

3.2. De morfologieën van astrocyten gelabeld met NDRG2, GFAP en S100ß in verschillende cerebrale regio ‘ s

astrocyten zijn voornamelijk verdeeld in twee typen: vezelige astrocyten in witte materie en protoplasmatische astrocyten in grijze materie. Daarom vergeleken we de morfologieën van de twee typen gelabeld door verschillende markers in het corpus callosum (witte stof, Regio 3) en de hippocampus (grijze stof, Regio 4) (Figuur 4). De resultaten van volwassen mannelijke muizen (6 maanden) toonden de ndrg2-en s100ß-positieve astrocyten presenteerde een stellate vorm gekenmerkt door grote en ronde soma samen met korte en grove cytoplasmatische processen die weinig takken had. De GFAP-positieve astrocyten gepresenteerd met een radiale vorm gekenmerkt door kleine soma, lange processen, en multibranches (Figuur 4). Bovendien werden in het corpus callosum en de cerebrale steel de door GFAP geëtiketteerde astrocyten gekenmerkt met meer overvloedige langere processen dan de door NDRG2 en S100ß geëtiketteerde processen (figuren 5 en 7).

Figuur 4

de morfologie van astrocyten gelabeld door NDRG2, GFAP en S100ß in verschillende cerebrale regio ‘ s. Representatieve immunofluorescentie beelden van astrocyten geëtiketteerd door NDRG2, GFAP, en S100ß in de hersenen van de volwassen mannelijke muizen (6 maanden) bij hoge vergroting. Regio: corpus callosum; Regio 4: hippocampus. Schaalbalken = 10 µm.

Figuur 5

de colokalisatie van NDRG2 en GFAP binnen astrocyten in verschillende cerebrale regio ‘ s. Representatieve immunofluorescentiebeelden van astrocyten geëtiketteerd door NDRG2 en GFAP in het cerebrum van de volwassen mannelijke muizen (6 maanden). Regio 1: dorsale cortex; Regio 2: ventrale cortex; Regio 3: corpus callosum; Regio 4: hippocampus; Regio 5: thalamus; Regio 6: cerebrale Steel. Schaalbalken = 10 µm.

3.3. De Colokalisatie van NDRG2, GFAP en S100ß binnen astrocyten in verschillende cerebrale gebieden

NDRG2 was bijna colokaliseerd met GFAP in astrocyten van de ventrale cortex, corpus callosum en cerebrale steel, en meestal colokaliseerd met GFAP in astrocyten van de hippocampus (figuren 5 en 8(a)). NDRG2 had bijna geen colokalisatie met GFAP in astrocyten van de dorsale cortex en thalamus (Figuur 5). NDRG2 en S100ß presenteerden bijna volledige colokalisatie in astrocyten van de zes cerebrale gebieden (figuren 6 en 8(b)). GFAP en S100ß gepresenteerd met significante colokalisatie in astrocyten van de ventrale cortex, corpus callosum, en cerebrale steel en bijna volledige colokalisatie in astrocyten van de hippocampus (Figuur 7). GFAP en S100ß hadden bijna geen colokalisatie in astrocyten van de dorsale cortex en thalamus (Figuur 7).

Figuur 6

de colokalisatie van ndrg2 en S100ß binnen astrocyten in verschillende cerebrale regio ‘ s. Representatieve immunofluorescentie beelden van astrocyten gelabeld door NDRG2 en S100ß in de hersenen van de volwassen mannelijke muizen (6 maanden). Regio 1: dorsale cortex; Regio 2: ventrale cortex; Regio 3: corpus callosum; Regio 4: hippocampus; Regio 5: thalamus; Regio 6: cerebrale Steel. Schaalbalken = 10 µm.

Figuur 7

de colokalisatie van GFAP en S100ß binnen astrocyten in verschillende cerebrale regio ‘ s. Representatieve immunofluorescentie beelden van astrocyten geëtiketteerd door GFAP en S100ß in de hersenen van de volwassen mannelijke muizen (6 maanden). Regio 1: dorsale cortex; Regio 2: ventrale cortex; Regio 3: corpus callosum; Regio 4: hippocampus; Regio 5: thalamus; Regio 6: cerebrale Steel. Schaalbalken = 10 µm.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

Figure 8

The colocalization and protein expression of NDRG2, GFAP, en S100ß in verschillende cerebrale regio ‘ s. (a) – (b) de kwantitatieve analyse van ndrg2+/GFAP+ astrocyten en NDRG2+/S100ß+ astrocyten. De resultaten werden gepresenteerd als de gemiddelde ± SD. Cellen in vijf velden werden geteld. (c) – (e) de expressie niveaus van ndrg2, GFAP, en s100ß eiwitten in cortex, hippocampus en thalamus van de volwassen mannelijke muizen (6 maanden) werden bepaald door Western blot analyse. Representatieve vlekken en kwantitatieve analyse werden getoond. De resultaten werden gepresenteerd als de gemiddelde ± SD en geanalyseerd door eenrichtingsanova met Tukey ‘ s posttesten. n = 6. p<0.P<0,01, en p<0,001.

We ontdekten ook colokalisatie van ndrg2 en een andere astrocytische maker, glutamine synthetase (GS), in astrocyten van de muizen cerebrum. NDRG2 en GS hadden significante colokalisatie in astrocyten (figuur s1a). NDRG2 en GS presenteerden grondige colokalisatie in vezelige astrocyten van het corpus callosum en in protoplasmatische astrocyten van de hippocampus (figuur s1b). Ndrg2 eiwitexpressie in de neuronale cellijn HT22 cellen, oligodendrogliale cellijn OLN-93 cellen, en astrocytische cellijn MA1800-57 cellen werden ook gedetecteerd (figuur s2). NDRG2 eiwit werd gedetecteerd in MA1800-57 cellen en werd nauwelijks gedetecteerd in HT22 cellen en OLN-93 cellen (figuren s2a en s2b).

3.4. De expressie van Ndrg2 -, GFAP-en S100ß-eiwitten in verschillende cerebrale regio ‘s

We gebruikten western blotting om de expressieniveaus van ndrg2 -, GFAP-en S100ß-eiwitten te detecteren in drie cerebrale regio’ s van volwassen mannelijke muizen (6 maanden): de cortex, hippocampus en thalamus (Figuur 8(c)). We analyseerden de expressieniveaus van deze markers in dezelfde cerebrale regio(Figuur 8 (d)). In de cortex was het niveau van ndrg2-expressie aanzienlijk hoger dan GFAP-en s100ß-expressieniveaus (p<0,001, p<0,05). Het expressieniveau van S100ß was ook veel hoger dan GFAP (p<0,05). In de hippocampus was het GFAP-expressieniveau hoger dan NDRG2 en S100ß (p<0.01), en het niveau van de ndrg2-expressie was iets minder dan het s100ß-expressieniveau, hoewel het verschil statistisch niet significant was. In de thalamus was het expressieniveau van S100ß significant hoger dan GFAP-en ndrg2-expressieniveaus (p<0,01), terwijl het niveau van NDRG2-expressie vergelijkbaar was met dat van GFAP.

vervolgens analyseerden we de expressieniveaus van dezelfde marker in verschillende cerebrale gebieden (Figuur 8(e)). Het niveau van ndrg2-expressie in de cortex was veel hoger dan in de hippocampus en thalamus (p<0,01), en er werd geen significant verschil waargenomen tussen de hippocampus en thalamus. Het niveau van GFAP-expressie in de hippocampus was het hoogste van de drie regio ‘ s (p<0,001, p<0,01); er werd geen significant verschil waargenomen tussen de cortex en de thalamus. Het niveau van s100ß expressie in de thalamus was significant hoger dan in de cortex en hippocampus (p<0.01), waarbij geen significant verschil werd waargenomen tussen de laatste twee.

we hebben ook de eiwitspiegels van NDRG2, GFAP en S100ß in de cortex, hippocampus en thalamus van mannelijke muizen van 1 maand, 3 maanden, 6 maanden, 9 maanden en 12 maanden gevonden (figuren 9(a) – 9(f)). De eiwitspiegels van NDRG2 en GFAP in de cortex, hippocampus en thalamus namen geleidelijk toe met de leeftijd (p<0,05, p<0,01). Eiwitspiegels van S100ß in de cortex en de thalamus, maar niet in de hippocampus, namen geleidelijk toe met de leeftijd (p<0.05, p<0,01, p<0,001). De mRNA-spiegels van NDRG2, GFAP en S100ß in de cortex, hippocampus en thalamus van mannelijke muizen van 1 maand, 3 maanden, 6 maanden, 9 maanden en 12 maanden waren consistent met die van de eiwitspiegels (p<0,05, p<0,01, figuren 9(g)-9(i)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(i)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)

Figure 9

The expression of NDRG2, GFAP, and S100β in different cerebral regions of different aged male mice. (a)-(f). De niveaus van ndrg2, GFAP, en s100ß proteã ne in cortex, hippocampus, en thalamus van de mannelijke muizen oud 1 maand, 3 maanden, 6 maanden, 9 maanden, en 12 maanden werden bepaald door Westelijke vlekanalyse. Representatieve vlekken en kwantitatieve analyse werden getoond. (g) – (i) de niveaus van ndrg2, GFAP en s100ß mRNA in cortex, hippocampus en thalamus van de mannelijke muizen van 1 maand, 3 maanden, 6 maanden, 9 maanden en 12 maanden werden bepaald door qPCR-analyse. De kwantitatieve analyse werd getoond. Het gemiddelde van 1 maand werd gestandaardiseerd op 1. De resultaten werden gepresenteerd als de gemiddelde ± SD en geanalyseerd door de T-tests van de Student. n = 6. p<0,05, p<0,01, en p<0,001. 1 m = 1 maand; 3 m = 3 maanden; 6 m = 6 maanden; 9 m = 9 maanden; 12 m = 12 maanden.

4. Discussie

In deze studie vonden we dat astrocyten gelabeld door NDRG2 en S100ß breder en uniformer werden verspreid dan die gelabeld door GFAP in het hele cerebrum van jonge, volwassen en oude muizen. Dit suggereert dat NDGR2 en S100ß meer geschikte markers zijn om de totale verdeling en het aantal veranderingen van astrocyten waar te nemen. Bovendien toonden onze resultaten aan dat astrocyten in verschillende cerebrale gebieden verschillende niveaus van immunoreactiviteit aan ndrg2, GFAP, en S100ß presenteerden, wat suggereert dat, in de cortex en thalamus, NDRG2 en S100ß geschikter astrocytische markers zijn dan GFAP. De ongrijpbare immunoreactiviteit van astrocyten aan NDRG2, GFAP, en S100ß kan ook toe te schrijven zijn aan de gevoeligheid en specificiteit van de antilichamen die wij gebruikten. Bovendien, waren de morfologieën van astrocytes die door NDRG2 en S100ß worden geëtiketteerd gelijkaardig aan elkaar, maar duidelijk verschillend van die die door GFAP worden geëtiketteerd omdat deze tellers verschillende cytoskeletal structuren etiketteerden. NDRG2 kleurt het cytoplasma en de celmembranen en kleurt zwak de kern . GFAP kleurt hoofdzakelijk soma en processen, maar niet de kern, terwijl S100ß kleurt de kern en een deel van het cytoplasma en processen . Door de morfologieën van astrocyten te vergelijken die door NDRG2, GFAP, en S100ß worden geëtiketteerd, vonden wij dat GFAP een geschiktere marker voor astrocyten in het corpus callosum, cerebrale steel, en vooral de hippocampus was. De proteã nen NDRG2 en S100ß werden het meest uitgedrukt in de cortex en thalamus, respectievelijk. We concluderen dat NDRG2 geschikter is voor astrocyten in de cortex, terwijl S100ß geschikter is voor astrocyten in thalamus bij het kwantificeren van astrocytische dichtheid. De verschillende eiwituitdrukkingspatronen van NDRG2, GFAP, en S100ß in de cortex, hippocampus, en thalamus bevestigden astrocytic functionele heterogeniteit.

astrocyten spelen een belangrijke rol in de instandhouding van de homeostase, en ze nemen actief deel aan bijna alle neurologische aandoeningen, zoals ischemische beroertes, traumatische cerebrale letsels, de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson . Er is aangetoond dat astrocytische morfologie, genexpressie en functie verschilden tussen verschillende gebieden van het cerebrum . Fibreus astrocyten en protoplasmic astrocyten zijn twee belangrijke subpopulaties geïdentificeerd door hun morfologie . Vezelige astrocyten hebben lange, dunne processen, en een ster-achtige verschijning, terwijl de protoplasmatische hebben tal van fijne processen, die contact en schede synapsen . Interessant, zijn vele genen heterogeen uitgedrukt door deelverzamelingen van astrocyten. Deze genen coderen proteã nen zoals glutamaat transporters en ionenkanalen , evenals glutamaat , dopamine , en opioïdreceptoren .

de heterogeniteit van genexpressie impliceerde de functionele diversiteit van astrocyten. Bijvoorbeeld, het glutamaatbegrijpen verschilt tussen verschillende subsets . Daarnaast verschillen spontane calciumschommelingen tussen verschillende lagen van de somatosensorische cortex. Corticale laag 1 astrocyten toonden frequente asynchrone Ca2 + activiteit, terwijl laag 2/3 astrocyten zelden synchrone Ca2 + activiteit vertoonden . In de cortex reageren astrocyten op glutamaat en noradrenaline met verhogingen van calcium, terwijl hippocampale astrocyten calciumreacties vertonen op ATP, GABA, glutamaat, acetylcholine, prostaglandinen en endocannabinoïden . De Studies hebben ook aangetoond dat de gekweekte astrocyten van verschillende hersenengebieden verschillende capaciteiten hebben om neurietgroei en vertakking te bevorderen . Aangezien astrocyten in verschillende hersengebieden verschillende kenmerken van morfologie en functie presenteren, is het identificeren van de meest geschikte marker voor astrocyten in verschillende cerebrale gebieden cruciaal voor astrocytische onderzoekers.

hoewel verschillende eiwitten zijn gerapporteerd als selectief uitgedrukt door astrocyten, is aangetoond dat geen van deze eiwitten volledig beperkt is tot alle astrocytische subtypes. GFAP, de wijdst gebruikte astrocytic teller, wordt bij voorkeur uitgedrukt in witte kwestie astrocyten over grijze kwestie degenen en slaagt er niet in om alle processen van astrocyten te etiketteren . Belangrijker, zijn er deelverzamelingen van GFAP-negatieve astrocyten die voltage-afhankelijke K+ stromen presenteren, terwijl de GFAP-positieve astrocyten het klassieke patroon van tijd – en voltage-onafhankelijke stromen presenteren .

eerdere studies toonden aan dat s100ß in staat was astrocyten te labelen in zowel grijze als witte materie; het werd echter ook uitgedrukt in enkele oligodendrocyten en neuronen . S100ß werd gevonden om het meest in thalamus astrocyten, een subtype van cellen worden uitgedrukt die in het schoonmaken van DAergic puin deelnemen door de degeneratie van daergic terminals in Ziekte van Parkinson door de aanwezigheid van lysosomes en de vorming van autophagosomes te vergemakkelijken . De transcriptomische analyse van astrocyten identificeerde aldehyde dehydrogenase 1 familie, lid L1 (ALDH1L1), als een astrocytische marker . ALDH1L1 labelde echter ook oligodendrocyten . Evenzo hadden de prikkelende aminozuurtransporters glutamaat / aspartaat transporter (GLAST), glutaminesynthetase (GS), glutamaat transporter-1(GLT-1), vimentin, connexin 43, aquaporin 4 en de celoppervlakte glycoproteïne CD44 ook beperkingen bij het etiketteren van astrocyten .

NDRG2 wordt specifiek uitgedrukt in astrocyten van zowel ratten als muizen en wordt geassocieerd met de groei en rijping van de zich ontwikkelende embryonale hersenen . Naast celproliferatie, differentiatie, en transmembraantransporten, neemt NDRG2 ook in spanningsreacties, depressie, ischemische ziekten, en neurodegenerative wanorde deel . Bij muizen en mensen neemt NDRG2 deel aan de ontwikkeling van attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD), een ziekte die geassocieerd wordt met het Bewegingscentrum in de hersenschors . Flugge et al. ontdekte de expressie van NDRG2 in de cerebrums van mensen, marmosets, boomspitsmuizen, ratten en muizen, en suggereerde dat NDRG2 een nieuwe astrocytische marker was, vooral voor volwassen, niet-reactieve en niet-prolifererende astrocyten . In deze studie ontdekten we eerst het distributiepatroon van ndrg2-positieve astrocyten in verschillende cerebrale regio ‘ s en verschillen met de astrocyten gelabeld door klassieke markers GFAP en S100ß.

astrocyten en astrocytische markers veranderden tijdens normale hersenveroudering. Het vorige werk heeft aangetoond dat astrocytes vroeg in het verouderen worden geactiveerd, en de significante verhoging van GFAP-positieve astrocytes werd gevonden in de hippocampalgebieden van oude muizen . De niveaus van zowel GFAP proteã ne als GFAP mRNA stegen in diverse delen van het verouderen hersenen, zoals de hersenschors, hippocampus, en cerebellum . Discrepanties blijven tussen verschillende rapporten van S100ß in de verouderende hersenen . In toenemende mate hebben studies aangetoond dat NDRG2 wordt geassocieerd met leeftijdsgebonden aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer. In onze studie, stegen de niveaus van GFAP en ndrg2 mRNA in de cortex, hippocampus, en thalamus geleidelijk met leeftijd, terwijl de niveaus van s100ß mRNA in de hippocampus en thalamus met leeftijd, maar niet in de cortex stegen.

we dienen op te merken dat op dit moment veel markers naast de markers die we hebben getest, zoals ALDH1L1, GLAST, GLT-1, CD44 en vimentin, worden gebruikt om astrocyten te labelen. In onze studie, we alleen vergeleken de klassieke cerebrale astrocyten geëtiketteerd door de nieuwe voorgestelde marker NDRG2 en de meest gebruikte markers: GFAP, S100ß, en GS in de cerebrum.tot slot geeft onze studie aan dat ndrg2 en S100ß meer geschikte markers zijn voor astrocyten in respectievelijk de cortex en de thalamus, evenals voor het observeren van de totale verdeling en veranderingen in het aantal astrocyten in het cerebrum. Ondertussen is GFAP superieur aan NDRG2 en S100ß bij het labelen van de processen en takken van astrocyten in het corpus callosum, cerebrale steel, en vooral de hippocampus. Onze studie toont het belang van het kiezen van de meest geschikte marker voor astrocyten in verschillende muis cerebrale gebieden, die begeleiding biedt voor neurowetenschappers bij het verkennen van astrocytische functies.

beschikbaarheid van gegevens

de gegevens die worden gebruikt ter ondersteuning van de bevindingen van deze studie zijn opgenomen in het artikel.

Disclosure

Zengli Zhang en Zhi Ma zijn de co-eerste auteurs.

belangenconflicten

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.

bijdragen van auteurs

Zengli Zhang en Zhi Ma droegen eveneens bij aan deze studie.

Licentie

Dit werk werd ondersteund door de Beijing Natural Science Foundation (nr. 7194321 te Lixia Zhang), de National Natural Science Foundation of China (nr. 81801138 te Yulong Ma, nr. 81771206 te Wangyuan Zou), de Jonge Geleerde Onderzoek te Verlenen van de Chinese Anesthesist Association (nr. 21700001 te Yulong Ma), de Miaopu Stichting van de Chinese PLA Algemeen Ziekenhuis (nr. 18KMM47 aan Lixia Zhang), en de Beijing Municipal Science & Technology Commission (nr. 1811000017180022 aan Hang Guo).

aanvullend materiaal

aanvullend figuur 1. De colokalisatie van NDRG2 en GS binnen astrocyten. Aanvullend Figuur 2. De expressie van ndrg2 eiwit in cellijnen. (Aanvullende materialen)