Diverse motiefensembles specificeren niet-redundante DNA-bindingsactiviteiten van Ap-1-familieleden in macrofagen

statistische analyses

in Fig. 1c, verschillen in genexpressie werd getest met behulp van de onafhankelijke t-test (graad van vrijheid = 1, two-tailed) op twee replicate experimenten (n = 2). Differentieel uitgedrukte genen in Fig. 1b werden geïdentificeerd met EdgeR55 met standaardparameters, en met behulp van de cut offs FDR < 0.05-en log2-voudige verandering ≥2. In Fig. 2c, verschillen tussen elke groep (Veh, gedeeld, en KLA 1 h) werden onderzocht met behulp van onafhankelijke T-test (graad van vrijheid = 1, twee-tailed); het aantal loci in elke groep voor elk monomeer zijn als volgt ATF3 (Veh = 1447, gedeeld = 7460, KLA = 6997), Jun (2390, 3751, 3401), JunD (1351, 5976, 6422). Betekenis voor motieven in Fig. 4a werd berekend aan de hand van de waarschijnlijkheidsratio-test (graad van vrijheid = 1), waarbij de voorspellingen van het volledige TBA-model en het verstoorde TBA-model werden vergeleken op alle loci gebonden in met Veh behandelde macrofagen voor Atf3 (n = 23.160), Jun (n = 15.548) en JunD (n = 19.653). Betekenis voor motieven in aanvullende Fig. 4C werd berekend aan de hand van de waarschijnlijkheidsratio-test (graad van vrijheid = 1), waarbij de voorspellingen van het volledige TBA-model werden vergeleken met het verstoorde TBA-model op alle door JunD gebonden plaatsen in GM12878 (n = 7451), H1-hESC (n = 12.931), HepG2 (n = 41.318), K562 (n = 47.477) en SK-n-SH (38.960). Betekenis voor motieven in Fig. 5b, aanvullende Fig. 5B, en aanvullende Fig. 5C werd berekend aan de hand van de waarschijnlijkheidsratio-test (graad van vrijheid = 1) waarbij de voorspellingen van het volledige TBA-model werden vergeleken met het verstoorde TBA-model op alle loci gebonden in met KLA behandelde macrofagen voor Atf3 (n = 36.745), Jun (n = 17.481), JunD (n = 31.641), Fos (n = 24.365), Fosl2 (n = 10.619) en JunB (n = 13.376). Significantiewaarden voor Fig. 6f en S6F werden berekend met behulp van de F-test; het aantal geanalyseerde loci voor monomeren in met Vehiculum behandelde macrofagen zijn ATF3 (n = 4163), Jun (n = 3004) en JunD (n = 4148); het aantal geanalyseerde loci voor monomeren in met KLA behandelde macrofagen zijn: Atf3 (n = 4577), Jun (n = 3232), JunD (n = 4366), Fos (n = 4477) en JunB (n = 3616).

genereren van aangepast genoom voor BALB / cJ

een aangepast genoom voor BALB / cJ door invariante posities van het mm10 genoom te vervangen door allelen gerapporteerd door het Mouse genomen Project (versie 3 VCF bestand)43. Voor C57BL / 6J werd het mm10-verwijzingsgenoom van de UCSC-genoombrowser gebruikt. Om vergelijkingen tussen BALB/cJ en C57BL/6J tijdens analyse toe te staan, werden de Coördinaten voor het aangepaste genoom voor BALB/cJ verschoven om de posities van het mm10-verwijzingsgenoom aan te passen gebruikend MARGE34. We hebben geen reads geanalyseerd die binnen schrappingen in BALB/cJ vielen. Leest dat overlapt met een insertie werden toegewezen aan de laatste overlappende positie in de referentiestam.

analyse van ChIP-seq pieken

sequencing reads van ChIP-seq experimenten werden in kaart gebracht aan de mm10 assemblage van het muis referentie genoom (of het balbc/J custom genoom) met behulp van de nieuwste versie van Bowtie2 met standaard parameters56. In kaart gebrachte Spaander-seq leest om vermeende TF bindende plaatsen met homer57 findPeaks bevel (met parameters-grootte 200-L 0-C 0-fdr 0.9) te identificeren, gebruikend het experiment van de inputspaander dat aan de behandelingsvoorwaarde overeenkomt. Om het aantal foutpositieve pieken te verminderen, berekenden we de IDR bij elke piek (met behulp van versie 2.0.3 van het idr-programma) met de HOMER-piekscore berekend voor elk replicaatexperiment als input voor IDR en vervolgens gefilterd alle pieken die IDR ≥ 0,0558 hadden. De novo motieven werden berekend met de Homerus findMotifsGenome.pl commando met standaard parameters. Verrijking van de novo motieven werd berekend met behulp van de findKnownMotifs.pl programma in HOMER met standaard parameters.

kwantificering van RNA expressie reads gegenereerd uit RNA-seq experimenten werden uitgelijnd op het mm10 muis referentie genoom (of het balbc / J custom genoom) met behulp van STAR aligner met standaard parameters59. Om het expressieniveau van elk gen te kwantificeren, berekenden we de RPKM met de reads die binnen een exon waren. Niet-genormaliseerde sequencing reads werden gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte genen met EdgeR55 te identificeren; we beschouwden genen met FDR < 0,05 en een verandering in expressie tussen twee experimentele voorwaarden twee keer of meer differentieel tot expressie gebracht. Om de uitdrukking van ontluikende RNAs te kwantificeren annoteerden wij onze Spaander-seq pieken met het aantal GRO-seq leest (genormaliseerd aan 10 miljoen) die binnen 500 bps van het piekcentrum waren gebruikend Homerus annotatePeaks.pl Commando.

TBA model training

voor elk Ap-1 monomeer onder elke behandelingsvoorwaarde hebben we een model getraind om bindingsplaatsen voor elk monomeer te onderscheiden van een set willekeurig geselecteerde genomische loci. De set willekeurige achtergrondloci die wordt gebruikt om elk model te trainen, is geselecteerd volgens de volgende criteria: (1) de GC-inhoudsverdeling van de achtergrondloci komt overeen met de GC-inhoud van de bindingsplaatsen voor een bepaald monomeer, (2) bevat geen ambigue of niet-aanpasbare posities, en (3) het aantal achtergrondvolgorde komt overeen met het aantal bindingsplaatsen k. Voor elk van de sequenties in de gecombineerde set van de bindingsplaatsen en achtergrondloci, berekenden we de hoogste log-odds score (ook wel motif score genoemd) voor elk van de n motieven die zullen worden opgenomen in de Model60 Motif matches in beide oriëntaties werden beschouwd. Log-odds scores minder dan 0 werden ingesteld op 0. Per standaard voorbewerkingsprocedures voorafgaand aan het trainen van een lineair model, hebben we de log-odds scores voor elk motief gestandaardiseerd, waarbij we de set scores voor elk motief schalen zodat de gemiddelde waarde 0 is en de variantie 1. Standaardisatie schaalt de scores voor alle motieven naar hetzelfde bereik (langere motieven hebben een grotere maximale score) en helpt ook om het effect van multi-collineariteit op de modeltraining te verminderen. En dus, de functies die worden gebruikt voor de training van ons model is een n door 2k matrix van log-odds scores gestandaardiseerd over elke rij. Om de overeenkomstige reeks labels te genereren, hebben we elke bindwebsite een label van 1 toegewezen en elke achtergrondloci een label van 0. Met behulp van deze functie matrix, en label array, we getraind gewichten voor elk motief met behulp van een L1 bestraft logistieke regressie model zoals geïmplementeerd door de sikit-learn Python package61. Motiefgewichten die in onze Analyse worden getoond, zijn de gemiddelde waarden over vijf ronden van cross-validatie, waarbij 80% van de gegevens wordt gebruikt voor training en 20% voor testen in elke ronde. Modellen werden getraind voor ChIP-seq ‘ s die in deze studie werden gegenereerd, evenals gegevens die werden gedownload van de NCBI genexpressie omnibus (toetredingsnummer GSE46494) en het ENCODE data portal (https://www.encodeproject.org).

kwantificering van meervoudige collineariteit

om de mate van multi-collineariteit in de motif score kenmerken te beoordelen die we gebruikten om onze modellen te trainen, namen we elke feature matrix die overeenkomt met elk experiment en berekenden we de VIF voor elk motief 38. Om de VIF te berekenen, bepalen we eerst de determinatiecoëfficiënt, R2, voor elk motief door de log-odds scores voor een motief te regrimeren tegen de log-odds scores van de resterende motieven. Vervolgens kan met behulp van de determinatiecoëfficiënt de tolerantie voor elk motief worden berekend als het verschil tussen 1 en de determinatiecoëfficiënt (1 − R2). De VIF is de reciproque van de tolerantie \(\frac{1}{{1-r^2}}\). We gebruikten de linear_model module van sklearn Python pakket om de determinatiecoëfficiënt te berekenen.

motief clustering en samenvoeging

we scoorden de gelijkenis van alle paren van DNA-sequentiemotieven door de Pearson-correlatie van de aligned position probability matrices (PPMs) te berekenen die overeenkomen met een gegeven paar motieven 62. De Pearson correlatie voor een paar van de motieven A en B van lengte i wordt berekend met de formule:

PPMs werden voor het eerst uitgelijnd met behulp van de Smith–Waterman uitlijning algorithm63. Kortere motieven zijn opgevuld met achtergrondfrequentiewaarden voorafgaand aan de uitlijning. Gaten in de uitlijning waren niet toegestaan en elke positie in de uitlijning werd gescoord met de Pearson correlatie. De Pearson correlatie werd vervolgens berekend met behulp van de optimale uitlijning. Vervolgens werden reeksen motieven die PPMs met een Pearson correlatie van 0.9 of hoger hebben samengevoegd door iteratief elke PPM binnen de reeks uit te lijnen, en dan de nucleotidefrequenties bij elke positie te Gemiddelde.

de significantie van motieven voor TBA

p-waarden voor TBA werden berekend met behulp van de log-likelihood ratio test. Elk motief werd verwijderd uit de reeks functies die worden gebruikt om een verstoord TBA-model te trainen (met behulp van vijf-voudige kruisvalidatie). Vervolgens gebruikten we het volledige model (met alle motieven) en het perturbed model om de waarschijnlijkheid te berekenen van het waarnemen van binding op alle bindingsplaatsen en achtergrondsequenties voor een gegeven monomeer en alle achtergrondgebieden. Het verschil in de waarschijnlijkheid berekend door het volledige model en het verstoord model werd vervolgens gebruikt om de chi-kwadraat test uit te voeren voor elk motief. De chi-kwadraat test werd uitgevoerd met behulp van de scipy python package64.

vergelijking met andere methoden

BaMM motief en GKM-SVM werden beide uitgevoerd met standaard parameters. We gebruikten de nieuwste versie van de grotere schaal gkm-SVM, LS-GKM (gecompileerd van broncode gedownload van https://github.com/Dongwon-Lee/lsgkm op 8/25/16), en BaMM motief; v1.0 gedownload van https://github.com/soedinglab/BaMMmotif39,65. Beide modellen werden getraind met vijfvoudige kruisvalidatie. Modelprestaties werden gescoord met behulp van roc_auc_score en precision_score functies van de metrics module van sklearn.

voorspellen van veranderingen in Ap-1 binding na één uur KLA behandeling

om de verandering in binding na KLA behandeling te voorspellen, maakten we gebruik van de gewichten van het motief geleerd voor elk van de n motieven (wn) door een TBA model getraind op de Vehicle-treated data (Wveh = ) en een TBA model getraind op de 1-H KLA treated data (Wkla = ) voor elk Ap-1 monomeer. De voorspelde verandering in binding voor elke reeks is dan het verschil tussen het puntproduct van de gestandaardiseerde motiefscores berekend voor de reeks elk van de k−bindingsplaatsen (Sk = ) met de KLA − motiefgewichten en het puntproduct van de motiefscores en de Veh-motiefgewichten (Δkla-veh,k = Wkla Sk Sk-Wveh Sk Sk). Voorspellingen werden gedaan voor alle genomic loci die met een piek voor één van de AP-1 monomeren in of het voertuig of KLA behandelingsvoorwaarde kruisten.

Voorspellen van stam-specifieke binding met TBA

om Te voorspellen stam-specifieke binding, we leveraged het motief gewichten geleerd voor elk van de n motieven (wn) door een TBA-model (W = ) voor elk van de AP-1 monomeer met de C57BL/6J gegevens, en het motief scores berekend voor elk van de k bindingsplaatsen met behulp van de genomische sequentie voor C57BL/6J en BALBc/J (SC57,k)= , SBAL,k)= ). Vervolgens berekenden we het verschil van de motiefscores voor C57bl6/J en BALBc/J (Dn = ) en standaardiseerden we vervolgens de scoreverschillen voor elk motief over alle K-bindingsplaatsen die een mutatie hadden bij het vergelijken van BALBc/J met C57BL/6J, wat gestandaardiseerde motiefscoreverschillen oplevert voor elke bindingsplaats (Zn = standaardiseren(Dn) = ). Tenslotte maakten we een voorspelling voor stamspecifieke binding door het dotproduct van de motiefgewichten en het gestandaardiseerde verschil van de motiefscores tussen C57BL6/EiJ en BALBc/J te berekenen voor de KTH gemuteerde bindingsplaats (ΔC57−BAL = W⋅).

TBA-2Strain model training

Voor elke genetische loci die doorsneden met een piek voor één van de AP-1 monomeren, in C57BL/6J of BALBc/J, berekenden we de hoogste log-odds score voor elk van de n motieven die zullen worden opgenomen in het model, met behulp van de genomische sequentie van beide stammen, waardoor een twee sets van het motief scores voor elk van de k-bindingsplaatsen (SC57,k)= , SBAL,k = ). In beide oriëntaties werd rekening gehouden met het motief. Log-odds scores minder dan 0 werden ingesteld op 0. Met behulp van de motiefscores berekenen we het gestandaardiseerde verschil van de motiefscores over de twee stammen zoals beschreven in de bovenstaande sectie (Zn = ). En dus, de functies die worden gebruikt voor de training van ons model is een n door k matrix van log-odds scores gestandaardiseerd over elke rij. Vervolgens berekenden wij de log2 vouwverhouding van het aantal Spaander-seq leest in C57BL/6J in vergelijking met BALBc/J om de omvang van stam-specifieke band te vertegenwoordigen. Met behulp van deze functie matrix, en het instellen van de log2 vouw Verhouding van binding tussen de twee stammen als de afhankelijke variabele, we getraind gewichten voor elk motief met behulp van lineaire regressie zoals geïmplementeerd door de sikit-learn Python pakket. Motiefgewichten die in onze Analyse worden getoond, zijn de gemiddelde waarden over vijf ronden van cross-validatie, waarbij 80% van de gegevens wordt gebruikt voor training en 20% voor testen in elke ronde. Voorspellingen voor stamspecifieke binding kunnen worden gedaan aan de hand van de berekende gewichten volgens de procedure in de vorige paragraaf.

ChIP protocol

eiwit A en G Dynabeads 50/50 mix van Invitrogen worden opgeroepen voor ChIP (10001D, 10003D). IP mix bestaat uit 20 µL parels / 2 µg antilichaam per 2 miljoen celchip. Antilichamen tegen leden van de AP-1-familie werden gekozen voor het richten van niet-geconserveerde gebieden om het potentieel voor niet-specifieke binding te minimaliseren. Antilichamen zijn vermeld in aanvullende tabel 3. Ter voorbereiding werden parels gewassen met 2 × 0,5% BSA-PBS, vervolgens werden parels-antilichaam geïncubeerd met 0,5% BSA-PBS gedurende ten minste 1 uur op rotator (4 °C). Was 2× met 0.5% BSA-PBS, vervolgens geresuspendeerd in verdunningsbuffer (1% Triton, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7,4), 1× proteaseremmers). Double crosslinking Voor ChIP: Media werd gedecanteerd uit cellen in 10 cm platen, was een keer kort met PBS (RT). Disuccinimidylglutaraat ( Pierce Cat # 20593) (verdund in DMSO bij 200 mM)/PBS (RT) werd gedurende 10 minuten gebruikt. Daarna werd formaldehyde toegevoegd aan een eindconcentratie van 1% gedurende nog eens 10 min. Reactie werd gedoofd met 1: 10 1 m Tris pH 7,4 op ijs. Cellen werden verzameld en gewassen tweemaal met koude PBS, spinnen bij 1000 × g gedurende 5 minuten. Celkernisolatie en-sonicatie: Resuspendeer celkorrels in 1 mL kernisolatiebuffer (50 mM Tris–pH 8,0, 60 mM KCl, 0,5% NP40) + PI en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Centrifugeer 2000 × g gedurende 3 min bij 4 °C. Resuspendeer kernen in 200 µL verse lysisbuffer (0,5% SDS, 10 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 50 mM Tris–HCl (pH 8)) + PI. Sonication: kernen werden vervolgens gesoniceerd (10 miljoen cellen) gedurende 25 minuten in een Biorupter (instellingen = 30 s = aan, 30 s = uit, Medium) met behulp van dunne wandbuizen (Diagenode Cat# C30010010). Na sonication spin Max Snelheid voor 10 min bij 4 °C.: Gesoniceerd DNA werd 5× verdund met 800 Verdunningsbuffer (1% Triton, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7,4), 1× proteaseremmers). Een aliquot wordt verwijderd voor inputmonsters (5%). Monsters op 4 °C tijdens het draaien. Wassen: de ChIP wordt 1× gewassen met TSE I (20 mM Tris–HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA), 2× met TSE III (10 mM Tris–HCl pH 7,4, 250 mM LiCl, 1% IGEPAL, 1% deoxycholaat, 1 mM EDTA), 1× met te + 0,1% Triton X-100, overbrengen naar een nieuwe buis en vervolgens een andere keer wassen met te + 0,1% Triton X-100. Elutie: Elute met 200 µL elution buffer (1% SDS, 10 mM Tris pH 7,5) gedurende 20 minuten bij RT, schudden op de vortex of een nutator of rotator. Ontkoppelen: voeg 10 µL 5 M NaCl toe en incubeer bij 65 °C (of ten minste 8 uur). Reinig monsters met behulp van Zymo ChIP DNA Clean en Concentrator. Elute in 100 µL. Neem 40 µL en ga naar het bibliotheekprotocol.

Polya RNA isolatie en fragmentatie

RNA isolatie: RNA werd geïsoleerd met behulp van TRIZOL-reagens( Ambion cat # 15596018) en DIRECT-ZOL RNA mini-prep kit (cat# 11-330MB). Poly-a RNA isolatie: Gebruik 0.2 totaal RNA als uitgangsmateriaal voor ideale mapping efficiëntie en minimale clonaliteit. Verzamel 10 µL oligo (DT) (Neb cat# S1419S) parels per RNA-Monster. Kralen werden tweemaal gewassen met 1 × DTBB (20 mM Tris–HCl pH 7,5, 1 m LiCl, 2 mM EDTA, 1% LDS, 0,1% Triton X-100). Parels werden geresuspendeerd in 50 µL van 2× DTBB. 50 µL kralen werden gemengd met 50 µL RNA en verwarmd tot 65 °C gedurende 2 min. RNA-parels werden dan geïncubeerd gedurende 10 min bij RT terwijl het roteren. RNA-kralen werden vervolgens verzameld op een magneet en gewassen 1× elk met RNA WB1 (10 mM Tris–HCl pH 7,5, 0,12 m LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% LDS, 0.1% Triton X-100) en WB3 (10 mM Tris–HCl pH 7,5, 0,5 m LiCl, 1 mM EDTA). Voeg 50 µL Tris-HCl pH 7,5 en verwarm tot 80 °C gedurende 2 minuten elute. Verzamel RNA en voer een tweede Oligo-dT kraal collectie. Na het wassen van de tweede verzameling, in plaats van eluting was 1× met 1× eerste streng buffer; 250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCL2 (ThermoFisher SSIII kit Cat# 18080093). Fragmentatie: voeg dan 10 µL 2× eerste bundel buffer plus 10 mM DTT en fragment DNA bij 94 °C gedurende 9 min.toe. Verzamel parels op magneet en breng eluaat met gefragmenteerde mRNA aan een nieuwe PCR-strook. Moet 10 µL gefragmenteerd RNA herstellen. Eerste streng synthese: we gemengd gefragmenteerd RNA met 0,5 µL random primer (3 µg/µL) Life Tech # 48190-011, 0,5 µL oligo-dT (50 µM van SSIII kit), 1 µL dNTPs (10 mM Life Tech, cat 18427088) en 0,5 µL SUPERase-In (ThermoFisher Cat#AM2696) en warmte 50 °C gedurende 1 min. Plaats onmiddellijk op ijs. Vervolgens voegden we 5,8 µL ddH2O, 0,1 µL actinomycine (2 µg/µL Sigma cat#A1410), 1 µL DTT (100 mM Life Tech cat# P2325), 0,2 µL 1% Tween en 0,5 µL Superscript III toe en incuberen 25 °C gedurende 10 min, vervolgens 50 °C gedurende 50 min. Kraal opruimen: We voegden 36 µL RNAClean XP (Ampure XP) en gemengd, incuberen gedurende 15 minuten op ijs. De kralen werden vervolgens verzameld op een magneet en gewassen 2× met 75% ethanol. Parels werden vervolgens aan de lucht gedroogd gedurende 10 min en elute met 10 µL nuclease-vrije H2O. tweede bundelsynthese. 10 µL cDNA/RNA werd gemengd met 1,5 µL 10× blauwe Buffer (Enzymatica cat# B0110L), 1 µL dUTP/dNTP-mix (10 mM Affymetrix cat# 77330), 0,1 µL dUTP (100 mM Affymetrix cat# 77206), 0,2 µL RNase H (5 u/µL Enzymatica cat# Y9220L), 1 µL DNA-polymerase I (10 u/µL Enzymatica cat#P7050L), 0,15 µL 1% tween-20 en 1.05 µL nucleasevrij water. De reactie werd geïncubeerd bij 16 °C gedurende 2,5 uur. Parelreiniging: DNA werd gezuiverd door 1 µL Seradyn 3 EDAC SpeedBeads (Thermo 6515-2105-050250) per reactie toe te voegen in 28 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% eindconcentratie) en incuberen bij RT gedurende 10 min. Kralen werden vervolgens verzameld op een magneet en gewassen 2× met 80% ethanol. Parels werden aan de lucht gedroogd gedurende 10 minuten en geëlueerd in 40 µL nuclease-vrij water. DNA is klaar voor bibliotheekvoorbereiding.

Library prep protocol

dsDNA end repair: we hebben 40 µL DNA van ChIP-of RNA-protocollen gemengd met 2,9 µL H2O, 0.5 µL 1% Tween-20, 5 µL 10× T4 ligase buffer (Enzymatics cat# L6030-HC-L), 1 µL dNTP-mix (10 mM Affymetrix 77119), van 0,3 µL T4-DNA-pol (Enzymatics P7080L), van 0,3 µL T4 PNK (Enzymatics Y9040L), 0.06 µL Klenow (Enzymatics P7060L) en geïncubeerd gedurende 30 min bij 20 °C. 1 µL van Seradyn 3 EDAC SpeedBeads (Thermo 6515-2105-050250) in 93 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% finale) werd toegevoegd en geïncubeerd gedurende 10 min. Kralen opruimen: kralen werden verzameld op een magneet en gewassen 2× met 80% ethanol. Kralen werden aan de lucht gedroogd gedurende 10 minuten en vervolgens geëlueerd in 15 µL ddH2O. dA-Tailing. DNA werd gemengd met 10.8 µL ddH2O, 0,3 µL 1% Tween-20, 3 µL blauwe Buffer (Enzymatica cat# B0110L), 0,6 µL dATP (10 mM Tech 10216-018), 0,3 µL Klenow 3-5 Exo (Enzymatica P7010-LC-L) en geïncubeerd gedurende 30 min bij 37 °C. 55,8 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% final) werd toegevoegd en geïncubeerd gedurende 10 min. Toen was het opruimen van kralen gedaan. Kralen werden geëlueerd in 14 µL. Y-vorm adapter ligatie. Het monster werd gemengd met 0,5 µL van een BIOO barcode adapter( BIOO Scientific cat # 514104), 15 µL Rapid Ligation Buffer (Enzymatics cat@ L603-LC-L), 0,33 µL 1% Tween-20 en 0.5 µL T4 DNA ligase HC (Enzymatica L6030-HC-L) en geïncubeerd gedurende 15 min bij RT. 7 µL van 20% PEG8000/2,5 M NaCl werd toegevoegd en geïncubeerd gedurende 10 min bij RT. Parelreiniging werd uitgevoerd en parels werden geëlueerd in 21 µL. Vervolgens werd 10 µL gebruikt voor PCR-versterking (14 cycli) met IgA-en IGB-primers (AATGATACGCGACCCGA, CAAGCAGAAGACGGCATACGA).

GRO-seq

ontluikende transcriptie werd vastgelegd door global nuclear run-on sequencing (GRO-seq). Kernen werden geïsoleerd uit TGEMs met behulp van hypotone lysis (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 3 mM CaCl2; 0.1% IGEPAL CA-630) en flash bevroren in GRO-invriezen buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 5 mM MgCL2, 40% Glycerol). Run-on. 3-5 × 106 BMDM-kernen werden uitgevoerd met Brutp-gelabelde NTPs met 3 × NRO-buffer (15 mM Tris–Cl (pH 8,0), 7,5 mM MgCl2, 1,5 mM DTT, 450 mM KCl, 0,3 u/µL van SUPERase In, 1,5% Sarkosyl, 366 µM ATP, GTP (Roche), Br-UTP (Sigma 40 Aldrich) en 1,2 µM CTP (Roche, om run-on lengte te beperken tot ~40 nucleotiden). De reacties werden na 5 minuten gestopt door toevoeging van 500 µL TRIZOL LS-reagens (Invitrogen), 5 minuten vortexed en RNA geëxtraheerd en neergeslagen zoals beschreven door de fabrikant. RNA-pellets werden geresuspendeerd in 18 µL ddH2O + 0,05% Tween (dH2O + T) en 2 µL fragmentatiemix (100 mMZnCL2, 10 mM Tris–HCl (pH 7,5)) en vervolgens gedurende 15 minuten geïncubeerd bij 70 °C. De fragmentatie werd gestopt door toevoeging van 2,5 µL 100 mM EDTA. Brdu verrijking. Brdu-verrijking werd uitgevoerd met BrdU-antilichaam (IIB5) en AC-parels (Santa Cruz, SC-32323 AC, lot #A0215 en #C1716). Parels werden eenmaal gewassen met GRO bindende buffer (0,25× zout-natrium-fosfaat-EDTA buffer (SSPE), 0,05% (vol/vol) Tween, 37,5 mM NaCl, 1 mM EDTA) + 300 mM NaCl gevolgd door drie wasbeurten in GRO bindende buffer en geresuspendeerd als 25% (vol/vol) slurry met 0,1 u/µL SUPERase-in. Aan fragment-RNA werden 50 µL koude GRO-bindingsbuffer en 40 µL in evenwicht gebrachte brdu-antilichaamparels toegevoegd en de monsters draaiden langzaam bij 4 °C gedurende 80 min. Kralen werden vervolgens gesponnen naar beneden bij 1000 × g gedurende 15 s, supernatant verwijderd en de kralen overgebracht naar een Millipore Ultrafree Mc kolom (UFC30HVNB; Millipore) in 2 × 200 µL GRO-bindbuffer. De IP-reactie werd tweemaal gewassen met 400 µL GRO-bindbuffer voordat RNA werd geëlueerd door incubatie in 200 µL Trizol LS (ThermoFisher) onder voorzichtig schudden gedurende 3 minuten. De elutie werd een tweede keer herhaald, 120 µL dH2O + T toegevoegd om het supernatant te verhogen en geëxtraheerd zoals beschreven door de fabrikant. Eindreparatie en decapping: voor eindreparatie en decapping werden RNA-pellets opgelost in 8 µL TET (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20) door krachtige vortexing, verwarmd tot 70 °C gedurende 2 minuten en op ijs geplaatst. Na een snelle spin, 22 µL Reparatie master mix (3 µL 10× PNK buffer, 15.5 µL dH2O + T, 0.5 µL SUPERase-In RNase Inhibitor (10 U), 2 µL PNK (20U), 1 µL RppH (5U)) was toegevoegd, gemengd en geïncubeerd bij 37 °C gedurende 1 uur. Om phosphorylate de 5’end, 0.5 µL 100 mM ATP werd later toegevoegd en de reacties waren geïncubeerd nog 45 min bij 37 °C (de hoge ATP-concentratie lest RppH activiteit). Na het beëindigen van de reparatie werd 2,5 µL 50 mM EDTA toegevoegd, reacties gemengd en vervolgens 2 minuten verhit tot 70 °C alvorens op ijs te worden geplaatst. Een tweede brdu-verrijking werd uitgevoerd zoals hierboven beschreven. RNA-pellets werden opgelost in 2,75 µL Tet + 0,25 µL Illumina TruSeq 3 ‘ adapter (10 µM), verwarmd tot 70 °C gedurende 2 minuten en op ijs geplaatst. 7 van 3 ‘ master mix (4,75 µL 50% PEG8000, 1 µL 10× T4 RNA ligase buffer, 0,25 µL SUPERase-In, 1 µL T4 RNA Ligase 2 afgekapt (200U; NEB)) werd toegevoegd, goed gemengd en reacties geïncubeerd bij 20 °C gedurende 1 uur. reacties werden verdund door toevoeging van 10 µL tet + 2 µL 50 mM EDTA, verwarmd tot 70 °C gedurende 2 minuten, op ijs geplaatst en een derde ronde van brutp verrijking werd uitgevoerd. RNA pellets werden overgebracht naar PCR strips tijdens de 75% ethanol wassen en gedroogd. Monsters werden opgelost in 4 µL Tet (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20) + 1 µL 10 µM reverse transcriptie (RT) primer. Om het RTprimer te ontharden, werd het mengsel 5 minuten bij 75 °C, 15 minuten bij 37 °C en 10 minuten bij 25 °C geïncubeerd. Om de 5’ Illumina TruSeq-adapter te binden, werd 10 µL 5 ‘master mix (1,5 µL dH2O + 0,2% Tween 20, 0,25 µL denaturated 5’ Truseq-adapter (10 µM), 1,5 µL 10× T4 RNA ligasebuffer, 0,25 µL SUPERase-In, 0,2 µL 10 mM ATP, 5,8 µL 50% PEG8000, 0,5 µL T4 RNA ligase 1 (5U; NEB)) toegevoegd en werden reacties geïncubeerd bij 25 °C gedurende 1 uur. Reverse transcriptie werd uitgevoerd met behulp van Protoscript II (NEB) (4 µL 5× NEB FirstStrand buffer (NEB; E7421AA), 0.25 µL SUPERase-In, 0.75 µL Protoscript II (150U; NEB)) bij 50 °C gedurende 1 uur. Na toevoeging van 30 µL PCR master mix (25 µL 2× LongAmp Taq-2× Master Mix (NEB) in 0,2 µL 100 µM forward primer, 2.8 µL 5 M betaine en 2 µL 10 µM individuele barcoding primer), mengsels werden versterkt (95 °C 3 min, (95 °C gedurende 60 s, 62 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 15 s) x13, 72 °C gedurende 3 min.). PCR-reacties werden opgeschoond met 1,5 volumes SpeedBeads (GE Healthcare) in 2,5 M NaCl/20% PEG8000. Bibliotheken werden grootte geselecteerd op pagina / TBE gels tot 160-225 basisparen. Gelplakken werden versnipperd door het spinnen door middel van een 0,5 mL geperforeerde PCR buis geplaatst op de top van een 1,5 mL buis. 150 µL Gel EB (0,1% LDS, 1 m LiCl, 10 mM Tris–HCl (pH 7,8)) werd toegevoegd en de mengmest incubeer gedurende een nacht. Om het geëlueerde DNA te zuiveren, werd de bindende buffer van 700 µL Zymogen-Spaanderdna toegevoegd in de 1.5 mL-buis die de geraspte gelplak en de Gel EB bevat, door pipetteren wordt gemengd en de slurry aan een zymominielute-kolom wordt overgebracht. Monsters werden eerst gesponnen bij 1000 × g gedurende 3 min, dan 10.000×g gedurende 30 s. Flow through werd verwijderd, en monsters gewassen met 200 µl Zymo WashBuffer (met EtOH). Gelresten werden verwijderd door flikkeren en kolommen gewassen door toevoeging van nog eens 200 µL Zymo WashBuffer (met EtOH). De stroom door werd verwijderd, de kolommen werden droog gesponnen door centrifugeren bij 14.000 × g gedurende 1 min en DNA geëlueerd door toevoeging van 20 µL voorverwarmde rangschikkende Tet (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20). Bibliotheken werden gesequenced.

Western blotting

cellen werden gelyseerd met Igepale lysis buffer (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0.5% Igepal)en eiwitconcentraties werden bepaald met BioRad proteïne assay reagens met BSA als standaard. Eiwitten werden gescheiden op NuPage 4-12% Bis-Tris gradiënt gels (Invitrogen) en overgebracht op een nitrocellulose membraan (Amersham). Membranen werden geblokkeerd in TBS met 0,1% Tween-20 en 5% BSA. Membranen werden gevlokt met de aangegeven primaire ‘ s nachts bij 4 °C. Mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen werden gedetecteerd met behulp van ECL plus western blotting detection system (Amersham).

dieren en celkweek

TGEMs werden 3 dagen na injectie verzameld bij mannelijke muizen van 8 weken C57Bl/6J of BALB/cJ, en verguld met 20 × 106 cellen per petrischaal van 15 cm in DMEM plus 10% FBS en 1× penicillinestreptomycine. Eén dag na het plateren werden de cellen aangevuld met verse media en gedurende 1 uur behandeld met PBS (Veh) of 100 ng/mL KLA en vervolgens direct gebruikt voor downstreamanalyses. iBMDM wordt geproduceerd door infectie van BMDM met een retrovirus dat myc en Braf V600E66 bevat. De vereeuwigde cellen groeien dan over enkele weken uit. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen van de University of California, San Diego Institutional Annual Care and Use Committee (IUCAC).

lentivirus productie

pLentiguide werd gewijzigd om een U6-bsmbi-spgRNA steiger en een CMV promotor driving tagBFP2 te bevatten. 2 CRISPR-gidsen werden voor elk doel geplaatst via PCR-versterking met de H1-promotor (bsmbi-site/guide1/scaffold/H1-promotor/guide 2/bsmb1-site) voor een totaal van 2 gidsen per virus (U6 en H1-gedreven) (aanvullende tabel 4). Virus werd gemaakt met pVSVg / ppax2 systeem. Twee dagen na de transfectie werd het medium verzameld en gedurende 2 uur gecentrifugeerd bij 4 °C bij 20.000 × g. Celpellet werd ‘ s nachts gereconstitueerd bij 4 °C in OPTI-MEM en bewaard bij -80 °C.

productie van CRISPR KO iBMDMs

KO iBMDMs werden geproduceerd met behulp van lentivirale infectie. iBMDM-CAS9-IRES-EGFP werden besmet met MOI 100, zoals gemeten op 293T cellen, met Lentiblast (OZ biosciences) (5 µL elk reagens) in OPTI-MEM. Dit werd vervolgens gecentrifugeerd bij 1300g gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Media werden vervolgens verwijderd en cellen werden aangevuld in beenmerg media (30% L-cel, 20% FBS, 1% penicilline/streptomycine in DMEM) gedurende 2 dagen. De cellen werden dan gesorteerd voor besmetting door uitdrukking van transgen op de virale opeenvolging (tagBFP2).

Rapporteringssamenvatting

nadere informatie over de experimentele opzet is beschikbaar in de aan dit artikel gekoppelde samenvatting van de Nature Research Reporting.

beschikbaarheid Code