dubbele blokkade van CD47 en HER2 elimineert radioresistente borstkankercellen

cellijnen

Humane borstkanker MCF-7, MDA-MB-231, BT474, BT549, SKBR3 cellijnen, glioblastoom U251 en colonkanker HCT116 cellijnen werden gekocht bij ATCC. MCF-7, MDA-MB-231, BT474, BT549, en u251 cellen werden gehandhaafd in dmem-medium aangevuld met 10% FBS, en SKBR3-cellen gehandhaafd in rpmi-1640-medium met 10% FBS. HCT116 cellen werden gehandhaafd in McCoy ‘ s 5a Medium met 10% FBS. De radiobestendige MCF7 / C6 en MDA-MB-231/C5 cellijnen die na herhaalde bestraling werden gekloond uit overlevende fracties van MCF7 en MDA-MB-231 cellen; de HER2-overexpresterende stamcellen van borstkanker (HER2+/CD44+/CD24−/low BCSCs) werden geïsoleerd uit MCF7/C626. Muis triple-negatieve borstkanker 4T1 cellen werden gehandhaafd in DMEM medium met 10% FBS. Menselijke monocyt THP-1 werden gekweekt in ATCC-geformuleerd rpmi-1640 medium aangevuld met 10% FBS, 15 mM HEPES, 4.5 G / L glucose, en 2-mercaptoethanol tot een uiteindelijke concentratie van 0,05 mM. muis Mφ RAW 264.7 cellen werden gekweekt in dmem-medium met 10% FBS volgend met de ATCC-cultuurmethode. Alle cellijnen werden getest negatieve mycoplasma besmetting met Mycosensor PCR Assay kit (Agilent Technologies, Catalog # 302108).

plasmiden en reagentia

CD47-promotor-gecontroleerde luciferasevector werd geconstrueerd door het klonen van het humane CD47-promotorgebied (-1554 nt) tot pgl2-basisch plasmide van kPNI/Hind III-plaatsen. De verwijdering van de veronderstelde NF-kB-bindingsplaatsen (TGGAAGCT-764-757) werd uitgevoerd met behulp van een quick mutation kit (Stratagene, La Jolla, CA). De gebruikte primersequenties: 5 ′-GTGGTCGGGTACCTGCCCGCTCGCCCCTCGCGGGCTCTGCG-3′ (sense) and 5 ′-CGCAGAGCCCGCGAGGGGCGAGCGGGCAGGTACCCGACCAC-3′ (antisense).

pGL2-NF-κB-luc plasmid was constructed with the 3 NF-κB-binding sites: GTGGGTTCCC, TCGCCACTCCCC, and TGGAAAGTCCCC by blunt-end ligation. IMD-0354 (Catalog # I3159) and TNF-α (Catalog # T0157) were purchased from Sigma. The lentiCRISPR v2 vector was purchased from the Addgene plasmid repository (Catalog # 52961). Herceptin was obtained from the UC Davis Comprehensive Cancer Center Pharmacy as left-over medicine (Genentech, NDC 50242-132-01). Lapatinib ( catalogus # S1028) werd gekocht van Selleckchem. Anti-CD47 (B6H12) antilichaam voor IHC, ICC, en western blot werd gekocht van Santa Cruz (catalogus # sc-12730). Anti-CD47-FITC voor cytometry stroom werd gekocht van biowetenschappen van BD ( catalogus # 556045). Anti-humaan CD47 (B6H12) antilichaam voor fagocytose assay werd geëxtraheerd uit b6h12.2 hybridoma (ATCC® HB-9771™). Anti-muis CD47 antilichaam voor in vivo tumorremming werd geëxtraheerd uit MIAP301 hybridoma verstrekt door Dr.William Frazier (Washington University School Of Medicine). Anti-CD11b antilichaam voor IHC kleuring werd gekocht van Invitrogen ( catalogus # MA5-17857). Muis monoklonaal anti-α-tubuline antilichaam voor western blot werd gekocht van Sigma-Aldrich ( catalogus # T6074). Muis monoklonaal anti-β-actin antilichaam voor western blot werd gekocht van Sigma-Aldrich ( catalogus # A5441). Anti-HER2 / ERBB2 (catalogus # 29D8) antilichaam voor IHC kleuring en western blot werd gekocht van Cell Signaling Technology (catalogus # 2165). Anti-HER2-APC antilichaam Voor stroom cytometry analyse werd gekocht van BD Biosciences (catalogus # 340554).

Immunoblotting

eiwitten uit cellen of tumorweefsels werden geëxtraheerd in RIPA lysis buffer (Pierce) aangevuld met protease-en fosfataseremmercocktail (Cell Signaling). De eiwitconcentratie werd bepaald met behulp van de BCA-test (Pierce). Lysaten werden vervolgens gedenatureerd en monsters met 30 µg eiwitten werden onderworpen aan elektroforese in 10% SDS-poly-acrylamidegel, gevolgd door overdracht naar polyvinylideendifluoride membranen (Bio-Rad). Na blokkering met 5% vetvrije droge melk werd het membraan blootgesteld aan het primaire antilichaam en ‘ s nachts bij 4 °C geïncubeerd. Vlekken werden gevisualiseerd door labeling met HRP-gekoppelde secundaire antilichamen (Sigma-Aldrich) en incubatie met Amersham ECL western blotting detection reagens (catalogus # RPN2106). Blots werden ontwikkeld op een Konica SRX101A ontwikkelaar en gekwantificeerd met ImageJ.

Stroomcytometrieanalyse

verzamelde cellen werden gespoeld met PBS met 0,5% BSA in PBS en de celkorrels werden geïncubeerd met met fluorescentie gelabelde primaire antilichamen bij 37 °C gedurende 30 minuten, gevolgd door driemaal wassen met 0,5% BSA / PBS. Alle antilichamen werden getitreerd voor het optimaliseren van de voorwaarde alvorens op het experiment toe te passen. De cytometrieanalyse van de stroom werd uitgevoerd gebruikend de cytometer van FACS Canto II (BD) en de daaropvolgende analyse werd uitgevoerd gebruikend de software van FlowJo (Boomster, Ashland, of, de V. S.). De gating strategieën werden gebaseerd op FSC en SSC eigenschappen en werden set-up voor positieve celpopulaties in FITC, APC kanalen.

Humane borstkankerweefsels

vers ingevroren HER2 positieve en negatieve borstkankerweefsels werden verstrekt door het UC Davis Comprehensive Cancer Center Biorepository (IRB # 283665, en IRB # 218204), gefinancierd door de UC Davis Comprehensive Cancer Center Support Grant (CCSG), toegekend door het National Cancer Institute (NCI P30CA093373), waarbij alle patiënteninformatie werd geblokkeerd, behalve de diagnostische resultaten. Aanvullende pathologische monsters van borstkanker bij de mens, waaronder de Onbevlekte 4 µm dikke secties van formaline-fixed paraffine-embedded (FFPE) gepaarde primaire borstkanker en recidiverende borstkanker werden verkregen van de afdeling pathologie, Ohio State University met onderzoek IRB goedkeuring (#2002H0089).

immunohistochemie (IHC)

immunohistochemisch kleuring werd gedaan op 4-µm dikke FFPE weefselsecties. In het kort werden de objectglaasjes gedeparaffiniseerd en gerehydrateerd en werden de antigenen gedurende 40 minuten opgehaald in een citraatbuffer (pH 6,1) bij 95 °C. Endogene peroxidase activiteit werd geblokkeerd met 3% H2O2 oplossing. De primaire antilichaam incubatie werd gedaan bij 4 °C ‘ s nachts, gevolgd door de Vectastain ABC Kit (Vector Laboratories) bij RT gedurende 30 minuten volgens de instructies van de fabrikant. De reactieproducten werden gedetecteerd met Peroxidasesubstraat Kit en tegenbehandeld met hematoxyline (Vectorlaboratoria). Twee senior pathologen waren verantwoordelijk voor de diagnose van borstkankers in de kliniek en de evaluatie van experimentele tumoren. De CD47-expressie werd geëvalueerd door gebruik te maken van zowel de kleuringsintensiteit als het percentage gekleurde cellen. De kleuringsintensiteit werd ingedeeld als 0: negatief; 1: zwak; 2: matig; 3: sterk. Hoge expressie werd gedefinieerd als sterke kleuring intensiteit in meer dan 25% van tumorcellen; medium expressie was matige kleuring intensiteit in meer dan 25% van tumorcellen; lage expressie werd zwakke kleuring intensiteit in meer dan 25% van de tumorcellen of matige kleuring in <25% van de tumorcellen via de ASCO-CAP guidelines63 werd gebruikt voor de interpretatie van HER2 immunohistochemistry (IHC) en HER2-eiwit expressie werd gescoord als negatieve IHC 0 (geen vlekken of het membraan van de vlekken die wordt gepubliceerd onvolledig en zwak, nauwelijks waarneembaar en binnen ≤10% van de invasieve tumorcellen) of negatieve IHC 1+ (onvolledige kleuring van het membraan dat is zwak, nauwelijks waarneembaar en binnen >10% van de invasieve tumorcellen); twijfelachtige IHC 2+ (circumferentiële membraankleuring die onvolledig en/of zwak/matig is en binnen >10% van de invasieve tumorcellen; en of volledige en circumferentiële membraankleuring die intens is en binnen ≤10% van de invasieve tumorcellen); positieve IHC 3+ (circumferentiële membraankleuring die volledig, intens is in meer dan 10% van de invasieve tumorcellen). Als de resultaten dubbelzinnig waren (2+), werd een reflextest uitgevoerd met behulp van in situ hybridisatie (ISH). Bij het opsporen van CD47-expressie van in vivo bestraalde tumoren werden behandelde muistumoren verwijderd en gedurende 24 uur gefixeerd in 4% paraformaldehyde in PBS. de monsters werden gedurende 48 uur gedehydreerd met serie ethanol (70%, 95% en 100%) alvorens in de paraffineoplossing (Polysciences) te worden ingebed.

Immunocytochemie (ICC)

cellen werden gezaaid op ronde coverslips en gegroeid tot 60-80% confluentie, gevolgd door spoelen met PBS, fixatie in 4% paraformaldehyde (pH 7,2), en permeabilisatie met 0,1% Triton X-100 in PBS. De cellen werden vervolgens gedurende 15 minuten in een blokkerende oplossing geïncubeerd voordat ze ‘ s nachts bij 4 °C met 1:250 verdunningen werden geïncubeerd met het primaire antilichaam. Cellen werden geïncubeerd met tr-of FITC-geconjugeerde secundaire antilichamen verdund 1:1000 in de blokkerende oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker en geanalyseerd met confocale microscopie.

Identificatie van stralingsgeassocieerde antigene eiwitten

C57/B6 Muis werd gebruikt als immunisatie gastheer met 5 × 106 MCF7 / C6 cellen in 0.1 ml volume geïnjecteerd aan de basis van de staart of voetpad per muis, gevolgd door boosting met hetzelfde volume cellen op de 14e dag. Bij 5de-7de dag na de tweede uitdaging werden de muizen geëuthanaseerd en het serum werd verzameld om antigene molecules te ontdekken die in radiobestendige cellen van BC worden uitgedrukt. Om RAAPs te onderscheiden van niet-specifieke moleculen uitgedrukt in normale borst epitheliale cellen en wild-type MCF7 cellen, werd een pre-clean procedure uitgevoerd met het ruwe serum door de volgende stappen. Twee miljoen humane normale epitheliale MCF10A-cellen van de borst werden bereid in een oplossing met 1 mm EDTA/PBS zonder trypsine om te voorkomen dat sommige gevoelige eiwitten verteerd worden, gevolgd door tweemaal spoelen met PBS. De cellen werden gepelleteerd en vervolgens losgemaakt door op de bodem van de buis te tikken, gevolgd door 1 ml Anti-sera van de muis toe te voegen en gedurende 2 uur bij 4 °C te draaien. het mengsel werd vervolgens 5 minuten bij 4 °C gecentrifugeerd bij 9391 × g en de supernatanten werden verzameld, die eenmaal werd herhaald. Het eerste gereinigde antiserum werd verder gereinigd door incubatie met wild-type MCF7-cellen met dezelfde procedures en zes keer herhaald. Het uiteindelijke gezuiverde antiserum werd vervolgens getest door western blot tegen eiwit lysaat van MCF10A-cellen, MCF7-cellen, MCF7 / C6 en RD-BCSC− cellen die werden gesorteerd door borstkankerstamcellen HER2+/CD44+/ CD24-evenals aldehyde dehydrogenase (ALDH)64. CD47 en HER2 samen met andere RAAPs in de radioresistant BC cellen werden geïdentificeerd door western blots of door immunoprecipitation van membraan eiwitten gezuiverd van RD-BCSC cellen en de geëlueerd fracties werden geanalyseerd via LC/MS. Het resultaat op het membraan van de RAAPs werden geclusterd met een aantal van eiwitten en eiwit functionele categorieën.

CRISPR bewerken van HER2 en CD47

de sgRNAs zijn ontworpen volgens de instructie gepubliceerd door Dr.Zhang Lab ‘ s CRISPR ontwerpsoftware (http://crispr.mit.edu) en het gevestigde protocol dat is beschreven in de vorige publicatie65. Vier Oligos werden ontworpen die overeenkomen met de menselijke sgrna ‘ s werden gesynthetiseerd en gekloond in lenticrispr v2 vector volgens het Zhang Lab GeCKO gepoolde library amplification protocol. Om de mogelijkheid van het niet-specifieke richten te minimaliseren, werden drie sgrna oligos van elk het richten gen samengesteld en getest. De sgrna met de beste knockout efficiëntie bepaald door western blotting werd gekozen voor latere experimenten. De sgrna-sequenties werden als volgt gebruikt voor menselijke en muiscellen:

hHer2gRNA_F: CACCGCGGCACAGAGTGCGCGTC

hHer2gRNA_R: AAACGACGCGCACTGT CTGTGCCGC

hCD47gRNA_F: CACCGTAAATATAGATCCGGTGGTA

hCD47gRNA_R: AAACTACCAC CGGATCTATATTTAC

mHer2gRNA_ F: CACCGTGATGGCCCTCGCCCCTCGG

mHer2gRNA_ R: AAACCCGAGGGGCGAGGGCCATCAC

mCD47gRNA_F: CACCGCCCTTGCATCGTCCGTAATG

mCD47gRNA_R: AAACCATTACGGACGATGCAAGGGC

The lentiviral particles were generated using 293T cells following the protocol from Addgene. For gene editing, the isolated BCSC sphere cells or MCF7/C6 cells were trypsinized into single cells and plated 1. 2.5 × 105 cells/0.5 ml per well in the 12-well plates. Na incubatie gedurende 12 uur werd 1 ml virusbevattende supernatant met 8 ng polybrene toegevoegd aan de cellen, gevolgd door incubatie gedurende 6 uur. daarna werd 0,5 ml extra normaal medium met 10% warmte-geïnactiveerde FBS toegevoegd en gedurende de nacht verder gekweekt. Het infectiemedium werd vervangen door 2 ml vers medium met 10% FBS en gekweekt gedurende 72 uur. cellen werden doorgegeven aan 60 mm weefselkweekschotels en geselecteerd door het kweken in 0,3 µg/ml Puromysine gedurende 1 week en de knockout van het beoogde gen werd geverifieerd door immunoblotting.

Luciferase assay

cellen werden getransfecteerd met pgl2-basic-CD47 of PGL2-basic-CD47-ΔNF-kB of pgl2-NF-kB luciferase reporters, en luciferase activiteit werd gemeten met Luminometer (Promega, Madison, WI). Voor normalisatie van de transfectie-efficiëntie van de reporter werd de totale eiwitconcentratie van lysaten gemeten met de BCA-Eiwitassaykit (Pierce, Rockford, IL) met BSA als standaard.

chromatine immunoprecipitation (ChIP) assay

cellen werden Vernet met formaldehyde (1% final) gedurende 10 minuten, gewassen met ijskoude PBS, en verzameld in SDS lysis buffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8. 1). Chromatine werd geschoren door sonicatie, vooraf geklaard met proteïne g geconjugeerde agaroseparels en geïncubeerd met anti-p65, anti-c-Rel of normaal IgG bij 4 ° C ‘ s nachts. Nadat proteïne G gedurende 2 uur bij 4 °C was toegevoegd, werd het complex op sequentiële wijze gewassen met lage en hoge zout immuuncomplex wasbuffers (0. 1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mm EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.1 plus 150 mM NaCl voor zoutarm en 500 mM NaCl voor zoutrijke buffers) gevolgd door TE buffer (tweemaal). De interactie van de DNA-transcriptiefactor werd na de toevoeging van NaCl en incubatie bij 65 °C ‘ s nachts omgekeerd. Na de vertering van RNase A en proteïnase K, werden de fragmenten van DNA gezuiverd door fenol/chloroformextractie en ethanolprecipitatie. DNAs werden gezuiverd en gebruikt voor PCR met primers specifiek voor het gebied van de genpromotor die NF-kB-bindende plaatsen omvatten. De CD47 primers waren:

5′-CGTGGACCAGGACACCTAGG-3′ (sense)

5′-AGGGAAGAGAACCGCATAGG-3′ (antisense)

The PCR amplification of the IκB promoter region (1134/902) was also included as positive. The primers for NF-κB-binding site in the IκB promoter were:

5′-TGTAGCACCCATTAGAAACACTTC-3′ (sense)

5′-TTCTTGTTCACTGACTTCCCAAT-3′ (antisense).

Preparation of anti-human and anti-mouse CD47 antibodies

Hybridoma for monoclonal mouse anti-human CD47 antibody (B6H12.2), IgG2b were obtained from ATCC. Monoklonale rat anti-muis CD47 IgG2a antilichaam (MIAP301) en hybridoma werden verkregen van Dr.William Frazier (Washington University School Of Medicine). Beide hybridoma cellijnen werden gehandhaafd in IMDM medium met 20% FBS. Antilichamen werden gezuiverd uit hybridoma supernatant met behulp van proteïne g hars uit GenScript (Catalog # L00209) na de fabricage standaard procedures. De monsters werden vervolgens verder 10-20-voudig geconcentreerd met behulp van Microsep centrifugale apparaten uit Pall Life Sciences. Concentraties van gezuiverd IgG werden bepaald door de absorptie te meten bij OD280.

fagocytose assay

zowel Humane monocyt THP1-cellen als muizen Mφ ruwe 264,7 cellen (ATCC, TIB-71) werden gehandhaafd in een 5% CO2-incubator bij 37 °C66 bij een geschatte dichtheid van 1 × 106/ml. Ongeveer 0,8 × 106 cellen / ml ruwe 264,5 cellen of 1 × 106 THP1 cellen werden gezaaid op een 6-Wells plaat. Na 24 uur incubatie werden de ruwe 264.7 cellen geactiveerd door met 0.1 µg/ml lipopolysaccharide (LPS) gedurende 24 uur te behandelen. Monocyte thp1 cellen werden differentiatie door Phorbol 12-myristate 13-acetaat (PMA) (40 nM) gedurende 48 uur. Geactiveerde macrofagen werden gekleurd met Dio bij het laatste concertatie 40 nM in een medium gedurende 20 minuten, gevolgd door drie keer spoelen met medium. Kankercellen werden geëtiketteerd met 1 µM DDAO (5 mM stamoplossing in DMSO opgeslagen bij -20 °C) in PBS bij 37 °C gedurende 15 min en gewassen met PBS met 1% FBS. Ddao-gelabelde doelcellen (1 × 106) werden toegevoegd aan Dio-gekleurd Mφs en geïncubeerd in een uiteindelijke volume van 2 ml bij 37 °C gedurende 2 uur. na de incubatie, Mφs en doelcellen werden geoogst met drie keer EDTA-PBS wassen gevolgd door 0,25% trypsinisatie. Fagocytose werd beoordeeld door de dubbel-geëtiketteerde cellen (DIO+/DDAO+) te evalueren, die phagocytized cellen van borstkanker door rijpe Mφs vertegenwoordigt, via cytometry stroom. De FlowJo software werd gebruikt voor analyse.

Clonogene survival assay

Clonogene survival assay werd uitgevoerd na bestraling met of zonder behandeling (Lapatinib, 10 µM gedurende 72 uur; anti-CD47 antilichaam 10 µg/ml ‘ s nachts). De behandelde cellen werden gedurende 10-14 dagen gekweekt en kolonies werden gefixeerd, gekleurd met coomassie blauwe vlek. Kolonies met meer dan 50 cellen werden geteld als overlevende klonen en genormaliseerd aan de plating efficiëntie van elke sham-behandelde tumorcellijn.

Gap-filling rate assay

Gap-filling capaciteit werd gemeten met 1 × 106 cellen gegroeid in elk van 6-Wells platen tot 100% samenvloeiing gevolgd door 24 uur celuithongering. Vervolgens werd de opening gemaakt door schaven de schotel diagonaal met een steriele pipet tip. De cellen werden onbehandeld of behandeld met 10 µg/ml IgG of anti-CD47 antilichaam gedurende de duur van het experiment. De vulcapaciteit werd gedurende 72 uur gemonitord en representatieve beelden werden genomen op dag 0 (Dag van het schrapen) en dag 3.

Tumorsphere vorming

cellen werden gezeefd met 40 µm cel zeven (catalogus # 352340. Corning) en eencellige suspensies werden gezaaid in petrischalen met een lage aanhechting van 60 mm bij een dichtheid van 1000 cellen/ml. De cellen werden gekweekt in serumvrij Borst epitheliaal basaal medium (MEBM), aangevuld met B27 (catalogus # 17504-044. Life-Technologie), 20 ng / ml EGF (catalogus # 4022-500. Bio-vision), 20 ng/ml basic-FGF (Catalog # 13256-029. Invitrogen), en 4 µg/ml heparine ( catalogus # 80603-686 EMD MILLIPORE). De cellen werden gedurende 10 dagen gekweekt en tumorsferen werden geteld onder lichtmicroscopie.

transwell invasion assay

Aliquots (0. 4 ml) van Matrigel ( catalogus # 356231. Bd Biowetenschappen) werden verdund in coatingbuffer: 0,01 M Tris (pH 8,0), 0,7% NaCl tot de uiteindelijke concentratie van 200-300 µg/ml. Ongeveer 100 µl werden geladen in de bovenste kamer van 24-Wells transwell (catalogus # 3422. Costar) en geïncubeerd bij 37 °C om ongeveer 1 uur te geleren. Verwijder voorzichtig de resterende coatingbuffer van het doorlaatbare steunmembraan zonder de laag te verstoren en voeg vervolgens cellen toe (2,5 × 104/ml). De onderste kamer werd gevuld met 800 µl MEM-media die 5 µg/ml fibronectine bevatten ( catalogus # SC-29011. Santa Cruz). De transwell met verschillend behandelde cellen werd gedurende 48 uur geïncubeerd en gekleurd met Diff-Quick Stain kit ( catalogus # K7128. IMEB INC).

bereiding van F (ab’)2 fragmenten

CD47 F (ab’) 2 fragmenten werden geproduceerd door het splijten van Papaïnehars van IgG met behulp van een F (ab’) 2 voorbereidingskit (catalogus # 786272. G-Biowetenschappen) volgens de aanbevelingen van de fabrikant en de gerapporteerde procedure67. Na papaïnevertering, werd het Fab-fragment gescheiden van onverteerd IgG en het Fc-gebied met de Proteã ne een Spinkolom van de Fab-Fragmentatieuitrusting de SpinOUT GT-600 ontziltingskolommen werden geleverd om de aanvankelijke antilichaamsteekproef te verzekeren om de optimale voorwaarde voor Fab-fragmentatie te zijn en gezuiverde anti-muis CD47 IgG werd verzameld voor de in vivo behandeling van de muistumor.

straling van BC-cellen met CRISPR-KO CD47 en/of HER2

voor in vivo test van de werkzaamheid van tumorremming door straling met deficiënte CD47− en HER2− status werden 5 × 105 4T1/C2− cellen met CRISPR− knockout van CD47 (CD47−/−), HER2 (HER2−/−) of dubbel (CD47 – / – /HER2 -/ -) in de borstvetkussens van BALB/c (n = 6 per groep) geïmplanteerd. De tumorgroei werd beoordeeld door het tumorvolume om de 2 dagen te meten die dag 7 Beginnen tot de tumorvolumes de beperking bereikten. Om de radiosensitiviteit van tumoren met verschillende status van CD47 en HER2 te beoordelen, werd lokale tumorstraling geleverd met 5 Gy aan elke tumor op dag 9 en tumorgroei werd om de andere dag gemeten tot controletumoren de maximale beperking bereikten.

RT van muis BC met anti-CD47 en/of HER2 behandeling

voor in vivo testen van tumorremming met een enkel CD47 antilichaam in aanwezigheid of afwezigheid van radiotherapie, volgde anti-CD47 behandeling het protocol van Willingham et al20 met enkele wijzigingen. Acht weken oude immuun-competente (BALB / c) vrouwelijke muizen (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) werden geïnjecteerd met 1 × 105 muis Borst 4T1 cellen in de 4e borstklieren. Vijftig microliters PBS die 100 µg controle IgG of Anti-CD47 F (ab’) fragmenten bevatten werden geïnjecteerd in de tumorplaats (dag 1) of in de tumorweefsels (dag 15) en om de andere dag herhaald tot het einde van de experimenten. Tumorvolumes werden om de 5 dagen gecontroleerd. Voor bestralingsbehandeling, anti-CD47, of straling gecombineerd met anti-CD47, werden de dieren met 4T1 tumoren willekeurig verdeeld in verschillende behandelingsgroepen en een controlegroep (5-10 muizen per groep). Lokale tumorstraling begon wanneer het tumorvolume 200 mm3 bereikt met spar (5 Gy/dag/tumor voor vier fracties met behulp van micro-beam IR bron; totale dosis = 20 Gy) gecombineerd met drie keer tumorinjecties van anti-CD47 F (ab’). De Stralingsgevoeligheid van de in vivo bestraalde tumoren met de aanwezigheid of afwezigheid van anti-CD47 F (ab’) werd geëvalueerd door het tumorvolume aan het einde van de experimenten te meten. De dieren werden geëuthanaseerd toen de tumoren waren ~ 1400 mm3 of wanneer de dieren leek ongemakkelijk te zijn, zelfs wanneer de tumor kleiner was dan 1400 mm3 om te voldoen aan UCD iacuc regelgeving voor het gebruik van gewervelde dieren in onderzoek. Het animal use and care protocol van in vivo radiotherapie werd goedgekeurd door het Institutional Animal Use and Care Committee van de University of California Davis (iacuc 15315).

voor in vivo testen van tumorremming met duale antilichamen tegen CD47 en HER2 in aanwezigheid of afwezigheid van radiotherapie, werden acht weken oude immuuncompetente (BALB/c) vrouwtjesmuizen (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) geïnjecteerd met 1 × 105 4T1-cellen van de muisborst in de 4e borstklieren. Toen tumorvolumes ongeveer 200 mm3 bereikten, werden muizen willekeurig verdeeld in vier groepen (6 muizen per groep). PBS, IgG, anti-CD47 F (ab’) fragmenten (100 µg), of Herceptin (5 mg/kg) werden geïnjecteerd in tumorweefsels 4 uur vóór lokale radiotherapie (5 Gy per dag gedurende 2 dagen). Injecties werden uitgevoerd en de tumorgrootte werd om de dag gecontroleerd tot het einde van de experimenten. Muizen werden geëuthanaseerd toen de tumoren waren ~ 1400 mm3 of wanneer de dieren leek ongemakkelijk te zijn, zelfs wanneer de tumor kleiner was dan 1400 mm3 om te voldoen aan UCD iacuc regelgeving voor het gebruik van gewervelde dieren in onderzoek. Het animal use and care protocol van in vivo radiotherapie werd goedgekeurd door het Institutional Animal Use and Care Committee van de University of California Davis (iacuc 15315).

Tumor-geïnfiltreerd macrofagen macrofagen en fagocytose

GFP-uiting muis borstkanker 4T1 cellen werden geïmplanteerd in de 4e uiervet pads van BALB/c muizen en behandeling werd gestart wanneer tumoren bereikt over 200 mm3 door tumor injectie van 50 µl PBS bevattende 100 µg controle IgG anti-CD47 F (ab’) fragmenten, Herceptin of beide van antilichamen om de andere dag drie keer. Tumor lokale RT werd geleverd op dagen 10 en 11 met 5 Gy / dag / tumor voor twee fracties, totale dosis = 10 Gy, en experimenten werden beëindigd 2 dagen na de beëindiging van antilichaambehandelingen. Tumoren werden uitgepakt en FFPE secties werden voorbereid voor immunofluorescentiekleuring volg de standaard procedure: de dia ’s waren deparaffinized en gerehydrateerde, en antigenen werden opgehaald voor 40 min in een citrate buffer (pH 6.1) op 95 °C. verwijder autofluorescentie, dia’ s waren socked in de autofluorescentie-oplossing (0,5 M CuSO4, 0,05 M NH4COOH in H2O) op RT voor 48 uur, gespoeld met water 5 min 3keer, dan geblokkeerd met 1:100 paard serum. De primaire antilichaam incubatie werd gedaan bij 4 °C ‘ s nachts: anti-GFP (1: 100; Dako), anti-CD11b( 1: 100; Millipore); Na het wassen werden de dia ‘ s geïncubeerd met 1:250 verdunde fluorescente geconjugeerde secundaire antilichamen (Rhodamine voor CD11b, Alexa Fluor 488 voor GFP) bij RT gedurende 1 uur en dan opgezet met Vectashield-Antifadeoplossing die DAPI bevatten (Vectorlaboratoria, Burlingame, CA, USA). Macrophage-bemiddelde fagocytose werd ontdekt met fluorescente microscopie gebruikend Axiovision software (Zeiss, Duitsland) en microfotografen werden gekwantificeerd door ImageJ.

statistische analyse

alle experimentele gegevens verkregen uit in vitro cellulaire studies en dierproeven worden weergegeven als gemiddelde ± SE, geanalyseerd met behulp van de tweestaart Student t-test voor twee groepen of ANOVA voor meerdere groepen. De statistische significantie van Kaplan–Meier-overlevingscurves werd bepaald met een Mann-Whitney-test. Het aantal onafhankelijke experimenten en de replicaten werden aangegeven in de figuur legends. P-waarden < 0,05 werden als significant beschouwd en worden als volgt aangegeven met een asterisk: * P < 0.* * P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Rapporteringssamenvatting

nadere informatie over de opzet van het onderzoek is beschikbaar in de aan dit artikel gekoppelde samenvatting van de Nature Research Reporting.