Encephalitozoon cuniculi stam III Is a Cause of Encephalitozoonosis in Both Humans and Dogs

Abstract

Microsporidia are obligate intracellular eukaryotic organisms found in a wide range of vertebrate and invertebrate hosts. Encefalitozoon cuniculi wordt vaak gevonden in tamme konijnen en knaagdieren en komt ook voor bij honden, andere honden, en primaten, met inbegrip van de mens. DNA sequencing van de ribosomale RNA genen is gebruikt om deze parasieten op soortniveau te identificeren en E. cuniculi stammen I, II en III te definiëren. acht nieuwe hond isolaten werden gekarakteriseerd als E. cuniculi stam III door gebruik van moleculaire methoden. Deze stam is ook geïdentificeerd in isolaten van immunogecompromitteerde mensen, wat wijst op het zoönotische potentieel van deze parasiet. Langdurige microsporidiale sporen afstoten van asymptomatische honden is ook gemeld.Encephalitozoon cuniculi is een verplicht intracellulair protozoa van de phylum Microspora en is een veel voorkomende parasiet van tamme konijnen en knaagdieren. Af en toe zijn deze parasieten gemeld bij andere gastheren, waaronder honden, blauwe Vossen (Alopex lagopus), en een klein aantal andere wilde carnivoren . Steeds meer meldingen beschrijven ook klinische ziekten bij mensen veroorzaakt door E. cuniculi, maar de bron(n) van infectie bij de mens is onbekend .

historisch gezien was de parasietidentiteit gebaseerd op morfologische en soms ultrastructurele kenmerken. Onlangs, morfologisch gelijkaardige leden van het geslacht Encephalitozon zijn speciated door gebruik van immunologische eigenschappen en moleculaire karakterisatie van de ribosomal RNA genen . Isolaten van E. cuniculi zijn verder verdeeld als stammen I, II of III, op basis van het aantal herhalingen van een 4-base sequentie (5′-GTTT-3′) in het interne getranscribeerde spacer (ITS) – gebied van het ribosomaal RNA-gen . Twee hond E. cuniculi isolaten werden aangewezen stam III op basis van de aanwezigheid van 4 sequentie herhalingen . Vervolgens zijn ⩾4 menselijke isolaten geïdentificeerd als stam III (isolaten “Donovan” GenBank X98466, CDC:V282, en IPZ:MX-H5) en als stam I in twee rapporten uit Europa . Deze studie breidt dat werk uit door 8 extra hond isolaten van E. cuniculi te identificeren uit 4 uitbraken als stam III. hoewel er geen epidemiologische gegevens direct hebben bevestigd hond-naar-mens transmissie, moleculaire gegevens suggereren honden kunnen dienen als potentiële reservoirs van parasieten. Bovendien is langdurige uitscheiding van sporen door asymptomatische honden gedocumenteerd, wat de kans op zoönotische overdracht van de parasiet verder versterkt.

materialen en methoden

Parasietisolaten

de lichamen van 7 pups van 3 niet-verwante nesten en 1 hond werden gedurende 18 maanden voor postmortem evaluatie voorgelegd aan het Texas Veterinary Diagnostic Laboratory. De dieren waren afkomstig uit vier onafhankelijke bronnen uit verschillende regio ‘ s van Texas. In elk geval werd op basis van histologische bevindingen een diagnose van encefalitozoonose gesteld. Acht parasitaire isolaten werden vastgesteld uit vers weefsel van de dieren: 5 isolaten werden afgeleid uit hersenweefsel of nierweefsel van 5 tot 7 weken oude Boston terrier puppy nestgenoten (2 mannetjes, 3 vrouwtjes) die stierven aan neurologische ziekte (isolaten 1-5, Nest 1). Isolate 6 is afgeleid van de hersenen van een 10 weken oude mannelijke Maltese terriër die 1 van de 4 nestgenoten (Nest 2) was die aan neurologische ziekte stierf. Isolate 7 is afgeleid van de hersenen van een 10 weken oude vrouwelijke miniatuur poedel puppy (Nest 3) die stierf aan neurologische ziekte. Isolaat 8 werd afgeleid van de nier van een 18 maanden oude vrouwelijke miniatuur teckel die stierf aan nierfalen (tabel 1).

bij postmortem werden weefsels aseptisch verzameld en gehomogeniseerd (Ten Broeck tissue homogenizer; Corning, Corning, NY) met behulp van PBS, pH 7.2, plus 2 × antibioticum-antimycotische oplossing (Gibco, Gaithersburg, MD). Microsporidiale sporen werden gezuiverd uit host weefselhomogenaat met behulp van een eerder beschreven Percoll-dichtheidsgradiëntmethode gewijzigd door centrifugatiesnelheid te veranderen naar 600 g . De microsporidia werden gekweekt in Rk-13 cellen (ATCC CCL-37) met behulp van RPMI 1640 medium aangevuld met 5% foetaal runderserum en 2× antibioticum-antimycotische oplossing (Gibco) zoals eerder beschreven . Parasietkweek en DNA-analyse werden gedaan gedurende enkele maanden op basis van de ontvangst van de verschillende case samples, zodat de mogelijkheid van toevallige kruisbesmetting verwaarloosbaar was.

DNA-isolatie

voor isolaten 1-6 en 8 werden parasieten gekweekt in een korte kweek om voldoende sporen te genereren voor moleculaire karakterisatie. Voor isolaat 7, werden parasieten direct gezuiverd uit vers puppy hersenweefsel voor DNA-isolatie. Voor de meeste isolaten werd het DNA geëxtraheerd uit gezuiverde sporen met behulp van Instagene Matrix (BioRad, Hercules, CA), volgens het Protocol van de fabrikant voor bacterieculturen . Voor een deel van het moleculaire werk met isolaten 6 en 8, werden sporen verwerkt zoals eerder beschreven , en DNA werd geëxtraheerd uit sporen door een standaard fenolchloroform extractiemethode met behulp van een partitionering gel microfugebuis systeem (light phase Lock Gel system; 5 Prime→3 Prime Manufacturer, Westchester, PA) om DNA herstel te optimaliseren. Het DNA werd neergeslagen met ethanol, de pellet werd geresuspendeerd in TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6) en de DNA-concentratie werd geschat met behulp van A260 : A280 ratio ‘ s met behulp van UV-spectrofotometrie (Ultraspec Plus; Pharmacia, Piscataway, NJ). DNA geëxtraheerd uit weefselkweek-afgeleide sporen van Encefalitozoon hellem werd gebruikt als een positieve controle, en een reagens-only negatieve controle werd opgenomen in alle extractie en sequencing reacties.

DNA partiële sequencing en analyse van de kleine subeenheid ribosomaal DNA (SSU rRNA) gen

een deel van het 5 ‘ – uiteinde van het SSU rRNA-gen uit elk van de 8 isolaten werd versterkt met primerparen PMP1 en PMP2, zoals eerder beschreven . De polymerasekettingreactie (PCR) voor elk isolaat werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant (GeneAmp PCR core reagentia, N808-0009; Perkin-Elmer Cetus/Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). De versterking werd gedaan in een thermische cycler (PTC-200 Peltier; MJ Research, Watertown, MA). Na een initiële denaturatie gedurende 5 min bij 95°C werd aan elke 25-µL reactie Taq-polymerase (0,5 U) toegevoegd. De monsters ondergingen vervolgens 35 denaturatiecycli (94 ° C, 30 s), gloeien (60°C, 30 s) en uitrekken (72°C, 1 min), gevolgd door 10 min bij 72°C voor de definitieve uitzetting. Unincorporated nucleotiden werden verwijderd met behulp van chromatografiekolommen (Micro Bio-Spin 30; BioRad). De monsters werden gehouden bij 4°C tot verwerkt voor geautomatiseerde sequencing.

DNA-analyse van het ITS-gebied

een deel van het its-gebied van het ribosomaal RNA-gen van elk isolaat werd door PCR versterkt met het int530f-en int580r-primerpaar , waarbij gebruik werd gemaakt van de hierboven beschreven amplificatiemethoden. Het resulterende PCR product werd gesequenced in een geautomatiseerde DNA sequencer (model 377; Perkin-Elmer Applied Biosystems/Roche Molecular Systems, Branchburg).

DNA geautomatiseerde sequencing

PCR-versterkt DNA van elk isolaat werd versterkt voor geautomatiseerde sequentie met een commerciële kit (ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready-Reaction Kit; Promega, Madison, WI) volgens de instructies van de fabrikant. Alle reacties werden uitgevoerd in een thermocycler (MJ Research Minicycler). De monsters ondergingen vervolgens 35 denaturatiecycli (94 ° C, 30 s), gloeien (60°C, 30 s) en uitrekken (72°C, 1 min), gevolgd door 10 min bij 72°C voor de definitieve uitzetting. Extensieproducten werden gezuiverd met behulp van chromatografiekolommen (Micro Bio-Spin; BioRad), gedroogd in een vacuümcentrifuge (Savant Instruments, Holbrook, NY), en opgeslagen bij -20°C tot sequencing in een geautomatiseerde sequencer (Perkin-Elmer 377 ABI Applied Biosystems).

met behulp van uitlijningssoftware (Sequencher; Gencodes, Ann Arbor, MI) werden consensussequenties van ∼265 basen verkregen voor een deel van het SSU rRNA-gen voor elk parasietisolaat. Deze sequenties werden geëvalueerd voor homologie tegen eerder gerapporteerde Encefalitozonsequenties in de NCBI GenBank database met behulp van een eenvoudige BLASTN zoekopdracht.

Double-stranded DNA heteroduplex mobility assay

DNA van isolaat 6 werd versterkt door PCR met het primerpaar int530f en int580r zoals eerder beschreven . De PCR-versterkte producten werden geanalyseerd voor de generatie van heteroduplexen en homoduplexen met behulp van eerder gekarakteriseerde isolaten van E. cuniculi uit verschillende gastheren.

resultaten

in weefselkweek werden in totaal 8 parasietisolaten van 4 afzonderlijke klinische uitbraken vastgesteld. Zowel licht microscopische kenmerken en in vitro groeikenmerken van de parasieten suggereren dat ze E. cuniculi, een microsporidiaan eerder gemeld bij honden en andere gastheren. De gedeeltelijke rangschikking van het 5′ eind van het SSU rRNA–gen van elk isolaat (GenBank AF144246-AF144253) bevestigde de identiteit van de parasieten als E. cuniculi, aangezien alle specimens 100% homologie met eerder gepubliceerde sequenties vertoonden (GenBank L39107dEZORGOA, L17072¦EZORGSMALL; X98470¦ECDSSRR2).

Heteroduplex analyse en sequencing van het ITS-gebied van het ribosomale RNA-gen karakteriseerde verder alle hond-isolaten als stam III, waarmee eerdere meldingen van subtiele variaties tussen E. cuniculi-isolaten van verschillende knaagdieren, konijnen en menselijke gastheren werden bevestigd. Figuur 1 illustreert de vorming van DNA homoduplex tussen canine isolaat 6 en een eerder gekarakteriseerd stam III isolaat, evenals de vorming van heteroduplex tussen isolaat 6 en de andere E. cuniculi stammen.

discussie

de biologische significantie van meerdere stammen van E. cuniculi moet nog worden opgehelderd; het vermogen om een onderscheid te maken tussen parasietstammen kan echter een hulpmiddel zijn voor het opsporen van infectiebronnen in epidemiologische studies. Onze moleculaire gegevens die 8 microsporidiaanse isolaten van honden identificeren als E. cuniculi stam III komen overeen met een eerdere studie Die 2 hondenisolaten classificeerde als stam III . Isolaten van konijnen, muizen en vossen zijn gemeld als stammen I of II . Deze gegevens suggereren dat Stam III mogelijk voornamelijk geassocieerd is met honden. Menselijke isolaten zijn geïdentificeerd als stam III op het westelijk halfrond en als stam I in Europa . Hoewel de bron(nen) van menselijke blootstelling aan E. cuniculi is onbekend, Er is steeds meer bewijs dat dieren kunnen dienen als reservoirs van infectie, en er is een mogelijkheid van zoönotische overdracht van het organisme tussen dieren en mensen. Het is een interessante mogelijkheid dat geografische en culturele verschillen in huisdiereigendom een rol kunnen spelen bij de blootstelling van de mens, aangezien honden in de Verenigde Staten gewone huisdieren zijn, terwijl konijnen vaak als huisdier of als voedsel worden gehouden in Zwitserland en andere Europese landen.

onderzoek van fecale en urinemonsters van de klinisch normale ouders van Boston Terriër en 1 pup uit Nest 1 toonde lage niveaus van sporenuitscheiding gedurende ⩾4 maanden na het overlijden van de nesten (isolaten 1-5; niet-gepubliceerde gegevens). Deze observatie suggereert verder een mogelijk mechanisme voor directe of indirecte overdracht van de parasieten van honden op mensen door de besmetting van gelokaliseerde omgevingen met hond urine en fecale uitwerpselen. Hoewel geen epidemiologisch onderzoek de relatie tussen eigendom/blootstelling aan gezelschapsdieren en humane microsporidiale infecties heeft geëvalueerd, was in één geval waarin kinderen werden blootgesteld aan puppies met uitgesproken encefalitozoonose bij 1 van de 3 kinderen seroconverteerd . Extra E. cuniculi-isolaten van verschillende gastheren moeten worden geanalyseerd om het risico van het behoud van mogelijk geïnfecteerde huisdieren in de huishoudens van immunogecompromitteerde personen met een hoog risico op microsporidiale infecties verder te evalueren.We danken de pathologen Jay Hoffman, Joanne Mansell en Bruce Abbitt voor het leveren van hondenweefsels voor deze studie.