experimenteel en therapeutisch geneesmiddel

Inleiding

bronchiaal astma is een chronische inflammatoire luchtwegziekte waarbij veel inflammatoire cellen en mediatoren betrokken zijn. T cellen, in het bijzonder T helper (Th)1 en Th2. hebben een cruciale rol in deinductie van luchtwegontsteking bij astmatische patiënten (1). Gecompliceerde immuunresponsen kunnen leiden tot th1-deficiëntie en th2-hyperactiviteit, wat resulteert in een th1 / Th2-onbalans. Deze onbalans bevordert immunoglobuline (Ig)Esecretie en sensibiliseert mastocyt en eosinofielen via gewijzigde fytosecretie en veroorzaakt allergische ontsteking enhyper-responsiviteit van de luchtweg (2,3).Interferon (IFN)-γ en interleukine (IL)-4 zijn typische cytokines van respectievelijk 1 en Th2.

bij astmapatiënten wordt persisterende luchtweginflammatie geïnitieerd door antigeen presenterende cellen (APC), die verschillende allergenen integreren in een signaal voor T-cellen en de daaropvolgende immuunresponsen op gang brengen (4,5).De activering van T-cellen vereist signalen die via thetcr complex en cluster van differentiatie (CD)28 worden geïnitieerd. De volwassen dendritische cellen (MDC ‘ s) drukken hoge niveaus van co-stimulatory moleculesCD80 en CD86 uit, die het signaal verstrekken dat Voor triggering t-celactivering, uitbreiding en differentiatie viainteraction met CD28 (6) wordt vereist. Eerdere studies hebben aangetoond dat CD80-en CD86-spiegels verhoogd zijn bij patiënten met astma (7,8).

in eerdere studies waarin astmatische modellen werden onderzocht, is aangetoond dat MDC ‘ s Th2 polarisatie induceren, IL-4secretie opreguleren, IFN-γ productie verlagen en eosinofiele ontsteking induceren (9,10). Nochtans, ontbreken de studies die de gevolgen van het neerhalen van CD80 en CD86 in DCs op dedifferentiatie van en cytokinesecretie door de hulpcellen van t in urinemodellen van astma onderzoeken.

in deze studie werden co-stimulatorische t-celactivatiesignalen geblokkeerd door de onderdrukking van CD80 en CD86molecule expressie op DCs met behulp van small interferentie RNA (siRNA), en de effecten van cd80 en CD86 knockdown op de expressieniveaus van de th1/Th2 typische cytokines IFN-γ en IL-4 werden geëvalueerd. Aldus, werd het potentieel van CD80 en CD86 als doelstellingen voor de toepassing van RNA interferentie (RNAi) in het therapeutische richten van astma onderzocht.

materialen en methoden

Dieren

in totaal 20 gezonde, specifiek pathogeenvrije gradeBALB/c-muizen (6-8 weken); gemiddeld gewicht, 18±2 g) werden gekocht van het centrum van proefdieren van Sun Yat-Sen University(Guangzhou, China). Experimenten werden uitgevoerd volgens toprotocols goedgekeurd door het Animal Studies Committee van Sun Yat-SenUniversity.

Astmamodellen

een totaal van 20 muizen werden willekeurig toegewezen aan twee groepen: i) de astmatische groep, en ii) de normale controle group.In de astmatische Groep, elke Muis werd gevoelig voor ovalbumine (OVA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) intraperitoneaal op dagen1, 14 en 21 met 100 µg OVA die werd geëmulgeerd in 20 mg aluin (Guangzhou Chemical reagens Co., Guangzhou, China). Vervolgens werden de muizen op dagen 28-34 blootgesteld aan een aerosoluitstoot van 5% eicellen gedurende 30 minuten/dag in luchtdichte recipiënten (met afmetingen van 50×50×50 cm). In de normale controlegroep werden muizen gesensibiliseerd en op dezelfde wijze uitgedaagd met een gelijkwaardige hoeveelheid zoutoplossing in plaats van de OVA-eiwitoplossing. 24 uur na de laatste uitdaging werden muizen gedood door een goedgekeurde cervicale dislocatieprocedure, uitgevoerd door bekwaam en volledig opgeleid personeel. De monsters werden gedehydrateerd, ingebed in paraffine en gekleurd methematoxyline en eosine, zoals eerder beschreven (11). Pathologische veranderingen in bronchiale en longweefsels werden beoordeeld onder een Nikon Eclipse ti lightmicroscoop (Nikon Corporation, Tokyo, Japan).

scheiding van beenmergderivaten

alle muizen werden gedood door cervicale dislocatie 24 uur na de laatste challenge. Beenmerg werd gespoeld uit thefemurs en tibiae met rpmi-1640 kweekmedium (Gibco; ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Na centrifugatie bij 250 × g gedurende 5 min, werden cellen behandeld met redblood cell (RBC) lysis buffer (CWBio Co., Ltd., Beijing, China), gewassen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), gecentrifugeerd bij 250 × gfor 5 min en gekweekt in RPMI-1640 aangevuld met recombinantmouse granulocyt macrofaag kolonie-stimulerende factor (rmGM-CSF; Peprotech, Inc., Rocky Hill, NJ, USA; 10 ng / ml), en rmIL-4(Peprotech; 10 ng/ml) werden op hun beurt gebruikt. Na 6 dagen cultuur, 1µg / ml lipopolysaccharide (Lps; Sigma-Aldrich) werd toegevoegd, en de niet-aanhangende MDC ‘ s werden geoogst op dag 7. DCs waren gekleurd bij 4°COF 30 min met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerde hamster anti-CD11c (5 µg/ml; 11-0114), phycoerythrin (PE)-geconjugeerde hamster anti-CD80 (5 µg/ml; 12-0801), FITC-geconjugeerde Rat anti-CD86 (5 µg/ml; 11-0862) en PE-geconjugeerde rat anti-majorhistocompatibility complex (MHC) II (5 µg/ml; 12-5322; allebioscience, Inc., San Diego, CA, DE V. S.) monoclonal antilichamen, en werden later geanalyseerd door cytometry stroom (FACSVerse Bd; BDBiosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) om het positieve expressietarief van de geëtiketteerde antigeenuitdrukking te bepalen.

siRNA en transfectie

de specifieke siRNA-sequenties(tabel I) gericht op CD80 en CD86 werden ontworpen en geselecteerd volgens de methoden van Gu et al (12). Alle siRNA werd gekocht van Shanghai GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, China). De transfectiestep werd uitgevoerd volgens het Protocol van de fabrikant forLipofectamine 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.).Kort, werden DCs gekweekt in een 24-goed plaat van de weefselkweek bij adensity van 1 × 105 cellen / goed op de dag voorafgaand aan transfectie. Toprepare lipide-siRNA complexen, 3 µl Lipofectamine 2000 werd geïncubeerd in 50 µl Opti-MEM (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) bij kamertemperatuur gedurende 5 min, en 12 µl van de aangegeven siRNA werd gelijktijdig gecombineerd met 50 µl Opti-MEM. De verdunde lipofectamine 2000 en siRNA werden vervolgens gemengd en gedurende nog eens 20 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd voor complexe vorming.Vervolgens werd het complex geïncubeerd met het DCs in een 24-putplate bij 37°C in een 5% bevochtigde CO2 in luchtatmosfeer gedurende 6 uur. bij cotransfection werd equivalente hoeveelheden cd80 siRNA: Lipofectamine 2000 en CD86 siRNA:Lipofectamine 2000complexen toegevoegd aan elk put. FAM-scrambled-siRNA werd gebruikt als de negatieve controle om de transfectie-efficiëntie te bepalen. Er werden drie groepen van transfecteerde DCs vastgesteld: in de niet-siRNA-groep werd alleen Lipofectamine 2000 toegevoegd, zonder dat er siRNA aan de DCs werd toegevoegd. In de siRNA – groep werden MDC ‘ s overgedragen door CD80-en CD86-specifieke siRNA. In de negativesiRNA-groep, werden MDC ‘ s getransfecteerd door niet-specifieke non-targetingFAM-siRNA, die geen homologie met de gerichte RNAs heeft.Experimenten werden uitgevoerd in drievoud voor elk monster.De transfectieefficiëntie werd bepaald gebruikend fluorescencemicroscopie (Nikon Eclipse Ti, Nikon Corporation) en ontdekte cytometry byflow.

Reverse transcriptie-quantitativepolymerasekettingreactie (RT-qPCR)

om CD80-en CD86 mRNA-expressieniveaus te evalueren na transfectie werd RT-qPCR uitgevoerd. Primer sequenties (tabel II) werden ontworpen volgens GenBank en gesynthetiseerd door DaAn Gene Co., Ltd. van Sun Yat-SenUniversity (Guangzhou, China). Bij 24 uur na de transfectie werd het totaalrna van 1×106 DCs geëxtraheerd met behulp van TRIzol-reagens (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) en reverse transcribed and amplified using QuantiTect SYBR Green RT-PCR kit (Qiagen GmbH, Hilden, Duitsland) in a Roche LightCycler 480 (Roche Diagnostics,Bazel, Zwitserland). De versterkingen werden uitgevoerd volgens het Protocol van de fabrikant voor de hoeveelheid SYBR Green RT-PCRkit (Takala, Japan). De amplificatievoorwaarden waren 40 cycli van93°C gedurende 3 min, 93 ° C gedurende 30 sec, 55 ° C gedurende 45 sec en 72°C gedurende 45sec. elk monster werd aan elk van drie putten toegediend. Relativegene expression levels were calculated using the quantificationcycle (Cq) method with normalization to glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) as the reference gene using 2−∆∆Cq(13).

flowcytometrie

om de positieve expressiesnelheden van CD80 en cd86 op de DCs na transfectie te detecteren, werd de flowcytometrie uitgevoerd op de MHC II / CD11c-poort voor CD80 en CD86. Zes uur na transfectie werden DCs tweemaal gewassen met PBS en geïncubeerd met fluorescently-geëtiketteerd antilichaam bij 4 ° C gedurende 30 min.Vervolgens werden de cellen opnieuw gewassen met PBS en gefixeerd met 10 g/l paraformaldehyde. De volgende anti-muis monoclonalantibodies werden gebruikt: PE-anti-MHC II, FITC-anti-CD11c, PE-anti-CD80 en FITC-anti-CD86, zoals hierboven vermeld. Alle flowcytometrische analyses werden uitgevoerd met IgG isotypische controles.

t-celscheiding

milten werden verwijderd nadat de muizen waren geëuthanaseerd door cervicale dislocatie. T-cellen werden gescheiden met behulp van muislymfocytscheidingsmedium volgens het Protocol van de fabrikant (Dakewe Biotech Co., Ltd., China). De celdichtheid werd aangepast aan 1×109/l vóór verdere verwerking.

gemengde lymfocytenreactie(MLR)

de astmatische muriene beenmerg-afgeleide DCs (1×104/put) en gezonde T-cellen (1×105/put) werden gecultiveerd in 96-putplaten met een verhouding van 1:10. De cocultuursystemen werden in drie groepen verdeeld: i) de niet-siRNA-groep, ii) de siRNA-groep, en III) de negatieve siRNA-groep, met DCs uit de hierboven beschreven overeenkomstige groepen. Vervolgens werd aan elk putje eicellen toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 10 mg/l in een totaal volume van 200 µl. De cellen werden gedurende 72 uur geïncubeerd bij 37°C in een 5% bevochtigde CO2-atmosfeer in de lucht.

Enzyme-linked immunosorbent assays (Elisa ‘ s)

na 3 dagen cocultuur werd het supernatant verzameld. IFN-γ en IL-4 niveaus werden geanalyseerd met behulp van ELISA kitsspecifiek voor IFN-γ en IL-4 (Dakewe Biotech Co., Ltd.) volgens de instructies van de fabrikant. De absorptiewaarden werden afgelezen op 450 Nm met behulp van een MULTISKAN MK3 (Thermo Fisher Scientific, Inc.).

statistische analyse

statistische analyses werden uitgevoerd met SPSSsoftware, versie 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). De gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). De onderzoeken werden voor elke muis in drievoud uitgevoerd. Statistische vergelijkingen tussen groepen werden uitgevoerd met behulp van eenrichtingsanalyse van variantie,en vergelijkingen binnen een groep werden uitgevoerd met behulp van Student ‘ SST-test. Verschillen tussen groepen werden statistisch significant geacht wanneer P<0,05.

resultaten

astmatisch model

de 20 gezonde BALB / c-muizen van SPF-graad werden ingedeeld in astmatische en normale controlegroepen, met elk 10 muizen. Allmice werd uiteindelijk geëvalueerd zonder experimenteel dierverlies. Volgens de longweefsel pathologie, longsectiesvan de eicellen-geïmmuniseerde muizen vertoonden duidelijke luchtwegontsteking metperibronchiolaire en perivasculaire infiltraten. Deze infiltraten bestonden voornamelijk uit eosinofielen en lymfocyten, ensecties vertoonden bronchiale mucosa en gladde spierverdikking,verhoogde slijmsecretie, epitheliale celuitscheiding in de luchtwegen, luchtwaystenose en ontstekingscellen verspreid in het lunginterstitium. In de normale controlegroep werden geen significante pathologische veranderingen waargenomen. Representativehistopathologische gegevens zijn weergegeven in Fig.1.

cell surface molecule expression byymdc ‘ s

De expressieniveaus van CD11c, CD80 en CD86 op de DC-oppervlakken werden gedetecteerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering(FACS). MDC ‘ s uit de astmatische groep gaven CD11c uit op een niveau dat vergelijkbaar is met dat in de normale controlegroep; er werd geen significant verschil gevonden tussen de twee groepen (P>0,05). In vergelijking met de normale controlegroep vertoonden de astmatische groepen echter significant hogere CD80-en CD86-expressieniveaus (P<0,05; Fig. 2).

transfectie van MDC ‘s

De cd80 – en CD86-specifieke siRNA-constructies werden met succes overgedragen naar de MDC’ s. De transfected MDC ‘ s werden waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop 6 h na transfectie.De transfectie efficiëntie van siRNA gedetecteerd door FACS was ~75%(Fig. 3).

mRNA en eiwitexpressie van Cd80 en CD86 door MDC ’s na transfectie

de mRNA-en eiwitexpressieniveaus van CD80 en cd86 in de transfected MDC’ s werden gedetecteerd door RT-qPCR en Facsanalyse bij respectievelijk 24 en 72 uur na transfectie. De CD80and CD86-mRNA expressie niveaus gedetecteerd door de RT-qPCR aangegeven thatCD80 mRNA expressie niveaus in de niet-siRNA, siRNA en negativesiRNA groepen waren 2.09±0.46, 0.60±0.17, en 2.04±0.93,respectievelijk, en de CD86-mRNA expressie niveau 3.58±0.20,0.91±0.48, en 2.83±0.83, respectievelijk. De gegevens die door FACSindicated dat het CD80-eiwit positieve uitdrukking tarieven in thenon-siRNA, siRNA en negatieve siRNA groepen waren 82.45±15.80,30.79±7,07 en 81.83±10.07%, respectievelijk, en de CD86 proteinpositive expressie tarieven waren 89.45±10.22, 27.29±6.99, and87.66±11.74%, respectievelijk. Het mRNA-expressieniveau en de proteïnpositieve expressietarieven vertoonden vergelijkbare resultaten. Er was geen significante significantie tussen de niet-siRNA-groep en de negatieve siRNA-groep (P>0,05). CD80 – en CD86-expressie op de RNA-en eiwitniveaus in de siRNA-groep nam significant af in vergelijking met die in de niet-siRNA-en negatieve siRNA-groepen (P<0,05; Fig. 4 en 5). Dit toont aan dat siRNA-doelinterference CD80 en CD86 mRNA en proteïne expressieniveaus beduidend kan onderdrukken.

IFN-γ en IL-4 secretie door T-cellengekweekt met MDC ‘ s

na 72 uur cocultuur werden IFN-γ en IL-4 niveaus in het supernatant van het MDC-en T-celcocultuursysteem gedetecteerd met ELISA. IFN-γ uitdrukking was significant toegenomen in de siRNA groep (132.73±25.04 pg/ml) in vergelijking met thenon-siRNA en negatieve siRNA groepen (72.56±26.30 en 80.21±24.42 pg/ml, respectievelijk; P<0.05), terwijl er geen significante differenceswere geconstateerd tussen de niet-siRNA en negatieve siRNA groepen(P>0.05). IL-4 expressie niveaus waren significant verminderd in de siRNA groep (93.04±23.13 pg/ml) in vergelijking met de niet-siRNAand negatieve siRNA groepen (150.69±29.50 en 163.19±25.36 pg/ml,respectievelijk; P<0.05), terwijl er geen significante verschillen weredetected tussen de niet-siRNA en negatieve siRNA groepen(P>0.05; Fig. 6).

discussie

bronchiaal astma is een chronische inflammatoire luchtwegziekte waarbij verschillende ontstekingscellen betrokken zijn, waaronder mastcellen, eosinofielen, lymfocyten en andere celcomponenten (14-17).De onbalans van Th1/Th2 is een belangrijke factor die bijdraagt aan de ernst van astma(18). APC ‘s,waaronder DC’ s, macrofagen en B-cellen (19), spelen een cruciale rol bij de stimulatie van T-cellen (3). Onder die, is DC de machtigste APC,die tot primaire en secundaire immune reacties, met inbegrip van allergische immuniteit bijdraagt. Rijpe DCs (mDCs) met hoge niveaus van expressie van de co-stimulatory molecules CD80 en CD86 kunnen T cellen activeren, terwijl onrijpe dendritische cellen (iDCs) met een laag niveau van expressie van CD80 en CD86 de T-celrespons onderdrukken en immune tolerantie veroorzaken (20,21). DCsin – patiënten met astma bleken hyperactief te zijn(22).

CD80 en CD86 zijn twee soorten eiwitten die worden uitgedrukt op het APC-oppervlak en die gelijktijdig werken om co-stimulatorische signalen te leveren die nodig zijn voor t-celactivering en overleving. Eerdere studies hebben aangetoond dat de expressieniveaus van de co-stimulerende moleculen CD80 en CD86 op het MDC-oppervlak nauw samenhangen met Th2-celreactie en luchtwegontsteking(23,24). Bij astmatische patiënten kunnen MDC ‘ s die cd80 en CD86 hoog uitdrukken,naïeve CD4+helper T-celactivering stimuleren om te differentiëren naar Th2 cellen, wat resulteert in een th1/Th2 onbalans. Daarna veroorzaakt de onvoldoende afscheiding van th1 cytokines zoals IFN-γ, samen met de verhoogde afscheiding van Th2 cytokines zoals IL-4 en IL-5, seosinofiele ontsteking en allergische luchtwegontsteking(10,24,25). Tweedosignalen zijn vereist voor de bevordering van th2-cel activering(26-28). Het eerste signaal is de vorming vanantigen-MHC-complexen op het mDC-oppervlak die zich specifiek binden met het T-celreceptor-CD3-receptorcomplex op t-celoppervlakken,en het tweede signaal is co-stimulerende molecuulexpressie en functionele activering op de MDC-oppervlakken die zich specifiek binden aan receptoren op naïeve T-cellen; de twee signalen vormen een co-stimulatorypathway (29). Er is ook gesuggereerd dat er een derde signaal (30) is, aangezien bepaalde cellulaire moleculen die door DCs worden geproduceerd, zoals thymische stromale lymphopoietin (TSLP), de richting van th-celdifferentiatie beïnvloeden. Van alle bovengenoemde signalen is de cd80/CD86-CD28 co-stimulatorieweg echter de meest klassieke en belangrijke. Eerder onderzoek heeft uitgewezen dat de CD80 / CD86-CD28 co-stimulatorieroute een effectief doel voor astmabehandeling kan zijn door aan te tonen dat het blokkeren van de cd80/CD86 co-stimulatorieroute door monoklonale antilichaambenaderingen ontstekingen kan remmen bij astmatische muizen (25). Bovendien kan het onderdrukken van de CD80 / CD86co-stimulatory route met behulp van antisense oligonucleotiden luchtweghyperactiviteit onderdrukken (31).

RNAi is een gen-tot zwijgen brengend fenomeen waarbij endogene of exogene specifieke dubbelstrengs RNA ’s de afbraak van homologe mRNA’ s teweegbrengen en het verlies van overeenkomstige functionele fenotypen veroorzaken. Aangezien de techniek in 1998 voor het eerst werd ontdekt door Fire et al (32), is de techniek verder ontwikkeld om een hoge mate van specificiteit en efficiëntie te bereiken. De therapeutische toepassing van Rnaitechnologie is een onderwerp dat in de afgelopen jaren een hoge mate van interesse in fundamenteel medisch en klinisch onderzoek heeft aangetrokken.De capaciteit van RNAi om virulente genuitdrukking te remmen is wijd gebruikt om een verscheidenheid van ziekten (33-35) te behandelen.Ook, hebben een aantal studies gemeld dat RNAi inDCs kan worden gebruikt om bronchiaal astma (36-39) te diagnosticeren en te behandelen.Darcan-Nicolaisen et al (40) ontdekten dat de twee belangrijkste tekenen van allergisch astma in het door theOVA geïnduceerde astmamuismodel, namelijk luchtwegontsteking en hyperactiviteit, aanzienlijk werden verbeterd door signaaltransducer en activator van transcriptie 6 (STAT6) het tot zwijgen brengen in luchtwakepitheliale cellen met behulp van de toediening van siRNA neusdruppels.Moriwaki et al(41)toonden aan dat siRNA-gemedieerde suppressor van cytokine signaling 3 (SOCS3) gen silencing de luchtwegreactiviteit eneosinofiele infiltratie kon onderdrukken die werd geïnduceerd door allergene stimulatie bij astmatische muizen. Zheng et al (42) vonden dat de toepassing van siRNA was geschikt om tyrosine eiwitkinase (TPK) genexpressie inhet DCs van astmatische muizen te remmen, het onderdrukken van het functionele vermogen van DCS als antigeen-presenterende cellen, waardoor het remmen van t-celactivatie en differentiatie. Echter, studies betreffende de effecten van siRNA-gemedieerde CD80 en CD86 knockdown in DCs op t-celldifferentiatie in astmatische muizen ontbreken. In de huidige studie, werden CD80 en CD86 mRNA en eiwituitdrukking in muriene beendermarrow-afgeleide DCs met succes verminderd met CD80-en cd86-richtend siRNA, die de efficiency van RNAi verifieerde.

in dit onderzoek werd een astmatisch muismodel gebruikt dat werd vastgesteld volgens eerder gerapporteerde methoden (43). Uit de resultaten bleek dat de MDC ‘ s van de astmatische groep verhoogde Cd80-en CD86-expressieniveaus vertoonden, hetgeen impliceert dat de CD80/Cd86-capaciteit bij astmatische patiënten verhoogd kan zijn. Na de overdracht van de MDC ‘ s met CD80 – en CD86-gerichte siRNA, werden de RNA-expressieniveaus en eiwitpositieve expressiepercentages van cd80 en CD86 significant verlaagd, hetgeen het remmende effect bevestigde dat de siRNA-benadering had op de co-stimulatormoleculen CD80 en CD86 op het transcriptionele en translatieniveau. In het supernatant van de co-cultuur van MDC ’s en T-cellen,veroorzaakte RNAi een verhoging van IFN-γ uitdrukking en een vermindering Vanil-4 niveaus, die erop wijzen dat het verminderen van de expressie van de co-stimulatory molecules CD80 en CD86 in MDC’ s de co-stimulatory weg van de cd80/CD86-CD28 bij astmatische muizen verzwakte. RNAi beïnvloedde ook de expressie van th1/Th2 cytokines, wat erop wijst dat de oorspronkelijke th1 / Th2 onbalans werd veranderd en, bijgevolg, immunetolerance werd geïnduceerd. Deze bevindingen wijzen erop dat CD80 en Cd86 potentiële doelstellingen voor RNAi-toepassing in astmabehandeling kunnen zijn, en een nieuwe weg voor de gentherapie van astma verstrekken.

erkenningen

deze studie werd ondersteund door een open Projectenbeurzen van het State Key Laboratory of Respiratory Disease (Guangzhou,China) (subsidienr. 2007DA80154F1107).

	Locksley RM: astma en allergieontsteking. Cel. 140:777–783. 2010. Bekijk Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Holgate ST: aangeboren en adaptieve immuneresponses bij astma. Nat Med. 18:673–683. 2012. Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Larché M, Robinson DS and Kay AB: The roleof t lymfocytes in the pathogenesis of asthma. J Allergie ClinImmunol. 111:450–464. 2003. Bekijk Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lambrecht BN en Hammad H: the role ofdendritic and epithelial cells as master regulators of allergicairway inflammation. Lancet. 376:835–843. 2010. Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Holt PG and Upham JW: The role ofdendritic cells in asthma. Curr Opin Allergie Clin Immunol. 4:39–44.2004. Bekijk Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lim TS, Goh JK, Mortellaro a, Lim CT,Hämmerling GJ en Ricciardi-Castagnoli P: CD80 en Cd86 regelen de mechanische interacties van T-cellen met antigen-presenterende dendritische cellen en B-cellen. PLoS ÉÉN.7:. Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Wong CK, Lun SW, Ko FW, Ip WK, Hui DS andLam CW: Verhoogde expressie van plasma-en celoppervlakteco-stimulerende moleculen CTLA-4, CD28 en CD86 bij volwassen patiënten met allergisch astma. Clin Exp Immunol. 141:122–129. 2005.Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Shi HZ, Xie ZF, Deng JM, Chen YQ en XiaoCQ: oplosbaar CD86-eiwit in serummonsters van patiënten met astma.Thorax. 59:870–875. 2004. Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Van Rijt LS and Lambrecht BN: Dendritische cellen bij astma: een functie voorbij Sensibilisatie. Clin Exp Allergie.35:1125–34. 2005. Bekijk artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	van Rijt LS, Vos N, Willart M, Kleinjan A,Coyle AJ, Hoogsteden HC and Lambrecht BN: Essential role ofdendritic cell CD80/CD86 costimulation in the induction, but notreactivatie, van th2 effector responses in een muismodel van astma.J Allergie Clin Immunol. 114:166–173. 2004. Bekijk Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wu SG, Wang GL, Li LY en Ji J: effecten van microRNA-21 op de interleukine 12 / signaaltransducer en activator van transcriptie 4 signaalweg bij astmatische muizen. Cent Eur JImmunol. 39:40–45. 2014. Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	gu X, Xiang J, Yao Y en Chen Z: effecten van RNA interferentie op CD80 en CD86 expressie in botmarrow-afgeleide murine dendritische cellen. Scand J Immunol. 64:588–594.2006. Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Livak KJ and Schmittgen TD: Analysis ofrelative gen expression data using real-time quantitative PCR Andhe 2 – ∆∆Ct method. Methode. 25:402–408. 2001. Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Fanta CH: astma. N Engl J Med.360:1002–1014. 2009. Bekijk Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lambrecht BN en Hammad H: Lung dendriticcells in respiratory viral infection and asthma: From protection toimmunopathology. Annu Rev Immunol. 30:243–270. 2012. Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Wenzel SE: astma fenotypes: Theevolution from clinical to molecular approaches. Nat Med.18:716–725. 2012. Bekijk Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Hansel tt, Johnston SL en Openshaw PJ:microben en mucosale immuunresponsen bij astma. Lancet.381:861–873. 2013. Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Compalati E, Braido F and Canonica GW: Anupdate on allergeen immunotherapy and asthma. Curr Opin Pulm Med.20:109–117. 2014. Bekijk Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Goyvaerts C, Dingemans J, De Groeve K,Heirman C, van Gulck E, Vanham G, De Baetelier P, Thielemans K,Raes G en Breckpot K: Targeting of human antigeen-presenting cellsets. J Virol. 87:11304–11308. 2013. Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Reise Sousa C: dendritische cellen in a matureage. Nat Rev Immunol. 6:476–483. 2006. Bekijk Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Gill MA: de rol van dendritische cellen inasthma. J Allergie Clin Immunol. 129:889–901. 2012. Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Shi JH, LI YG and LI TS: The roles ofdendritic cells in antigen presentation and the pathogenesis ofasthma. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 28:22–27. 2005.(Inchinees). PubMed/NCBI
	Wong CK, Lun SW, Ko FW, Ip WK, Hui DS andLam CW: verhoogde expressie van plasma-en celoppervlakteco-stimulerende moleculen CTLA-4, CD28 en CD86 bij volwassen patiënten met allergisch astma. Clin Exp Immunol. 141:122–129. 2005.Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Bellou A and Finn PW: Costimulation:Critical pathways in the immunologic regulation of asthma. Currallergy Astma Rapport 5: 149-154. 2005. Bekijk Het Artikel : Google Scholar: PubMed/NCBI
	Chen YQ en Shi HZ: CD28/CTLA-4-CD80 / Cd86en ICOS-B7RP-1 costimulatory pathway in bronchial asthma. Allergie.61:15–26. 2006. Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Bieber T, Novak N, Herrmann N and Koch S:rol van dendritische cellen in atopische dermatitis: een update. Clin RevAllergy Immunol. 41:254–258. 2011. Bekijk Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Hespel C en Moser M: Rol van inflammatoire endritische cellen in aangeboren en adaptieve immuniteit. EUR J Immunol.42:2535–2543. 2012. Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Novak n: een update over de rol van humandendritische cellen bij patiënten met atopische dermatitis. J Allergie ClinImmunol. 129:879–886. 2012. Bekijk Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lombardi V, Singh AK en Akbari O: Therole van costimulerende moleculen bij allergische aandoeningen en astma. IntArch Allergie Immunol. 151:179–189. 2010. Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Zhang Y, Zhou X en Zhou B: DC-derivedTSLP bevordert th2 polarisatie in lps-geprimed allergische luchtweginflammatie. EUR J Immunol. 42:1735–1743. 2012. Bekijk Artikel: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Crosby JR, Guha M, Tung D, Miller DA,Bender B, Condon TP, York-DeFalco C, Geary RS, Monia BP, Karras JGand Gregory SA: geïnhaleerde CD86 antisense oligonucleotide suppressespulmonaire inflammatie en hyperreactiviteit van de luchtwegen bij allergicmice. J Pharmacol Exp Ther. 321:938–946. 2007. Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Fire A, Xu s, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE and Mello CC: Krachtige en specifieke genetische interferentie door dubbelstrengs RNA in Caenorhabditis elegans. Natuur.391:806–811. 1998. ViewArticle: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Ghafouri-Fard s: siRNA en cancerimmunotherapy. Immunotherapie. 4:907–917. 2012. Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Gavrilov K and Saltzman WM: TherapeuticsiRNA: Principles, challenges and strategies. Yale J Biol Med.85:187–200. 2012.PubMed/NCBI
	Yan WJ, Xu SJ, Xie MM en Wu BL: effecten van exogeen cyclisch dimerisch guanosinemonofosfaat op de geneexpressie van Streptococcus mutans. Zhongguo Zu Zhi GongCheng Yan Jiu. 16:1451–1454. 2012.(In Het Chinees).
	Lee CC, Huang HY en Chiang BL:Lentiviraal-gemedieerd interleukine-4 en interleukine-13 Rnainterferentie vermindert luchtwegontsteking en hyperreactiviteit.Hum Gene Ther. 22:577–686. 2011. Bekijk Het Artikel : Google Scholar: PubMed/NCBI
	Li Y, Sun M, Cheng H, Li s, Liu L, Qiao H,Hua s en Lu J: Silencing IL-23 expression by a small hairpin RNAprotects against asthma in mice. Exp Mol Med. 43:197–204. 2011.Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Woska JJ and Gillespie ME:Small-interfering RNA-mediated identification and regulation of theternary SNARE complex mediating RBL-2H3 mastcell degranulation.Scand J Immunol. 73:8–17. 2011. Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Lu XX, McCoy KS, Xu JL, Hu WK en Chen HB:Small interfering RNA targeting T-cell IG mucine-3 decreasesallergic airway inflammation and hyperreactiviteit. Ontsteking.36:582–591. 2013. Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Darcan-Nicolaisen Y, Meinicke H, Fels G,Hegend O, Haberland a, Kühl a, Loddenkemper C, Witzenrath M, KubeS, Henke W and Hamelmann E: Klein interfererend RNA tegen transscriptiefactor STAT6 remt allergische luchtwegontstekingen en hyperreactiviteit bij muizen. J Immunol. 182:7501–7508. 2009.Bekijk artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Moriwaki A, Inoue H, Nakano T, MatsunagaY, Matsuno Y, Matsumoto T, Fukuyama S, Kan-O K, Matsumoto K,Tsuda-Eguchi M, et al: T cel behandeling met kleine interfererende RNAFOR suppressor van cytokine signalering 3 moduleert allergische luchtwakresponsen in een muriene model van astma. Am J Respir Cell Mol Biol.44:448–455. 2011. Bekijk artikel: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Zheng YH, Lu JJ, Guo ZL, Ren T and LiangYJ: Small interfering RNAs specific for milt tyrosine kinaseinhibit maturation of dendritic cells of astmatic mice in vitro.Zhongguo Hu Xi Yu Wei Zhong Jian Hu Za Zhi. 8:487–491. 2009.(Inchinees).
	Li JG, Zhuansun YX, Ran PX, Zhang W, MoXN, Wu H en Li YQ: Effecten van beenmerg mesenchymale stamcellen CD4 + CD25 + regulerende T-cellen en luchtweginflammation in astmatische muizen. Zhongguo Zu Zhi Gong Cheng Yan Jiu.12:9302–9305. 2008.(In Het Chinees).