Fluorescent Labeling

definitie

Fluorescent labeling is het proces van het binden van fluorescent kleurstoffen aan functionele groepen in biomoleculen, zodat ze kunnen worden gevisualiseerd door middel van fluorescentie beeldvorming (nature.com). de beschikbaarheid van nieuwe fluorophores heeft dramatisch de mogelijkheden voor de gevoelige opsporing van biomoleculen en de analyse van hun interactie veranderd. De betere fluorescente kleurstoffen staan nu eerder onmogelijke studies van cellulaire structuren en cellulaire processen toe. De fluorescente etiketten bieden vele voordelen aan, aangezien zij hoogst gevoelig zelfs bij lage concentraties zijn, stabiel over lange periodes van tijd zijn, en zich niet in de functie van de doelmolecules mengen. De gerichte weergave van geëtiketteerde cellen laat het volgen van hen in vitro en in vivo toe. Gebruikend verschillende fluorophores in de zelfde steekproef kan de gelijktijdige observatie van verscheidene molecules tegelijkertijd ook toestaan. De meest gebruikte fluoroforen zijn fluoresceïne isothiocyanaat (FITC), derivaten van rhodamine (TRITC), cumarine en cyanine. Deze synthetische organische kleurstoffen worden gebruikt om biomoleculen als proteã nen, peptides, antilichamen, nucleic zuren, bacteriën of gist te etiketteren. Natuurlijk-het voorkomen fluorochromes, zoals groene fluorescente Proteã ne (GFP), kan ook worden gebruikt om levende cellen genetisch te etiketteren.

• fluorescente eiwitetikettering
  fluorescente etikettering stelt onderzoekers in staat de conformationele dynamica en moleculaire interacties van eiwitten te onderzoeken of hun bewegingen te volgen om hun biologische functies beter te begrijpen (Modesti M, 2011). Om beter inzicht in receptor-ligand-bindende, eiwitstructuren en enzymactiviteit te krijgen, kunnen de enige peptides ook worden geëtiketteerd. Fluorochrome geëtiketteerde antilichamen worden wijd gebruikt in biomedisch onderzoek om antigenen in immunofluorescentieanalyses te ontdekken en zijn ook essentiële hulpmiddelen in immunodiagnostiek. Om betrouwbare resultaten te verzekeren, zou de fluorophore vervoeging zich niet in de antigeen-bindende kenmerken van het antilichaam moeten mengen (Nath n et al, 2016).
• fluorescente etikettering van nucleïnezuren
  fluorescentie-gebaseerde assays spelen een belangrijke rol in biofysische studies van de structuur, functie en dynamiek van nucleïnezuren. De recente vooruitgang in etiketteringsmethodes en weergavesystemen heeft de directe observatie in vivo van DNA en RNA, en van hun interactie met andere celcomponenten toegestaan. De levend-celweergave van nucleic zuren heeft nieuwe wegen voor beter begrip van chromatin organisatie en de verordening van de genuitdrukking geopend. (Dirks RW et al, 2018).
• Fluorescerende etikettering van polysachariden
  complexe polysachariden,zoals heparine, zijn structurele componenten van de extracellulaire matrix. Deze polysachariden zijn essentieel voor cellulaire adhesie, migratie en groei (Prigent-Richard S. et al, 1998). Sommige verbindingen zijn ook bekend om hun antistollingsmiddel, antitrombotische, anti-inflammatoire, antivirale en antiangiogene eigenschappen. Op fluorescentie gebaseerde methoden maken het gemakkelijker om nieuwe bioactieve polysachariden te identificeren en hun biologische functies te karakteriseren (Roger o et al, 2002).
• fluorescente etikettering van lipiden
  cellulaire lipiden spelen een cruciale rol in de cel voor energieopslag, voor de vorming van cellulaire membranen en voor intracellulaire signaalprocessen (Maekawa M. en Fairn G, 2014). Het lipofiele kleurstof nijlrood wordt wijd gebruikt om intracellular lipiden te bevlekken om hun plaats en organisatie te analyseren (Greenspan P et al, 1985). Bovendien, voor het bestuderen van lipidendynamica, is specifieke etikettering in levende cellen ook mogelijk (Schultz C et al, 2010).

fluorescente Etiketteringstechnieken

veelgebruikte fluorescente etiketteringstechnieken maken gebruik van chemische, enzymatische, peptide/eiwit-tag en genetische etiketteringstechnieken (Sahoo H, 2012 , Toseland CP, 2013).

• chemische etiketteringstechnieken: Fluoroforen dok aan de doelmoleculen door chemische modificatie (covalente of niet-covalente binding). De chemische etiketteringsmethodes hebben verscheidene voordelen aangezien zij robuust zijn, gemakkelijk om en zeer efficiënt met een brede waaier van fluorophores uit te voeren. Ze zijn meer geschikt voor in vitro studies dan in vivo.
• enzymatische etiketteringstechnieken: de enzymatische reacties maken snelle, zeer efficiënte en selectieve etikettering in vivo en in vitro mogelijk en kunnen worden gebruikt om proteã nen of hele cellen te richten. Toch wegens de grote grootte van de etiketten, kunnen interferenties met de functie van de doelmoleculen voorkomen.
• peptide / proteïne tag: een recent ontwikkelde, en zeer veelbelovende techniek maakt het mogelijk de specifieke en selectieve etikettering van eiwitten door de integratie van korte fluorescerende tags die het vouwen of de functie van het molecuul niet verstoren. Deze techniek is ook gemakkelijk uit te voeren en kan worden gebruikt om verschillende plaatsen van enige proteã nen afhankelijk van de peptide markeringsspecificiteit te onderzoeken.genetische etikettering: de genetische etikettering kan worden bereikt gebruikend eiwitdomeinen, kleine peptiden of enige aminozuren die met fluorescente kleurstoffen worden gekenmerkt en specifiek aan plaatsen langs chromosomen in vivo kunnen hechten. Deze benadering staat de opsporing van chromosomale abnormaliteiten zoals schrappingen of verdubbeling toe.
• multicolor labeling: Een gemeenschappelijk vereiste voor levende celweergave en voor cytometry stroomtoepassingen is de capaciteit om veelvoudige fluorescently geëtiketteerde proteã nen tegelijkertijd te volgen of te ontdekken. Hiervoor kunnen speciaal ontworpen kleurstoffen met een zeer grote Stokes-verschuiving worden gebruikt, waardoor de gelijktijdige monitoring van verschillende biochemische processen mogelijk is.

op fluorescentie gebaseerde analyses

op fluorescentie gebaseerde analyses baseren zich op de capaciteit van fluoroforen om licht na de blootstelling aan lichte deeltjes of fotonen opnieuw uit te zenden. Het verschil in golflengte tussen excitatie licht en emissie licht, de zogenaamde Stokes shift, kan worden gedetecteerd in microscopen en imaging-systemen. Elke fluorophore heeft een specifieke Stokes verschuiving. De verschillende analyses staan onderzoekers toe om biomoleculen te lokaliseren, om hen in real-time te observeren, om hun interactie te onderzoeken en enzymatische activiteiten te bestuderen.

• fluorescentiemicroscopie
  fluorescentiemicroscopie maakt de identificatie van cellen en cellulaire componenten en de monitoring van celfysiologie met een hoge specificiteit mogelijk. De fluorescentiemicroscopie scheidt uitgezonden licht van opwindingslicht gebruikend optische filters. Het gebruik van twee indicatoren staat ook de gelijktijdige observatie van verschillende biomoleculen tegelijkertijd toe. Terwijl conventionele weergavesystemen een resolutie van 200 tot 300 nm toe te schrijven aan fysieke diffractiegrenzen toestaan, overwinnen de nieuwe super-resolutiefluorescentiemicroscopen zoals STED (gestimuleerde emissieuitputting) deze grenzen en verstrekken inzicht in de nanoschaal wereld van molecules (Sanderson MJ et al, 2014).cytometry
• stroom de cytometry
  Stroom wordt wijd gebruikt in fundamenteel onderzoek en klinische praktijk om het signaal van specifieke fluorophores te meten. De cellen en de deeltjes worden geanalyseerd en uiteindelijk gesorteerd in “real time” aangezien zij door de lichte straal van detectoren overgaan die de fluorescentie kwantificeren door geëtiketteerde antilichamen of ligands wordt geproduceerd. Deze tellers binden aan specifieke molecules op de celoppervlakte of binnen de cel die hun opsporing en kwantificering toestaan. Verschillende parameters als grootte en volume kunnen worden gemeten op enkele cellen, en verschillende celtypes kunnen worden geà soleerd en gekarakteriseerd (Nolan JT en Condello D, 2013). Cytometry de stroom vindt brede toepassingen op gebieden zoals immunologie, hematologie, transplantatiegeneeskunde, oncologie en genetica.
• fluorescentie in situ hybridisatie(FISH)
  fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) maakt het mogelijk specifieke DNA-sequenties op chromosomen te lokaliseren. De fluorescente sondes van DNA of van RNA worden gebruikt om aanvullende opeenvolgingen van doeldna te kruisen en te identificeren. Vis wordt traditioneel gebruikt om genen op chromosomen in kaart te brengen, bijvoorbeeld tijdens het menselijk genoomproject. Vandaag wordt de fluorescentie in situ hybridisatie hoofdzakelijk gebruikt voor kenmerkende doeleinden in de opsporing van chromosomale abnormaliteiten of in de analyse van kankercellen (O ‘ Connor C, 2008).
• fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS)
  fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) maakt de analyse mogelijk van tijdelijke veranderingen in de fluorescentie intensiteit van fluorochromen, die worden veroorzaakt door chemische, biologische of fysische invloeden. FCS werd eerst geà ntroduceerd om interactie tussen drugs en DNA te onderzoeken en vertegenwoordigt nu een gevoelig hulpmiddel voor het bepalen van concentratie en aggregatieniveaus van proteã nen, evenals voor het observeren van moleculaire interactie (Tian Y et al, 2011).
• Microarrays
  Microarrays maken de studie van genexpressie onder verschillende omstandigheden mogelijk. Duizenden genen kunnen tegelijkertijd op DNA-chips worden onderzocht. Dit zijn microscopische dia ‘ s die met uiterst kleine vlekken worden gedrukt die bekende opeenvolgingen van DNA bevatten die selectief aan fluorescent-geëtiketteerde mRNA/cDNA molecules kunnen binden. Na hybridisatie, wordt de DNA-spaander uitgelezen, en de gegevens worden gebruikt om de profielen van de genuitdrukking tot stand te brengen (Hoen PAC et al, 2003).

Fluorescent Label: live-Cell Imaging

de kinetische observatie van cellulaire processen met behulp van time-lapse fluorescentiemicroscopie is een fundamentele techniek in de celbiologie geworden, aangezien live-cell imaging zeer waardevolle inzichten kan bieden in cellulaire groei en transportmechanismen. Een belangrijke uitdaging in de microscopie van de tijd-tijdspanne is het minimaliseren van fototoxische gevolgen als gevolg van het photobleaching. De lichte blootstelling vernietigt geleidelijk fluorescente molecules die tot een vermindering van het fluorescentiesignaal en tot de vorming van vrije radicalen leiden die de cellen kunnen beschadigen. Daarom is het essentieel voor de methode van levend-cel weergave om een evenwicht te vinden tussen het verminderen van lichtBlootstelling zoveel mogelijk en het krijgen van nuttige signalen om de cellen waar te nemen. De wetenschappers moeten ook een fysiologisch milieu tot stand brengen dat toestaat om de dynamica in vivo dicht te herhalen. (Ettinger en Wittmann T, 2014).

PromoCell fluorescente etikettering

de beschikbaarheid van nieuwe fluoroforen heeft de mogelijkheden voor de gevoelige detectie van biomoleculen en de analyse van hun interacties drastisch veranderd. De betere fluorescente kleurstoffen staan nu eerder onmogelijke studies van cellulaire structuren en cellulaire processen toe. PromoCell verstrekt een brede waaier van fluorophores van uitstekende kwaliteit voor fluorescente etikettering van diverse biomoleculen: eiwitetikettering, antilichaametikettering, nucleic zuuretikettering (DNA-etikettering, RNA-etikettering), evenals volledige etiketteringsuitrustingen en gebruiksklare fluorescente conjugaten.

onze PromoFluor kleurstoffen zijn kosteneffectieve alternatieven voor bekende, toonaangevende fluoroforen en overspannen het golflengtespectrum van blauw tot verrood. Zij tonen een opmerkelijke fluorescentieintensiteit en photostability, een sterke lichtabsorptie, hoge fluorescentiekwantumopbrengst en goede wateroplosbaarheid en kunnen voor fluorescentiemicroscopie, fluorescente in situ hybridisatie (FISH), fluorescentie correlatiespectroscopie (FCS) en microarrays (eiwit, DNA) worden gebruikt. Sommigen van hen bieden een extra grote stokesverschuiving aan, die hen ideaal gezien geschikt maakt voor veelkleurige etikettering of cytometry stroomtoepassingen. PromoFluor kleurstoffen zijn beschikbaar, bijv. als NHS-esters, maleïmiden en amino-gemodificeerde labels klaar voor covalente koppeling of als conjugaten met biotine, phalloidin en deoxynucleotiden (dUTPs). Bovendien bieden we ook hoogwaardige proteïne & antilichaam Etiketteringskits met verschillende PromoFluor kleurstoffen.